药学学报

Compound	MTT assay IC₅₀/μmol·L^-1
11a-11j	> 50	> 50
11k	27.6 ± 0.9	32.1 ± 0.4
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19a	14.8 ± 0.8	9.4 ± 0.4
19b	> 50	> 50
22	0.045 ± 0.002	0.051 ± 0.001
Tirbanibulin	0.010 ± 0.001	0.03 ± 0.03

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Tirbanibulin	0.010 ± 0.001	0.03 ± 0.03

微管蛋白及c-Src双靶点抑制剂的合成与抗肿瘤活性评价

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祁献芳 ¹ , 康悦 ² , 齐建国 ²^,^*

药学学报 | 研究论文 2025,60(6): 1778-1790

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药学学报 |研究论文 2025 , 60 (6) : 1778 -1790

微管蛋白及c-Src双靶点抑制剂的合成与抗肿瘤活性评价

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祁献芳¹, 康悦², 齐建国²^,^*

作者信息

¹河南省人民医院药学部, 河南郑州 450003

²河南大学河南省天然药物创新与转化重点实验室, 河南开封 475004

通讯作者:

齐建国，Tel: 15093693863, E-mail: qijianguo@henu.edu.cn

作者简介:

作者贡献:

祁献芳负责实验设计与部分实验实施、结果分析与撰写论文; 康悦负责部分实验、结果分析; 齐建国负责研究思路提出及指导、修订论文。

Synthesis and antitumor activity evaluation of dual-target inhibitors for tubulin and c-Src

Xian-fang QI¹, Yue KANG², Jian-guo QI²^,^*

Affiliations

¹Department of Pharmacy, Henan Provincial People′s Hospital, Zhengzhou 450003, China

²Henan Key Laboratory of Natural Medicine Innovation and Transformation, Henan University, Kaifeng 475004, China

出版时间: 2025-06-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2025-0219

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摘要

收起

微管类药物在转移、耐药的癌症治疗中发挥重要的作用。然而, 临床上出现微管类药物耐药现象, 需要研究者研发具有新作用模式、新机制的分子来克服耐药问题。多靶点药物分子策略是近年来针对复杂性疾病及耐药问题发展起来的一种药物分子设计策略。本文在替巴尼布林基础上, 结合课题组前期研究, 开展微管蛋白(tubulin) 及原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src (proto-oncogene tyrosine protein kinase Src, c-Src) 双靶点抑制剂研究。从增加饱和碳原子比率(fraction of sp³-hybridized carbon atoms, Fsp3) 角度出发, 合成16个目标化合物, 并通过核磁共振氢谱、碳谱和质谱对其结构进行表征; 采用噻唑蓝(MTT) 法评价了化合物对宫颈癌细胞(HeLa) 和肝癌细胞(HepG2) 两种细胞株的生长抑制活性, 并通过免疫荧光和流式细胞术评价化合物22对微管和细胞周期的影响。结果显示2-咪唑啉酮不适合替代替巴尼布林中的吡啶结构, 化合物22对HeLa和HepG2的半数生长抑制浓度分别为45和51 nmol·L^-1, 并且能够破坏微管结构, 将细胞周期阻滞于G2/M期。化合物22可作为先导物开展进一步深入研究。

关键词

2-咪唑啉酮 / 联芳基 / 微管抑制剂 / c-Src / 抗肿瘤

Abstract

收起

Microtubule-targeting drugs play a significant role in the treatment of metastatic and drug-resistant cancers. However, the emergence of resistance to microtubule-targeting drugs in clinical settings necessitates the development of molecules with novel modes of action and mechanisms to overcome drug resistance. The multi-target drug molecule strategy is an approach that has been developed in recent years to address complex diseases and drug resistance issues. A series of compounds based on tirbanibulin with increased Fsp3 have been prepared, which have been identified with ¹H NMR, ¹³C NMR and MS. The antiproliferative activities have been evaluated against HeLa and HepG2 with MTT method. The effect on microtubule and cell cycle distribution of compound 22 has been evaluated with immunofluorescence and flow cytometry. IC₅₀ of compound 22 against HeLa and HepG2 were 45 and 51 nmol·L^-1. And it destroys microfilament and arrests cell cycle at G2/M. The SAR show that pyridine moiety in tirbanibulin cannot be replaced with 2-imidazolidinone. Compound 22 was identified as a lead in the further research.

Key words

2-imidazolidinone / biaryl / tubulin inhibitor / c-Src / antitumor

引用本文

祁献芳, 康悦, 齐建国. 微管蛋白及c-Src双靶点抑制剂的合成与抗肿瘤活性评价. 药学学报, 2025 , 60 (6) : 1778 -1790 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2025-0219

Xian-fang QI, Yue KANG, Jian-guo QI. Synthesis and antitumor activity evaluation of dual-target inhibitors for tubulin and c-Src[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2025 , 60 (6) : 1778 -1790 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2025-0219

正文

收起

微管主要是由α, β微管蛋白异二聚体聚合而成的中空管状结构, 它具有多种生物学功能, 如参与细胞运动、细胞器定位、胞内物质运输及真核细胞的有丝分裂过程等。细胞进入分裂期, 其胞质微管解聚成微管蛋白后再组装成纺锤体微管。在分裂后期, 纺锤体微管牵引着姐妹染色单体从赤道面移向纺锤体两极。在有丝分裂结束后, 纺锤体微管解聚再组装成胞质微管。这种微管蛋白/微管之间的动态转换(聚合和解聚), 为细胞正常有丝分裂所必需。若破坏此循环将致使进入有丝分裂的细胞停止分裂, 进而延长细胞周期或诱导细胞凋亡。因此, 微管蛋白成为重要的抗肿瘤药物作用靶点^[1-3]。临床中常用的微管类药物主要有紫杉醇及长春瑞滨等(图1)。然而, 临床上出现微管类药物耐药现象, 亟需研发具有新作用模式、新机制的分子来克服耐药问题^[4-14]。

多靶点药物分子策略是近年来针对复杂性疾病及耐药问题发展起来的一种药物分子设计策略, 即一个药物分子同时作用于具有联系的两个或多个药物靶点。同时作用的靶点之间或者具有协同作用, 或者一个靶点能够减小另一个靶点的不良反应^[15-19]。

c-Src是Src激酶家族(Src family kinases, SFK) 中的一种非受体酪氨酸激酶, 在多种肿瘤细胞(如头颈癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等) 里高表达与过度激活, 参与肿瘤细胞的多种生理、病理过程, 如细胞增殖、黏附、迁移和侵袭等。正常细胞中的c-Src激酶处于一个动态平衡的过程, 但癌细胞中的c-Src激酶持续激活且高度表达, 通过多种信号通路促进不同肿瘤的发生与发展, 包括Src-Janus激酶-信号转导与转录激活因子3 (Src-Janus kinase-signal transducer and activator of transcription 3, Src-JAK-STAT3)、Src-Ras-丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(Src-Ras-mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase, Src-Ras-MAPK/ERK)、Src-磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白(Src-phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin, Src-PI3K-AKT-mTOR)、Src-黏着斑激酶-桩蛋白(Src-focal adhesion kinase-paxillin signaling complex, Src/FAK/paxillin) 等通路, 或激活下游效应生长因子而促进肿瘤生长, 或者促进桩蛋白/细胞骨架/整合素聚合物的形成从而促进肿瘤转移^[20-22]。另外, c-Src通过多种途径促进肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药。例如, c-Src通过PI3K-AKT途径过度激活导致乳腺癌细胞(T47D) 对他莫昔芬产生耐药, 而c-Src抑制剂达沙替尼能够逆转他莫昔芬耐药; c-Src通过调节连接蛋白43磷酸化导致人结直肠癌细胞116 (human colorectal tumor 116, HCT116) 发生顺铂耐药等。另有报道, c-Src通过调节γ-微管蛋白的磷酸化而影响纺锤体的成核作用^{[10, 23, 24]}。因此, 通过合理的药物设计, 同时调节微管蛋白动力学与c-Src, 通过协同增效产生抗肿瘤作用, 尤其是克服耐药问题是一种可行的策略^[25]。

最近有研究报道一些秋水仙碱位点微管蛋白聚合抑制剂对紫杉醇耐药肿瘤同样有效^[12]。替巴尼布林(tirbanibulin) 是作用于秋水仙碱位点的微管蛋白聚合及c-Src双靶点抑制剂, 对多种肿瘤细胞株有较好的抑制作用。它最初用于抗肿瘤作用开展临床研究, 然而由于其具有较大毒副作用, 于2020年被FDA批准外用治疗光角化病——一种癌前病变的治疗^[26-28]。其中替巴尼布林用于治疗前列腺癌的一项Ⅱ期临床试验中, 表现出较大的肝毒性。肝毒性并非微管聚合或c-Src抑制直接带来的毒副作用。该毒性往往是由于药物分子在肝脏中Ⅰ相代谢产生了反应性代谢物^[29]。近来, 葛兰素史克公司通过数据分析发现, 药物分子开发过程中出现安全问题概率与环的不饱和度有关: 苯环 > 芳香杂环 > 环烷烃 > 饱和杂环^[30]。另外, 替巴尼布林的血浆蛋白结合率高达88%, 其游离血药浓度极易受其他联合用药(影响肝脏药物代谢酶系统及高血浆蛋白结合率的药物) 的影响。这个性质对于治疗窗较窄的微管类药物尤其重要。因此, 提高分子中饱和碳原子比例(Fsp3) 是改善替巴尼布林毒性及药代动力学性质的一种策略^[31]。替巴尼布林分子中A环、C环位于微管蛋白秋水仙碱位点疏水区, B环通过水桥与氨基酸骨架形成氢键。本文尝试2-咪唑啉酮替代B环, 以提高分子Fsp3, 同时增大分子极性以减少肝脏蓄积及血浆蛋白结合来降低替巴尼布林毒性(图2)。

结果与讨论

收起

1　化合物的合成

化合物11a~11m的合成路线见合成路线1, 以吗啉为起始原料, 与2-溴乙醇发生亲核取代反应得到中间体2; 以4-氨基苯酚为起始原料, 与Boc酸酐反应得到中间体4, 中间体2与中间体4经过光延反应得到中间体5, 5在酸性条件脱除叔丁氧羰保护基得到中间体6, 6与2-氯乙基异氰酸酯缩合得到中间体7, 7在碱性条件下与氯乙酸叔丁醇酯通过亲核取代反应得到中间体8, 8在酸性条件下水解得到中间体9, 9与不同的取代苄胺或芳胺反应得到目标化合物11a~11m。

化合物19a和19b的合成路线见合成路线2, 以3,4-二氟硝基苯为起始原料, 与吗啉通过亲核取代反应得到中间体13, 中间体13分别经过还原、缩合、环化反应得到中间体16, 中间体17与取代苄胺反应得到中间体18, 中间体16与中间体18通过亲核取代反应得到目标化合物。共合成16个未见文献报道的新化合物, 其结构通过核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱进行了确证且目标产物的纯度均达到95%以上。

化合物22的合成路线见合成路线3, 以2-(5-溴吡啶-2-基)乙酸为起始原料, 与苄胺缩合得到中间体21, 中间体21与3-甲氧基苯硼酸经铃木反应得到目标化合物22。

2　活性评价

目标化合物对HeLa和HepG2两种肿瘤细胞株的生长抑制作用如表1所示。首先, 2-咪唑啉酮结构替代替巴尼布林中的吡啶片段时, 仅有苯环上无取代的化合物11k显示出微弱的抗肿瘤活性。在化合物11k的基础上, 采用吗啉替代吗啉乙基结构, 同时在吗啉取代苯环的邻位引入氟原子得到化合物19a, 其活性略有提升。然而, 在C环间位引入氯, 活性下降。推测吗啉乙基对活性的影响没有贡献或贡献不大, 同时结合本课题组前期研究(图2)^[32], 在苯环A间位引入甲氧基, 得到化合物22, 结果化合物22显示出与阳性对照药相当的抗肿瘤活性。

3　化合物22作用机制研究

通过免疫荧光实验发现化合物22能够破坏微管的形态, 并且使微管固缩在核周围, 呈现出量效关系(图3)。接下来, 采用流式细胞术分析化合物22对细胞周期的影响, 化合物22能够将HeLa细胞周期阻滞在G2/M期, 并且呈现出剂量依赖性(图4)。化合物22能够有效抑制微管的聚合, 从而抑制纺锤体的形成, 使肿瘤细胞在分裂期无法完成分裂, 产生抗肿瘤作用。因此, 作者在替巴尼布林基础上发现分子质量更小微管蛋白抑制剂化合物22, 该化合物可作为先导物开展进一步深入研究。

4　化合物22与靶点的结合模式探讨

分子对接结果显示(图5), 化合物22结合在微管蛋白秋水仙碱位点, 结合模式类似于替巴尼布林, 略偏向α微管蛋白亚基, 并且能够与周围氨基酸形成较好的结合作用。如吡啶环与Leu248、Ala250及Lys352形成疏水作用, 而吡啶上的氮原子与Asn258残基形成氢键; 孤立的苯环与Leu255与Ile378形成疏水作用。另外, 化合物22结合在c-Src的底物结合区域, 并形成很好的相互作用。如化合物22上的吡啶环与Phe1171形成T型的π-π堆积作用, 化合物22上酰胺氧原子与Ala1181骨架上氨基氢原子形成氢键。综上, 化合物22与微管蛋白及c-Src具有很好的结合物作用, 同时这也为进一步提高活性的优化提供三维结构信息。

5　结论

本文在微管蛋白及c-Src双靶点药物替巴尼布林基础上, 从增加Fsp3角度出发, 合成系列化合物并开展抗肿瘤活性评价, 初步探讨了所合成化合物的构效关系, 发现2-咪唑啉酮不适合替代替巴尼布林中的吡啶结构, 同时吗啉乙基对活性没有太大贡献。在此基础上发现化合物22具有较好的抗肿瘤活性, 能破坏微管形态及将细胞阻滞在G2/M生长期, 可作为先导物开展进一步深入研究。

实验部分

收起

核磁共振仪(Bruker Avance Ⅲ 300 MHz, 瑞士Bruker公司); 氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆) 或氘代氯仿(chloroform-d) 为溶剂, 四甲基硅烷为内标; 高分辨质谱仪(Aglient 1260-6230, 美国安捷伦公司); 熔点仪(X-4型, 上海仪电物理光学仪器有限公司); 多色流式细胞分选系统(CytoFLEX, 美国贝克曼库尔特公司); 多功能酶标仪(BioTek, 美国安捷伦公司)。文中合成用化合物试剂为分析纯, 从安徽泽升科技股份有限公司购置, 未经进一步纯化。

1　化学实验

1.1　目标化合物N-(2-氟苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11a) 的制备

1.1.1　2-吗啉乙醇(2) 的制备

将吗啉(化合物1, 0.48 mL, 5.6 mmol)、乙腈(20 mL)、2-溴乙醇(0.48 mL, 6.7 mmol, 1.2 equiv)、碳酸钾(1.0 g, 7.3 mmol, 1.3 equiv) 依次投入至50 mL圆底烧瓶中。30 ℃条件下搅拌18 h, TLC监测反应(碘显色), 待反应完全, 抽滤后减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, DCM∶MeOH = 10∶1), 得到0.51 g无色液体, 产率为69.5%。¹H NMR (300 MHz, chloroform-d) δ_H: 3.61 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.53 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.27 (s, 1H), 2.43 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 4.5 Hz, 4H)。

1.1.2　4-羟基苯胺基碳酸叔丁醇酯(4) 的制备

将4-氨基苯酚(化合物2, 2.00 g, 18.3 mmol)、四氢呋喃(20 mL)、三乙胺(12.2 mL, 87.8 mmol, 4.8 equiv) 依次投入至50 mL圆底烧瓶中。随后, 将二碳酸二叔丁酯[(Boc)₂O, 4.80 g, 22.0 mmol, 1.2 equiv] 溶于5 mL三乙胺中, 通过恒压滴液漏斗缓慢匀速滴加至反应瓶中, 室温搅拌6 h, TLC监测反应, 待反应完全, 减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, PE∶EA = 3∶1), 得到3.45 g无色液体, 产率为90.1%。¹H NMR (300 MHz, methanol-d₄) δ_H: 7.17 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.72 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.93 (s, 1H), 1.48 (s, 9H)。

1.1.3　4-(2-吗啉乙氧基)苯胺基碳酸叔丁醇酯(5) 的制备

将中间体4 (2.00 g, 9.60 mmol)、无水四氢呋喃(20 mL)、中间体2 (2.30 g, 17.3 mmol, 1.8 equiv)、三丁基膦(TBUP, 7.20 mL, 28.8 mmol, 3.0 equiv) 依次投入至100 mL圆底烧瓶中。随后, 将偶氮二甲酰胺(TMAD, 4.90 g, 28.7 mmol, 3.0 equiv) 溶于装有30 mL无水二氯甲烷的恒压滴液漏斗中, 氮气置换空气, 0 ℃条件下搅拌30 min, 缓慢匀速滴加至反应瓶中, 滴加完后移入室温搅拌2 h, TLC监测反应, 待反应完全, 减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, PE∶EA = 1∶1), 得到2.8 g无色液体, 产率为91.0%。¹H NMR (300 MHz, chloroform-d) δ_H: 7.23 (s, 2H), 6.85 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.07 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.7 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.78 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.56 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 1.50 (s, 9H)。

1.1.4　4-(2-吗啉乙氧基)苯胺盐酸盐(6) 的制备

将中间体5 (1.0 g, 3.1 mmol) 投入至25 mL圆底烧瓶中。随后加10 mL盐酸乙醇溶液, 70 ℃搅拌1 h, TLC监测反应, 待反应完全, 减压蒸馏得到油状产物未纯化, 直接投下一步。

1.1.5　1-(2-氯乙基)-3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)脲(7) 的制备

将中间体6 (1.0 g, 4.5 mmol)、无水四氢呋喃(20 mL)、氯乙基异氰酸酯(0.43 mL, 5.0 mmol, 1.1 equiv) 三乙胺(1.2 mL, 9.0 mmol, 2.0 equiv) 依次投入至50 mL圆底烧瓶中, 室温搅拌4 h, TLC监测反应, 待反应完全, 加入减压蒸馏得到0.55 g白色固体, 产率为37.2%。直接投入下一步。

1.1.6　1-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)咪唑啉-2-酮(8) 的制备

将中间体7 (0.50 g, 1.7 mmol)、无水四氢呋喃(10 mL) 加入至25 mL圆底烧瓶中。随后, 缓慢将氢化钠(0.14 g, 3.4 mmol, 2.0 equiv) 加入反应瓶中, 室温搅拌2 h, TLC监测反应, 待反应完全, 减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, DCM∶MeOH = 10∶1), 得到0.31 g白色固体, 产率为62.6%。¹H NMR (300 MHz, chloroform-d) δ_H: 7.40 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 5.42 (s, 1H), 4.08 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.88 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.54 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.56 (t, J = 4.5 Hz, 4H)。

1.1.7　2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酸叔丁酯(9) 的制备

将中间体8 (1.1 g, 3.8 mmol)、DMF (20 mL)、溴乙酸叔丁酯(0.8 mL, 5.7 mmol, 1.5 equiv) 依次投入至50 mL圆底烧瓶中。随后, 将氢化钠(0.15 g, 3.8 mmol, 1.0 equiv) 缓慢加入反应瓶中, 室温搅拌4 h, TLC监测反应, 待反应完全, 加入二氯甲烷与水萃取, 有机相用无水硫酸钠干燥, 抽滤后减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, DCM∶MeOH = 20∶1), 得到0.78 g白色固体, 产率为50.6%。¹H NMR (300 MHz, chloroform-d) δ_H: 7.23 (s, 2H), 6.85 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.07 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.78 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.62~2.51 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 1.50 (s, 9H)。

1.1.8　2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酸(10) 的制备

将中间体9 (0.46 g, 1.1 mmol)、二氯甲烷(16 mL) 投入至50 mL圆底烧瓶中。在冰浴条件下缓慢将16 mL三氟乙酸加入反应瓶中, 后移至室温搅拌6 h, TLC监测反应, 待反应完全, 多次加入二氯甲烷低温减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, DCM∶MeOH = 5∶1), 得到0.26 g白色固体, 产率为68.4%。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 7.44 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.03 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.57 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.51 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.66 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.45 (t, J = 4.8 Hz, 4H)。

1.1.9　 N-(2-氟苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11a) 的制备

将中间体10 (0.10 g, 0.29 mmol)、2-氟苄胺(0.04 mL, 0.3 mmol, 1.2 equiv)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N, N, N, ′N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU, 0.13 g, 0.3 mmol, 1.2 equiv)、二异丙基乙胺(DIPEA, 0.1 mL, 0.6 mmol, 2.0 equiv) 溶于2 mL DMF中。40 ℃搅拌约4 h。TLC监测反应, 待反应完全后, 加入二氯甲烷与水, 萃取, 有机相用无水硫酸钠干燥、抽滤后减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, DCM∶MeOH = 10∶1), 得到0.042 g白色固体, 产率为30.6%。HPLC纯度: 98.75%, 熔点: 153.1~154.7 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.57 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.37~7.28 (m, 2H), 7.19 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 5.1, 2.7 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.35 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.79 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.51 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.46 (t, J = 4.5 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 169.00, 162.10, 158.86, 158.06, 154.06, 134.55, 129.99, 129.93, 129.43, 129.32, 126.46, 126.27, 124.82, 124.78, 119.02, 115.66, 115.38, 115.04, 66.66, 65.99, 57.58, 54.13, 47.17, 42.82, 42.75, 36.33, 36.27; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₄H₂₉FN₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 479.206 50, found 479.208 96。

1.2　 N-(3-氟苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11b) 的制备

除第(9)步中用3-氟苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.048 g白色固体, 产率为36.7%。HPLC纯度: 99.63%, 熔点: 154.4~155.5 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.60 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.38 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 7.10 (q, J = 7.8 Hz, 3H), 6.93 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.33 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.80 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.52 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 4.8 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 169.05, 164.33, 161.10, 158.07, 154.06, 142.98, 142.89, 134.55, 130.74, 130.63, 123.60, 123.57, 118.99, 115.04, 114.41, 114.12, 113.84, 66.66, 65.98, 57.58, 54.14, 47.28, 42.82, 41.99, 41.96; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₄H₂₉FN₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺: 479.206 50, found 479.208 70。

1.3　 N-(4-氟苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11c) 的制备

除第(9)步中用4-氟苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.038 g白色固体, 产率为29.1%。HPLC纯度: 99.35%, 熔点: 163.3~164.5 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.57 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.31 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 7.19~7.12 (m, 2H), 6.93 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.29 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.86 (s, 2H), 3.79 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.50 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 4.8 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.87, 163.25, 160.04, 158.05, 154.05, 136.08, 136.04, 134.55, 129.69, 129.59, 118.99, 115.61, 115.33, 115.04, 66.66, 65.97, 57.58, 54.13, 47.26, 42.81, 42.77, 41.77; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₄H₂₉FN₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 479.206 50, found 479.208 28。

1.4　 N-(3-氯苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11d) 的制备

除第(9)步中用3-氯苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.035 g白色固体, 产率为25.9%。HPLC纯度: 98.19%, 熔点: 109.7~111.9 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.62 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 9.9 Hz, 3H), 7.24 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.32 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.79 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.52 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.68 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.48 (t, J = 4.8 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 169.06, 158.05, 154.02, 142.50, 134.53, 133.46, 130.65, 127.47, 127.21, 126.31, 118.96, 115.01, 66.63, 65.90, 57.56, 54.11, 47.27, 42.81, 41.93; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₄H₂₉ClN₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 495.176 95, found 495.178 89。

1.5　 N-(4-氯苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11e) 的制备

除第(9)步中用4-氯苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.045 g白色固体, 产率为33.3%。HPLC纯度: 96.84%, 熔点: 163.6~165.5。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.61 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.29 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.86 (s, 2H), 3.79 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.50 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.51 (s, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.96, 158.04, 154.01, 138.95, 134.54, 131.79, 129.53, 128.70, 118.97, 115.02, 66.58, 65.85, 57.53, 54.08, 47.25, 42.78, 41.81; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₄H₂₉ClN₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 495.176 95, found 495.178 98。

1.6　 N-(3-溴苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11f) 的制备

除第(9)步中用3-溴苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.047 g白色固体, 产率为31.8%。HPLC纯度: 99.23%, 熔点: 166.6~168.4 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.60 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 15.3, 8.4 Hz, 4H), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.27 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.86 (s, 2H), 3.79 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.50 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 4.5 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.95, 158.03, 153.93, 139.39, 134.61, 131.61, 129.92, 120.25, 118.97, 115.06, 66.35, 65.61, 57.37, 53.93, 47.25, 42.78, 42.21, 41.87; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₄H₂₉BrN₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 541.126 44, found 541.128 09。

1.7　 N-(2-甲基苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11g) 的制备

除第(9)步中用2-甲基苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.035 g白色固体, 产率为27.1%。HPLC纯度: 99.00%, 熔点: 130.9~132.7 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.42 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.18 (q, J = 8.7 Hz, 4H), 6.93 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.28 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.06 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.79 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.52 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.49 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.68, 158.06, 154.01, 137.32, 136.05, 134.56, 130.37, 128.02, 127.36, 126.22, 118.96, 115.02, 65.92, 57.57, 54.12, 47.09, 42.79, 19.13; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₅H₃₂N₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 475.231 58, found 475.233 43。

1.8　 N-(4-甲基苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11h) 的制备

除第(9)步中用4-甲基苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.039 g白色固体, 产率为30.2%。HPLC纯度: 99.83%, 熔点: 165.2~167.1 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆₎ δ_H: 8.54 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.15 (q, J = 8.4 Hz, 4H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.25 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.85 (s, 2H), 3.78 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.49 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.72, 158.03, 154.01, 136.80, 136.30, 134.54, 129.30, 127.68, 118.95, 115.00, 66.65, 65.90, 57.57, 54.13, 47.20, 42.77, 42.73, 42.20, 21.14; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₅H₃₂N₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 475.231 58, found 475.233 39。

1.9　 N-(2-甲氧基苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11i) 的制备

除第(9)步中用2-甲氧基苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.036 g白色固体, 产率为26.9%。HPLC纯度: 99.25%, 熔点: 123.8~125.4 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.38 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.25 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.93 (q, J = 6.9 Hz, 3H), 4.27 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.06 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.78 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.52 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.51 (s, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.86, 158.08, 157.07, 154.00, 134.60, 128.53, 128.07, 127.05, 120.59, 118.99, 115.04, 110.90, 66.56, 65.84, 57.51, 55.76, 54.07, 47.16, 42.81, 42.75, 37.57; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₅H₃₂N₄O₅Na⁺ [M+Na]⁺ 491.226 49, found 491.228 69。

1.10　 N-(4-甲氧基苄基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11j) 的制备

除第(9)步中用4-甲氧基苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.038 g白色固体, 产率为28.4%。HPLC纯度: 98.78%, 熔点: 149.3~151.3 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.53 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.91 (q, J = 8.7 Hz, 4H), 4.23 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.84 (s, 2H), 3.78 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.58 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.49 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.46 (t, J = 4.5 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.65, 158.67, 158.04, 154.01, 134.54, 131.78, 129.04, 118.96, 115.00, 114.14, 66.65, 65.90, 57.57, 55.51, 54.13, 47.20, 42.77, 42.73, 41.91; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₅H₃₂N₄O₅Na⁺ [M+Na]⁺ 491.226 49, found 491.228 53。

1.11　 N-苄基-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11k) 的制备

除第(9)步中用苄胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.045 g白色固体, 产率为33.3%。HPLC纯度: 99.12%, 熔点: 150.5~151.3 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.56 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.36~7.22 (m, 5H), 6.95 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.31 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.12 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.80 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.51 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.89 (s, 2H), 2.68 (s, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.81, 158.05, 153.81, 139.83, 134.76, 128.76, 127.66, 127.26, 119.01, 115.15, 65.95, 57.11, 53.67, 47.22, 42.82, 42.75, 42.47; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₄H₃₀N₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 461.215 93, found 461.218 32。

1.12　 N-(苯基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11l) 的制备

除第(9)步中用苯胺代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.033 g白色固体, 产率为27.2%。HPLC纯度: 99.65%, 熔点: 165.1~167.0 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 10.11 (s, 1H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.06 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.07 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.82 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.60 (s, 2H), 3.58 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.57 (t, J = 4.2 Hz, 4H) 2.68 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 4.8 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 167.66, 158.19, 154.07, 139.24, 134.51, 129.22, 123.83, 119.71, 119.05, 115.04, 66.63, 65.93, 57.56, 54.11, 47.44, 42.89, 42.70; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₃H₂₈N₄O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 447.200 28, found 447.202 02。

1.13　 N-(吡啶-4-基)-2-(3-(4-(2-吗啉乙氧基)苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(11m) 的制备

除第(9)步中用4-氨基吡啶代替2-氟苄胺外, 其他步骤及提纯方法同实施例1, 得到0.038 g白色固体, 产率为31.1%。HPLC纯度: 90.60%, 熔点: 149.6~150.7 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 10.62 (s, 1H), 8.33 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.78 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.11 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.11 (s, 2H), 4.05 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.81 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.56 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.46 (t, J = 4.6 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 169.03, 158.18, 154.08, 150.86, 145.82, 134.44, 119.09, 115.04, 113.72, 66.52, 65.80, 57.48, 54.04, 47.55, 42.93, 42.69; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₂H₂₇N₅O₄Na⁺ [M+Na]⁺ 448.195 53, found 448.197 98。

1.14　 N-苄基-2-(3-(3-氟-4-吗啉苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(19a) 的制备

1.14.1　4-(2-氟-4-硝基苯基)吗啉(13) 的制备

将3,4-二氟硝基苯(化合物12, 2.00 g, 12.6 mmol)、DMF (20 mL)、吗啉(1.20 mL, 13.8 mmol, 1.1 equiv)、碳酸钾(3.50 g, 25.2 mmol, 2.0 equiv) 依次投入至50 mL圆底烧瓶中。随后, 80 ℃条件下搅拌6 h, TLC监测反应, 待反应完全后, 加入二氯甲烷与水, 萃取, 有机相用无水硫酸钠干燥, 抽滤后减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, PE∶EA = 5∶1), 得到2.52 g黄色固体, 产率为88.7%。¹H NMR (300 MHz, chloroform-d) δ_H: 7.97 (dd, J = 9.0, 2.7 Hz, 1H), 7.88 (dd, J = 13.2, 2.7 Hz, 1H), 6.91 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 3.86 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.27 (t, J = 4.8 Hz, 4H)。

1.14.2　3-氟-4-吗啉基苯胺(14) 的制备

将中间体13 (1.0 g, 4.4 mmol) 投入至25 mL圆底烧瓶中, 加入10 mL甲醇溶解, 后将10%钯碳(0.09 g, 0.88 mmol, 0.2 equiv) 缓慢加入反应瓶中, 用氢气置换空气, 室温搅拌约4 h。TLC监测反应, 待反应完全后, 将反应液用带有硅藻土的抽滤漏斗抽滤, 减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, PE∶EA = 3∶1), 得到0.70 g浅粉色固体, 产率为80.7%。¹H NMR (300 MHz, chloroform-d) δ_H: 6.79 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 6.45~6.38 (m, 2H), 3.85 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.57 (s, 2H), 2.96 (t, J = 4.8 Hz, 4H)。

1.14.3　1-(2-氯乙基)-3-(3-氟-4-吗啉基苯基)脲(15) 的制备

除用中间体14替换中间体6, 操作步骤同中间体7的制备。

1.14.4　1-(3-氟-4-吗啉基苯基)咪唑啉-2-酮(16) 的制备

除用中间体15替换中间体7, 操作步骤同中间体8的制备。

1.14.5　 N-苄基-2-溴乙酰胺(18a)的制备

将苄胺(2.00 mL, 18.7 mmol)、二氯甲烷(20 mL)、K₂CO₃ (5.20 g, 37.4 mmol, 2.0 equiv) 依次投入至50 mL圆底烧瓶中, 用氮气置换空气, 在0 ℃条件下搅拌约30 min。将溴乙酰溴(1.6 mL, 18.7 mmol, 1.0 equiv) 通过恒压滴液漏斗缓慢滴入反应液中, 反应持续搅拌4 h, TLC监测反应, 待反应完全后, 反应液进行抽滤、减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, PE∶EA = 5∶1), 得到2.80 g白色固体, 产率为65.7%。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.77 (s, 1H), 7.30 (dq, J = 14.7, 7.8 Hz, 5H), 4.31 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.92 (s, 2H)。

1.14.6　 N-苄基-2-(3-(3-氟-4-吗啉苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(19a) 的制备

将中间体16 (0.10 g, 0.40 mmol)、中间体18a (0.14 g, 0.60 mmol, 1.5 equiv) 溶于4 mL DMF中, 室温搅拌。将氢化钠(0.03 g, 0.8 mmol, 2.0 equiv) 缓慢加入反应液中, 室温搅拌约6 h。TLC点板监测反应, 待反应完全后, 二氯甲烷与水进行萃取, 有机相用无水硫酸钠干燥、抽滤后减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, DCM∶MeOH = 20∶1), 得到0.042 g白色固体, 产率为25.9%。HPLC纯度: 96.70%, 熔点: 155.8~157.0 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.62 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.63 (dd, J = 15.6, 2.5 Hz, 1H), 7.36~7.23 (m, 5H), 7.18 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.01 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.79 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.52 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 2.94 (t, J = 4.5 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.67, 157.72, 156.86, 153.64, 139.79, 136.5, 134.5, 128.77, 127.66, 127.28, 119.57, 112.92, 105.84, 66.69, 51.35, 51.32, 47.05, 42.53, 42.47; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₂H₂₅FN₄O₃Na⁺ [M+Na]⁺ 435.180 29, found 435.182 29。

1.15　 N-(3-氯苄基)-2-(3-(3-氟-4-吗啉苯基)-2-氧代咪唑啉-1-基)乙酰胺(19b) 的制备

除用中间体18b代替中间体18a外, 其他步骤及提纯方法同19a, 得到0.046 g白色固体, 产率为27.7%。HPLC纯度: 96.75%, 熔点: 115.8~117.0 ℃。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.63 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 16.5, 2.4 Hz, 1H), 7.40~7.30 (m, 3H), 7.23 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.02 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 4.31 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.80 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 3.53 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.94 (t, J = 4.5 Hz, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 168.89, 157.73, 156.85, 153.64, 142.46, 136.58, 136.44, 134.54, 134.42, 133.47, 130.66, 127.46, 127.22, 126.31, 119.63, 119.57, 112.97, 112.93, 106.04, 105.69, 66.68, 51.35, 51.32, 47.08, 42.62, 42.56, 41.92; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₂H₂₄ClFN₄O₃Na⁺ [M+Na]⁺ 469.141 32, found 469.142 60。

1.16　 N-苄基-2-(5-(3-甲氧基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺(22) 的制备

1.16.1　 N-苄基-2-(5-溴吡啶-2-基)乙酰胺(21) 的制备

将2-(5-溴吡啶-2-基)乙酸(中间体20, 1.00 g, 4.63 mmol)、苄胺(1.50 mL, 13.9 mmol, 3.0 equiv)、1-羟基苯并三唑(0.810 g, 6.02 mmol, 1.3 equiv)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1.03 g, 6.9 mmol, 1.5 equiv)、4-二甲氨基吡啶(0.17 g, 1.4 mmol, 0.3 equiv) 依次投入至50 mL圆底烧瓶中。随后, 加入20 mL DMF溶解, 80 ℃条件下搅拌12 h, TLC监测反应, 待反应完全, 加入二氯甲烷与水萃取, 有机相用无水硫酸钠干燥, 抽滤后减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, PE∶EA = 1∶1), 得到1.00 g白色固体, 产率为70.9%。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 8.62 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.37~7.25 (m, 6H), 4.30 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.69 (s, 2H)。

1.16.2　 N-苄基-2-(5-(3-甲氧基苯基)吡啶-2-基)乙酰胺(22) 的制备

将中间体21 (0.10 g, 0.33 mmol)、3-甲氧基苯硼酸(0.051 g, 0.39 mmol, 1.2 equiv)、2-二环己基磷- 2′, 4′, 6′-三异丙基联苯(0.031 g, 0.06 mmol, 0.2 equiv)、三(二亚苄基丙酮) 二钯(0.030 g, 0.03 mmol, 0.1 equiv)、氟化铯(0.25 g, 1.7 mmol, 5.0 equiv) 依次投入至25 mL圆底烧瓶中。随后加入4 mL 1,4-二氧六环与1 mL水溶解, 氮气置换空气, 接着, 90 ℃加热搅拌12 h, TLC监测反应, 待反应完全, 加入二氯甲烷与水萃取, 有机相用无水硫酸钠干燥, 抽滤后减压蒸馏, 蒸出溶剂, 柱层析(200~300目硅胶, PE∶EA = 1∶1), 得到0.036 g白色固体, 产率为33.0%。HPLC纯度: 99.40%, 熔点: 94.8~96.5 ℃。¹H NMR (300 MHz, chloroform-d) δ_H: 8.76 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.41 (q, J = 7.8 Hz, 2H), 7.32~7.28 (m, 5H), 7.17 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.99 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.87 (s, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, chloroform-d) δ_C: 169.29, 160.20, 154.53, 147.59, 138.80, 138.43, 135.58, 135.03, 130.24, 128.65, 127.60, 127.33, 124.04, 119.50, 113.44, 112.96, 55.40, 44.98, 43.57; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C₂₁H₂₀N₂O₂H⁺ [M+H]⁺ 333.159 84, found 333.159 57。

2　药理活性评价及机制研究实验

2.1　目标化合物抗肿瘤活性评价

采用MTT法评价所合成的目标化合物对HeLa和HepG2两种肿瘤细胞株的生长抑制作用。首先, 将处于对数生长期的细胞接种于96孔板, 置于37 ℃且含5%二氧化碳的培养箱中孵育24 h, 然后每孔加入不同浓度待测化合物或阳性对照药继续孵育72 h。孵育完毕, 每孔(空白除外) 加入50 μL MTT溶液, 置于37 ℃烘箱中继续孵育3.5 h。移去培养基和MTT混合液, 每孔加入100 μL DMSO溶液, 振摇10 min。使用酶标仪测定每个孔在490 nm处的吸光度(OD) 值。根据公式(1) 计算肿瘤细胞增殖抑制率:

$\begin{align} 抑制率 (\%) = &( \overline{\mathrm{O}\mathrm{D}} _{对照} - \overline{\mathrm{O}\mathrm{D}} _{实验})/( \overline{\mathrm{O}\mathrm{D}} _{对照} - \overline{\mathrm{O}\mathrm{D}} _{空白}) \\ &×100\% \end{align}$

(1)

其中,

$ \overline{\mathrm{O}\mathrm{D}} $

_对照、

$ \overline{\mathrm{O}\mathrm{D}} $

_实验、

$ \overline{\mathrm{O}\mathrm{D}} $

_空白分别为对照组、实验组和空白组的吸光度平均值。

2.2　评价目标化合物对微管形态的作用

采用免疫荧光实验研究化合物22对微管形态的影响。选取处于对数生长期的HepG2细胞, 每孔加入90 μL培养基(内含约3 500个细胞) 于96孔板中, 并将96孔板置于37 ℃且含5%二氧化碳的培养箱中孵育24 h。之后每孔各加入10 μL不同浓度(0.1、0.2 μmol·L^-1) 的待测化合物16个或0.1 μmol·L^-1的阳性对照药秋水仙碱, 置于培养箱中孵育24 h。孵育后, 移去培养基, PBS洗3遍, 每孔加90 μL含量为3.7%的多聚甲醛溶液, 置于4 ℃冰箱固定20 min。固定完毕, 在每孔中加入0.1%的Triton-X 100溶液(10 μL), 放置于4 ℃冰箱孵育15 min。吸走溶液, PBS洗3遍, 每孔加入2% BSA溶液(90 μL), 继续放置于37 ℃烘箱中封闭1 h。吸走BSA溶液, PBS洗2遍, 每孔加入30 μL提前配置好的β-tubulin一抗并于4 ℃冰箱避光孵育6 h。PBS洗3遍, 每孔加入30 μL提前配置好的FITC标记的羊抗兔IgG绿色荧光二抗在37 ℃烘箱中孵育2 h。PBS洗3遍, 每孔加入90 μL提前配置好的20 μg·mL^-1的Hoechst33342溶液, 放置在37 ℃烘箱中孵育15 min, 吸走染料, PBS洗3遍, 在倒置荧光显微镜下观察细胞内微管的形态, 并拍照记录。

2.3　评价目标化合物对细胞周期的作用

选取处于对数生长期的HeLa细胞, 按照合适的细胞密度均匀加入到6孔板中, 将6孔板置于37 ℃且含5%二氧化碳的培养箱中孵育24 h。每孔加入不同浓度的待测化合物, 留有空白对照, 继续将6孔板置于37 ℃且含5%二氧化碳的培养箱中继续孵育24 h。收集所有细胞, 离心(1 500 r·min^-1, 20 min), 吸走上清液, 加入300 μL 4 ℃预冷1 h的PBS溶液, 并用移液枪将EP管底部沉降的细胞吹打均匀。将细胞混悬液缓慢垂直滴入10 mL (-20 ℃预冷6 h) 的75%乙醇中固定, 并于-20 ℃条件下固定过夜。固定后以1 500 r·min^-1离心10 min, 吸走上清液, 加入约1 mL预冷的PBS溶液, 离心(1 500 r·min^-1, 10 min)。吸走上清液, 每个EP管中加入提前配制好的300 μL染色剂(要先置于4 ℃冰箱中), 之后在4 ℃冰箱中避光孵育1 h, 再次离心, 弃去染料。加入0.5 mL PBS溶液, 重悬细胞, 随后用300目网筛过滤, 用流式细胞仪以合适的方法和通道检测得出结论。

3　分子对接

采用分子对接模拟化合物22与靶蛋白的结合模式。采用Discovery Studio软件, 选取微管蛋白与替巴尼布林的晶体结构6KNZ及文献中通过同源建模获得的c-Src与替巴尼布林的三维结构^[29], 采用默认模式制备蛋白及配体分子。采用CDOCKER方法进行分子对接。

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2025年第60卷第6期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2025-0219

接收时间：2025-02-28
首发时间：2026-09-20
出版时间：2025-06-12

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收稿日期：2025-02-28
修回日期：2025-04-25

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¹河南省人民医院药学部, 河南郑州 450003

²河南大学河南省天然药物创新与转化重点实验室, 河南开封 475004

通讯作者:

齐建国，Tel: 15093693863, E-mail: qijianguo@henu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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