药学学报


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6	H	8%	7.6
7		52%	1.9
8		22%	1.5
9		21%	0.54
10		84%	0.070


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10	142		13		1 180
11	1 080	14		351
12	1 500	15		254


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16	H	H	4 400.
17		H	4 630.
18	H		4 530.
19		H	4 840.
20	H		>5 000.
21		H	14.
S-21		H	10.
R-21		H	1 020.
22	H		3 320


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21S	H	10		26	CF₃O	4
23	CH₃O	22	27	Cl	1
24	CN	64	28	CH₃	1
25	C₂H₅	6	-


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Item	Data
MW/Clog P/PSA (Å²)	604/5.8/87
NCI-H358 cellular IC₅₀ @ 3 h/nmol·L^-1	14
Hepatocyte ER (m, d, h)/%	61, 36, 50
Microsome ER (m, d, h)/%	57, 39, 56
Whole blood stability t_1/2/h	>50
Plasma protein binding/% (m, h)	99.0, 98.3
FaSSIF solubility (pH 6.5)/μg·mL^-1	568

Item	Data
MW/Clog P/PSA (Å²)	604/5.8/87
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Hepatocyte ER (m, d, h)/%	61, 36, 50
Microsome ER (m, d, h)/%	57, 39, 56
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Plasma protein binding/% (m, h)	99.0, 98.3
FaSSIF solubility (pH 6.5)/μg·mL^-1	568

变构抑制剂阿达雷塞的研制

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郭宗儒

药学学报 | 新药发现与研究实例简析 2025,60(7): 2370-2374

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药学学报 |新药发现与研究实例简析 2025 , 60 (7) : 2370 -2374

变构抑制剂阿达雷塞的研制

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郭宗儒

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

Affiliations

出版时间: 2025-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0184

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引用本文

郭宗儒. 变构抑制剂阿达雷塞的研制. 药学学报, 2025 , 60 (7) : 2370 -2374 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0184

. Acta Pharmaceutica Sinica, 2025 , 60 (7) : 2370 -2374 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0184

正文

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1　引言

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癌基因中KRAS是最常发生突变的基因, 高居《人癌体细胞突变目录》 (COSMIC) 700个之首位, 尤其在胰腺、结直肠和肺癌占比很重。KRAS最常发生的是Gly12突变成Cys12, KRAS^G12C。虽然以RAS为靶标的药物研究已30多年, 但因该蛋白缺乏适宜的结合腔穴而成效甚微, 被认为是非成药性靶标。该KRAS^G12C隐藏在变构腔穴中。最早确定成为靶标的科学突破是Shokat等发现在KRAS开关-Ⅱ效应区附近有个未被发现的腔穴, 用带有亲电基团的化合物可以捕获腔穴中的Cys12, 发生共价结合, 将结合的GDP锁定为非活性状态(Ostrem JM, Peters U, Sos ML, et al. K-Ras (G12C) inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions. Nature, 2013, 503: 548-551)。

2　活性评价

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2.1　化合物对KRAS^G12C酶的抑制活性

一定量的KRAS^G12C的缓冲溶液加入3 nmol·L^-1受试化合物混匀, 在15 min、3 h和24 h时间点淬灭反应, 滤除缓冲剂, 蛋白的乙腈溶液注入LC-MS测定每个蛋白质的质量数占样品总蛋白的%含量, 再经空白液的蛋白量作归一化处理, %值称作POC (对照%含量), 相比空白的增加值就是被受试物结合的%数, 越大表明受试物活性越高。

2.2　化合物对细胞的抑制活性

用表达KRAS^G12C不同的细胞和表达野生KRAS细胞分别与经3倍稀释的受试化合物温孵, 洗涤后加入Phospho-ERK1/2抗体和GAPDH液, 温孵, 磷酸缓冲液洗涤后, 加入抗家兔AlexaFluor 680抗体和抗小鼠IRDye 800CW, 温孵, 用红外扫描仪测定phospho-ERK 1/2信号, 与空白对照计算化合物抑制细胞生长的半数有效浓度IC₅₀。浓度越低活性越强。

3　先导化合物和初步优化

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3.1　3-羟基-1-萘基化合物的发现

经过系统地筛选含有亲电基团的化合物库发现的苗头化合物, 经基于酶结构的分子设计得到了化合物1, 1中含有的亲电基团是丙烯酰胺片段, 是与Cys12共价结合基团。图1是化合物1与KRAS^G12C复合物单晶结构图。丙烯酰胺与Cys12侧链SH共价结合清晰可见, 酰基与Lys16的氨基形成氢键(用红色虚线表示), 嘧啶的N1与His95的NH也发生氢键结合, 萘环进入了由Val9、Met72、Phe78、Tyr96、Ile100和Val103组成的疏水腔中。基于1所处的空间状态, 设计合成了第一轮化合物列于表1。

表1化合物的酶和细胞活性显示, 1-萘基(1) 和4-吲唑基(2) 有近似的酶活性, 但较弱, 变换成取代苯基的3和4酶活性更弱, 可解释为与疏水腔结合减弱的缘故。这些化合物在16 μmol·L^-1浓度下都没有显示细胞活性。化合物5 (3-羟基-1-萘基) 在浓度为5 μmol·L^-1时抑酶活性达99%, 而且抑制细胞的IC₅₀ = 7.6 μmol·L^-1, 显示出活性。但7-羟基-1-萘基(6) 没有任何活性, 羟基的位置很重要。

3.2　C2碱性侧链有助于结合

进一步分析嘧啶的C2接近Glu62的侧链羧基, 若C2引入碱性基团, 与Glu62羧基的静电引力可提高结合力。以6为新的起点合成的化合物列于表2。测定表2化合物的抑酶活性是用3 μmol·L^-1的受试物浓度, 观察15 min对蛋白的共价结合%数。可以看到由于C2连接了碱性侧链7~9的酶和细胞活性都显著强于6, 9的活性强于7和8, 提示降低柔性有利于活性。9是手性化合物, 测定的样品是混旋体, 而生成复合物的晶体结构是R-9, 将S-9分子对接到KRAS-G12C中能量显著增高, 提示R-9是优映体。化合物10为N-甲基四氢吡咯, 减少一柔性键, 其R构型活性非凡的高。R-10体内小鼠实验表明有良好的抑瘤作用和量效关系, 对野生型KRAS和其他蛋白没有抑制作用。但R-10口服吸收差(F = 2.4%) 和酚羟基发生广泛Ⅱ相代谢(葡醛酸化和硫酸化), 仍需进一步优化(Fell JB, Fischer JP, Baer BR, et al. Discovery of tetrahydropyridopyrimidines as irreversible covalent inhibitors of KRAS-G12C with in vivo activity. ACS Med Chem Lett, 2018, 9: 1230-1234)。

4　改善药代动力学的优化

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4.1　变换萘酚环

化合物10与KRAS-G12C的晶体学分析表明, 萘环与Val9、Met72、Phe78、Tyr96、Ile100和Val103形成的疏水腔有良好的契合, 酚羟基与Asp69的羧基氢键结合(图省略)。下一轮设计了简单取代吲唑置换萘酚, 烷基取代可能是弥补疏水之不足, 吲唑既有双环的体积, 也有氢键给体。合成的化合物列于表3。11~13低活性, 而三氟甲基和二甲基取代的14和15活性仅降低2~3倍, 14和15有一定的代谢稳定性, 肝提取率(HER) < 55%, 低于10大约8倍。但被糖蛋白的外排作用显著, 因而吲唑系列不再做深入研究。

4.2　再回到萘系列

化合物10的主要问题是过膜性差和易代谢性, 后者是羟基的Ⅱ相代谢所致, 因而合成了没有羟基的化合物16, 16的活性低于10, 但小鼠实验表明其代谢稳定性、过膜性和生物利用度优于10。为了确定优化活性的方向, 分析16与KRAS-G12C复合物晶体结构(图2), 一个重要特征是在哌嗪附近有个结构水分子与Thr58的羟基和Gly10的羰基同时形成两个氢键。因此, 若在哌嗪环上引入可发生氢键结合的基团, 代替结构水分子的氢键结合, 会提高化合物活性(二元复合物比三元的生成熵效应占优)。

4.3　哌嗪环连接羟烷基或氰烷基

为此, 将羟烷基或氰烷基连接在哌嗪环的2或3位, 合成的代表性化合物列于表4。结果表明, 羟甲基或羟乙基无论在哌嗪的2或3位(17~20) 活性与16基本相同, 提示羟基未能履行结构水的氢键介导作用。2-氰甲基21 (消旋体) 的活性显著增强, 高于16大约300倍, 拆分成光活体, S-21强于R-21大约100倍。然而3-氰甲基(22) 活性近于16。氰基除介导形成氢键外, 拉电子性增强了丙烯酰胺的亲电性, 加速了亲核加成的速率, 例如16与谷胱甘肽的共价结合消耗的t_1/2 = 17 h, 而S-21和R-21的t_1/2分别为4和1 h。

4.4　化合物S-21进一步优化

化合物S-21体外实验表明有许多优良性质(数据省略), 但肝脏提取率(ER) 达90%, 过膜性也只有中等程度, 需要进一步优化。S-21与KRAS^G12C复合物单晶衍射分析提示, 在萘环结合腔8位处尚有结合的空间(图3中箭头所示)。

为此, 合成了8-取代的化合物, 结构与活性列于表5。8-甲氧基(23) 和8-氰基(24) 活性低于S-21, 而27和28活性强于S-21大约10倍。

4.5　丙烯酰胺片段的优化

化合物27和28具有很高活性, 却在血循环中都有与谷胱甘肽结合的缺点, 文献报道取代的丙烯酰胺与无取代的丙烯酰胺比较, 较少与谷胱甘肽结合(Zhao B, Xiao Z, Qi J, et al. Design, synthesis and biological evaluation of AZD9291 derivatives as selective and potent EGFRL858R/T790M inhibitors. Eur J Med Chem, 2019, 163, 367-380), 于是下一步是修饰丙烯酰胺片段。反复比较了27和28的体外和小鼠的PD/PK, 27稍胜一筹(数据从略), 故对27进行亲电基团的修饰。合成的化合物列于表6。表中的全血细胞稳定性是测定小鼠/犬/人的全血与定量的受试物温孵, 不同的时间点, 用LC/MS/MS测定谷胱甘肽与受试物结合量, 计算化合物的半衰期。

结果表明, α碳引入氟原子(29) 由于与双键发生p-π共轭, 部分抵消了氟原子的拉电子效应, 虽然抑制细胞活性有所降低, 但对小鼠/犬/人全血中的稳定性显著增加, 半衰期大于50 h。α碳连接甲氧基的化合物30没有活性, 31和32的细胞活性略强于29, 但血液中稳定性低。

5　候选物的确定和阿达雷塞的批准上市

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进一步测定/计算化合物29的参数(表7), 达到了成药性的基本条件, 确定为候选化合物, 定名为阿达雷塞(adagrasib) (Fell JB, Fischer JP, Brian R, et al. “Identification of the clinical development candidate MRTX849, a covalent KRAS^G12C inhibitor for the treatment of cancer.” J Med Chem, 2020, 63: 6679-6693)。

经临床前系统研究和临床试验, 阿达雷塞具有长达24 h的半衰期和广泛的组织分布, 而且能够穿过血脑屏障, 有助于最大限度地发挥药物效力。2022年6月FDA授予它突破性疗法认定, 用于治疗携带KRAS^G12C突变的经治非小细胞肺癌患者。此外, 对结直肠癌及其他实体肿瘤的治疗也展现出良好的疗效, 成为继索托雷塞(sotorasib) 之后第二款获批上市的KRAS抑制剂。

6　阿达雷塞(29) 的结合模式

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分析图4阿达雷塞与KRAS^G12C复合物单晶表明, Cys12的硫原子与丙烯酰胺的β-碳形成共价键, 键长1.65 Å。复合物有多个氢键结合: 包括Lys16的NH₂与丙烯酰胺的C=O之间; His95环上的NH与嘧啶环的N1之间; 氰基N与Gly10骨架的NH之间(代替了以前化合物结合的结构水), 而且使Thr58的χ1角从原来与化合物16结合时的65°转成-53°, 从而使侧链的羟基与Val8骨架C=O之间形成了氢键。四氢吡咯的N⁺与Glu62的COO^-形成静电引力; 8-氯萘基占据Val9、Met72、Phe78、Tyr96、Ile100和Val103组成的疏水腔, 发生疏水-疏水相互作用。

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2025年第60卷第7期

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首发时间：2026-09-20
出版时间：2025-07-12

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中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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Compd.	R	POC (3 h, 5 μmol·L^-1)	H368 IC₅₀/μmol·L^{-1 a}
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