药学学报

Group	Particles size/nm	Polydispersity	Zeta potential/mV	Drug loading/%
HMSN	192 ± 2.6	0.005 ± 0	-32 ± 5.7	-
LHMSN-DOX	210 ± 1.3	0.071 ± 0.048	+27 ± 8.1	43.5
LHMSN-DOX/miR-375	262 ± 13.4	0.254 ± 0.03	+12 ± 9.3	-

Group	Particles size/nm	Polydispersity	Zeta potential/mV	Drug loading/%
HMSN	192 ± 2.6	0.005 ± 0	-32 ± 5.7	-
LHMSN-DOX	210 ± 1.3	0.071 ± 0.048	+27 ± 8.1	43.5
LHMSN-DOX/miR-375	262 ± 13.4	0.254 ± 0.03	+12 ± 9.3	-

脂质-中空介孔硅联合递送盐酸多柔比星及miR-375治疗肝癌的研究

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喻兆阳 ¹^,²^,# , 薛慧颖 ¹^,# , 裘琳 ¹ , 刘异 ¹ , 李娟 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2019,54(1): 151-158

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药学学报 | 研究论文 2019, 54(1): 151-158

脂质-中空介孔硅联合递送盐酸多柔比星及miR-375治疗肝癌的研究

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喻兆阳¹^,²^,#, 薛慧颖¹^,#, 裘琳¹, 刘异¹, 李娟¹^,^*

作者信息

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部, 湖北武汉 430030

2.华中科技大学同济医学院药学院, 湖北武汉 430030

通讯作者:

*李娟, Tel:86-27-69378114, E-mail:lijuan@tjh.tjmu.edu.cn

Delivery of miR-375 and doxorubicin hydrochloride by lipid bilayer coated hollow mesoporous silica nanoparticles for liver cancer therapy

Zhao-yang YU¹^,², Hui-ying XUE¹, Lin QIU¹, Yi LIU¹, Juan LI¹^,^*

Affiliations

1. Department of Pharmacy, Tongji Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

2. School of Pharmacy, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

出版时间: 2019-01-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2018-0747

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摘要

收起

本文旨在构建一种全新的脂质-中空介孔硅纳米载体（lipid bilayer coated hollow mesoporous silica nanoparticles，LHMSN）以联合递送基因药物与化疗药物，从而增强抗肿瘤药物对肝癌细胞的抑制活性。以盐酸多柔比星（doxorubicin hydrochloride，DOX）为模型药物，改良StÖber法合成中空介孔硅空载体，利用脂质体融合原理，制备共载DOX和miR-375的脂质-中空介孔硅纳米载体（lipid bilayer coated mesoporous silica nanoparticles loaded with DOX and miR-375，LHMSN-DOX/miR-375），并对纳米粒的形态、粒径、表面电位、载药量和体外释放度进行表征。同时考察纳米载体在人肝癌细胞（HepG2）中的摄取效率并进一步考察其对细胞活性和细胞迁移侵袭的抑制作用。结果表明，LHMSN-DOX/miR-375核壳结构清晰，外层脂质膜完整，内部HMSN介孔结构有序，平均粒径为（262 ±13.4）nm，具有一定的pH响应性，且LHMSN可有效将DOX和miR-375同时携带入胞。LHMSN-DOX/miR-375可显著抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡。

关键词

多柔比星 / miR-375 / 药物递送系统 / 中空介孔硅 / 纳米载体

Abstract

收起

This study was designed to prepare a novel lipid bilayer coated hollow mesoporous silica nanocarrier for co-delivery of gene drugs and chemotherapeutic drugs to enhance the inhibitory activity of antitumor drugs in hepatoma cells. Hollow mesoporous silica was synthesized by modified StÖber method. Lipid-fusion principle was used to prepare lipid-hollow co-loaded doxorubicin (DOX) and miR-375 (LHMSN-DOX/miR-375). Meanwhile, the morphology, particle size, surface potential, drug loading and release were characterized in vitro. The inhibition of cell proliferation, cell migration and invasion was then evaluated. The results indicated that the core-shell structure of LHMSN-DOX/miR-375 was clear with an intact outer lipid membrane and an ordered internal HMSN mesoporous structure. The drug release amount was pH responsive while the drug was rapidly released under simulated intracellular acidic conditions relative to normal physiological environment. Compared with free DOX, LHMSN-DOX/miR-375 can deliver DOX and miR-375 to liver cancer cells and inhibit the proliferation, migration and invasion of cells more effectively.

Key words

doxorubicin / miR-375 / drug delivery system / hollow mesoporous silicon / nanocarrier

引用本文

喻兆阳, 薛慧颖, 裘琳, 刘异, 李娟. 脂质-中空介孔硅联合递送盐酸多柔比星及miR-375治疗肝癌的研究. 药学学报, 2019 , 54 (1) : 151 -158 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2018-0747

Zhao-yang YU, Hui-ying XUE, Lin QIU, Yi LIU, Juan LI. Delivery of miR-375 and doxorubicin hydrochloride by lipid bilayer coated hollow mesoporous silica nanoparticles for liver cancer therapy[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2019 , 54 (1) : 151 -158 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2018-0747

正文

收起

肝癌是一种高度恶性肿瘤疾病。据统计, 2015年我国约有46.61万例新发肝癌病例和42.21万例死亡病例, 其发病率排名前五, 是一种死亡率较高的常见肿瘤疾病^[1]。纵观肿瘤治疗领域, 最主要的最有效手段依然是化学药物治疗。然而, 大部分化疗药物的静脉给药极易造成肿瘤细胞的多药耐药性, 更加不幸的是, 肿瘤外包被的紧密细胞基质在药物递送的血管灌注中起到了重要的屏障作用^{[2, 3]}。因此, 如何减轻肿瘤化疗药物的毒副作用, 提高肿瘤药物的靶向性, 增加其抗肿瘤的疗效已成为临床上亟待解决的问题。

另一方面, 微小非编码RNA (microRNA, miRNA)的发现为基因治疗领域开启了一扇新的大门。它可以作为基因表达的主调控因子, 在许多癌症中的启动和进展中扮演着关键的角色。在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中, miR-375的异常调节也涉及多种肿瘤发生的各个方面, 包括肝腺瘤、肝硬化和肝癌发展的不同阶段^{[4, 5]}。本课题组及其他已报道相关研究表明, miR-375主要通过抑制下游YAP-1、AEG-1、ATG7等基因的表达而抑制肿瘤的进一步发生^{[6, 7]}。因此, miR-375对于肝癌的替代治疗是一个较理想的靶点。然而, miR-375作为一种基因药物需要借助合适的载体才能进入细胞发挥抗肿瘤效应。

近年来, 基于纳米载体的药物治疗优势不断凸显, 科学家们已经研究出不同种类的药物递送系统, 为此纳米材料的选择尤为重要。通过化学合成的介孔材料被认为是一种十分有前景的智能纳米药物载体^{[8, 9]}。功能性的中空介孔硅由于其独特的结构特点, 如高度均匀可控的介孔孔道、稳定的化学性质、良好的结构耐用性和优良的热稳定性, 使其成为理想的功能性容纳药物的载体材料^[10−13]。鉴于肿瘤的发生发展是多因素影响的结果, 因此联合不同作用机制的化疗药物与具有特异性的基因药物进而达到最佳治疗效果, 成为肿瘤治疗的新理念。现已有多项研究成功制备了低毒、可控、稳定和靶向的共载药纳米给药体系^[14]。本文以抗肿瘤药物盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride, DOX)为模型药物, 设计了一种全新的脂质体包被的中空介孔硅纳米材料(LHMSN), 为化疗药物与基因药物在肝癌治疗中的联合应用提供一定的研究基础。

材料与方法

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药品和仪器 JEM-2100型透射电镜(日本JEOL公司); UV 160U紫外-可见光分光光度计(日本Shimadzu公司); Zeta Plus光动力散射仪(美国Brookhaven Instruments公司); BD FACS C6型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司); Multiskan GO全波长酶标仪(美国Termo Scientific公司); 荧光倒置显微镜(日本Olympus公司); Western blot及转膜设备(美国BioRad公司); Micromeritcs ASAP2010比表面孔径分布测定仪(美国Boynton Beach公司)。

DOX原料药(> 99.8%, 商水生物科技有限公司); 正硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS, 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); 氯化十六烷基三甲基铵(cetyltrimethylammonium chloride, CTAC, 25 wt%)、胆固醇(cholesterol, CHOL) (美国Sigma Aldrich公司); 二油酰基三甲胺丙烷甲基硫酸盐(DOTAP, 美国Alabaster公司); DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司); 碘化丙啶(propidium iodine, PI)、MTT、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术公司); miR-375按照5'-CCCGCGACGAGCCCCUCGCACAA AACGC-3'和5'-GCGUUUUGUUCGUUVGGCUCGC GUGAGG-3'序列由广州锐博公司合成, 其他试剂均为分析纯。

细胞模型 人肝癌HepG2细胞株、Hep3B细胞株和Huh7细胞株均来自中国典型培养物保藏中心。所有人肝癌细胞株培养于含10%胎牛血清DMEM培养液中, 在37 ℃、5% CO₂孵箱中孵育, 每1~2天更换1次培养液。

中空介孔硅(HMSN)的合成 本研究对介孔硅经典StÖber合成法^[6]进行改良从而合成中空介孔硅, 其方法主要分为3个步骤。①合成模板dSiO₂:将TEOS 1 mL、超纯水5 mL、氨水0.8 mL加入至35.7 mL乙醇中搅拌1.5 h形成乳白色dSiO₂, 洗涤并用水重悬备用。②合成SiO₂@MSN:取2 g CTAC (8 mL)、TEA 20 mg、dSiO₂ 10 mL溶解于20 mL超纯水室温搅拌1 h后降温至80 ℃, 再加入TEOS 0.15 mL继续搅拌1 h。③合成HMSN:上述混合液加入Na₂CO₃ 636 mg, 50 ℃反应1.5 h。离心收集沉淀, 用1 wt% HCl室温洗涤除去CTAC并用水重悬。

HMSN-DOX的制备 精密量取1 mg·mL⁻¹ HMSN纳米粒水溶液9 mL, 在剧烈搅拌中加入10 mg·mL⁻¹ DOX水溶液1 mL, 超声2 min, 继续搅拌24 h。制备HMSN-DOX纳米粒离心去除上清, 加入超纯水1 mL离心洗涤至上清无色, 最后加超纯水1 mL重悬用。

LHMSN-DOX/miR-375的制备 DOTAP 61.92 mg、CHOL 42.6 mg、DSPE-PEG 28 mg于茄型瓶中, 用10 mL氯仿溶解, 45 ℃水浴旋蒸成膜30 min, 水化挤压得清透均一的脂质体溶液。将制备的HMSN和脂质体(5 mg·mL⁻¹)等体积混合再吹打, 室温下伴随震荡混合1 h, 离心除去额外的脂质体并分散在磷酸盐缓冲液(PBS)中即得LHMSN^[15]。制备的LHMSN-DOX按照所需浓度与miR-375涡旋混合即得LHMSN-DOX/miR-375, 使用前现配现用。

水合粒径及zeta电位的测定 取HMSN及LHMSN适量, 采用Zeta Plus粒度电位测定仪于25 ℃测定样品颗粒水合粒径大小、zeta电位值、各自多分散指数(polydispersity index, PDI)和SD值并记录。

表面形态观察 分别取HMSN、LHMSN-DOX样品10 μL轻轻滴到铜网吸附30 min。用干净的滤纸将多余的液体吸弃, 置于透射电镜下观察纳米粒形态(华中科技大学分析测试中心检测)。

载药量的测定 采用紫外分光光度法。取上述制备好的HMSN-DOX 100 μL于5 mL EP管中, 加入4%氢氟酸100 μL混合均匀, 40 ℃反应过夜, 将HMSN中DOX完全释放, 采用紫外480 nm处测定吸光度(A), 从而得到100 μL中DOX载药量(DL)。DL = W_DOX/(W_DOX+W_HMSN), 其中W_DOX为DOX含量; W_HMSN为HMSN总量。

体外释放度实验 体外DOX释放实验采用透析法, 将LHMSN和HMSN溶液(相当于DOX 2 mg)放入具有1/3气隙的预处理的透析袋中密封, 然后将透析袋分别分散在pH 7.4和5.0的10 mmol·L⁻¹ PBS 30 mL中, 并在黑暗环境中持续搅拌。采用UV分光光度计于1、3、5、6、8、12、20、24、30、48和72 h检测PBS中DOX的浓度。

琼脂糖凝胶电泳实验 配制含有Goldview染色试剂浓度为1% TAE缓冲液的琼脂糖凝胶, 将miR-375或LHMSN-DOX/miR-375 (miRNA剂量为50 pmol)上样, 以电压160 V电泳50 min。使用UV透射仪和数字成像系统(Life Science Technologies, USA)拍照。

细胞荧光摄取实验 将HepG2细胞接种于12孔板中, 培养24 h, 分别加入LHMSN-DOX/miR-375溶液和游离DOX水溶液1 μL (DOX质量浓度为1 μg·mL⁻¹)继续培养0.5 h或8 h, 除去培养基, 洗涤。用4%多聚甲醛溶液固定细胞, 以DAPI染核并用PBS清洗, 于荧光倒置显微镜下观察HepG2细胞的摄取情况。

溶血实验 收集新鲜的血液样本10 mL, 离心(1 500 r·min⁻¹, 10 min, 4 ℃), 洗净, 以Dulbecco的磷酸缓冲盐水(DPBS)重悬得25×10⁸的红细胞5 mL。将4 mL的HMSN、LHMSN和25 kDa聚乙烯亚胺(PEI 25K)分别与同体积红细胞37 ℃孵育1 h。1%的Triton X-100和DPBS分别为阳性和阴性对照。离心分离后(1 500 r·min⁻¹, 10 min, 4 ℃), 使用酶标仪于541 nm下检测A值, 并计算溶血率(HL), 公式如下: HL=(A_样品-A_阴性组)/(A_阳性组-A_阴性组)。

体外抗肿瘤活性检测 采用MTT法检测制剂体外抗肿瘤活性。将HepG2细胞接种在96孔板中, 密度为5×10³个/孔, 待细胞贴壁后, 分别加入含DOX终质量浓度为0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5和10 μg·mL⁻¹的DOX、LHMSN-DOX和LHMSN-DOX/miR-375培养基各1 μL, 培养36 h, 加入MTT检测液, 用酶标仪测定490 nm波长处的A值。

流式细胞分析 在6孔板中, 每孔接种4×10⁵个HepG2细胞。贴壁后加入DOX终质量浓度为50 ng·mL⁻¹、miR-375为100 nmol·L⁻¹的游离DOX、LHMSN/miR-375、LHMSN-DOX和LHMSN-DOX/miR-375, 进行培养, 36 h后收集细胞并离心, 用生理盐水冲洗细胞2次, 加入结合缓冲液100 μL, FITC Annexin V和PI各5 μL, 在室温(约25 ℃)条件下孵育30 min, 最后用BD Accuri C6流式细胞仪检测。

肿瘤细胞划痕实验 将HepG2细胞接种于24孔板中, 每孔密度为5×10⁵个细胞。在无菌环境中, 用200 μL移液管尖划过孔底造成垂直伤口。分别加入含DOX、HMSN-DOX、LHMSH-DOX和LHMSH-DOX/miR-375的新鲜培养基分别在0和24 h于显微镜下观察^[5]。

细胞transwell侵袭实验 采用transwell小室(直径6.5 mm, 孔径8 μm, 美国康宁公司)进行迁移侵袭实验。在迁移实验中, 将5×10⁴个HepG2细胞接种于含有DOX、HMSN-DOX、LHMSH-DOX和LHMSH-DOX/miR-375的上层无血清培养基中。含10%血清和相同浓度药物的培养基加入上下层小室。培养24 h后, 用棉签擦去上腔的非移行细胞, 其余用4% PFA固定15 h, 然后用1%结晶紫溶液染色, 用显微镜观察计数^[5]。

蛋白免疫印记实验 培养6孔板中上述的细胞至70%~80%铺满状态, 按照DOX质量浓度为200 ng·mL⁻¹, miR-375为100 nmol·L⁻¹给予4种不同的制剂(DOX水溶液、HMSN-DOX、LHMSH-DOX和LHMSH-DOX/miR-375)培养36 h, 刮下6孔板中的HepG2细胞加入细胞裂解液置于冰上裂解, 离心, 取上清液。在10%丙烯酰胺凝胶中细胞裂解物电泳分离后转移到PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭1 h, 分别孵育Bax、cleaved caspase-3、Bcl2、AEG-1和YAP-1抗体4 ℃过夜。然后将膜在含有0.1% Tween 20 PBST中洗涤3次, 孵育二抗1 h, 将膜洗涤4次, 并通过ECL发光底物曝光显影, 以β-actin作为内参。

统计学方法 使用Graphpad Prism 6.0软件对所有数据进行统计学分析, 实验所有数据以均数±标准差$\bar{x}\pm s$表示。统计方法采用双侧t检验, P < 0.05为显著性差异。如果数据不符合正态分布, 则采用F检验。

结果

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1 纳米载体的制备与表征

共载miR-375与DOX脂质−中空介孔硅纳米粒(LHMSN-DOX/miR-375)的制备与结构示意图见图 1。水合粒径及zeta电位测量结果见表 1。每个样品检测5次算其平均值, 水合粒径为192 nm, PDI指数0.005, 且zeta电位值在-32 mV附近, 说明合成的HMSN纳米粒具有高度的均一性和稳定性。脂包被后纳米粒径显著上升, 初步证明HMSN表面成功包裹了磷脂, 同时PDI的上升是由于溶液中可能还有一小部分表面没有包上磷脂的HMSN, 但PDI在此小范围内上升并不会影响纳米粒的稳定性。而电位的翻转是由于表面的阳离子磷脂带正电荷, 包裹之后即掩盖了HMSN本身的电荷属性, 这也进一步验证了HMSN表面成功包裹上磷脂, 而这一正电荷值依旧维持在稳定的电位范围内, 即显示LHMSN为稳定的纳米粒。在偶联miR-375后, 由于核酸的负电性, 电位值呈现微弱的降低, 表明该纳米粒表面的磷脂能够很好地偶联核酸药物。

透射电镜结果见图 2A, 在200 kV的TEM拍摄下, 可见HMSN呈现球形, 有很好的均一性和分散性, 表面可见明显的中空及介孔结构, 平均粒径在60 nm左右。脂包被后能看到纳米粒表面一层明显的5 nm左右的脂质层结构, 说明此法能够稳定地制备出脂质-HMSN (LHMSN)。而将制备出的纳米粒10 000 r·min⁻¹离心5 min后发现上清液清透色浅, 而超声后又能很好地均匀分散, 说明制备的脂质HMSN纳米粒能高效地将DOX包载进空腔内部, 体现了制备的LHMSN-DOX系统纳米粒的优良载药特性。

2 LHMSN-DOX体外释放体现出pH敏感性

鉴于肿瘤的微酸环境(pH 5.0~6.5), 本实验在体外模拟了生理环境(pH 7.4)和肿瘤的微环境(pH 5.0)条件以考察DOX的释放特征。如图 2B, 相比于pH 7.4时, 在pH 5.0条件下, LHMSN-DOX中DOX的释放速度明显增大, 并且同等酸性条件下, 没有脂包被结构的HMSN-DOX释放速率低于LHMSN-DOX, 这提示LHMSN-DOX存在一定的酸依赖性, 在肿瘤组织中有较快释放。尽管该释药系统并没有特意设计pH敏感这一特性, 但是脂质材料在酸性条件下更易降解, 这与已报道的文献^[10]中脂包被纳米粒中脂质层本身即具有一定的pH响应性一致。因此, 一方面脂质膜可以有效保护包载的药物, 减少制剂到达肿瘤前的泄漏; 另一方面, 脂质核/壳纳米粒的pH敏感性使得药物实现在胞内的迅速释药, 发挥药效。

3 LHMSN-DOX能够有效地偶联miR-375

该实验用来验证miR-375是否成功载到纳米粒表面, 如图 3所示。游离的miR-375全部从上样孔迁移至正极, 且背景很干净。而当质量比为200:1(miR-375:LHMSN-DOX)时, 条带上只能看到微弱的亮度而大部分残留在上样孔, 但是随着质量比的降低, 残留量明显减小, 说明LHMSN-DOX能够有效地将miR-375偶联并在200:1时达到最大载药比。

4 LHMSN-DOX/miR-375可以携带两种药物进入肿瘤细胞

在HepG2细胞中观察其对药物的摄取情况, 使用荧光显微镜在200倍放大的条件下对其进行观察。紫光激发下发出蓝色的DAPI光, 绿光激发下发出FAM标记的miR-375的绿光, 蓝光激发下发出DOX的红光, 同一个颜色激发下不同时间点选用同样的曝光时间, 这样确保在分析时间依赖性摄取差异的过程中避免人为因素的影响。拍摄的图片使用Photoshop进行分析并merge组图, 在0.5 h时DOX和miR-375就能够达到比较好的摄取量, 且随着时间延长(8 h), 摄取量呈显著上升趋势(图 4)。说明该纳米粒在摄取方面有很强的能力并且能够达到比较高的携带效率。此外, 叠加后的图片也显示出很好的一致性。表明制备的LHMSN-DOX/miR-375可以成功携带两种药物进入肿瘤细胞。

5 纳米载药体系具有良好的生物相容性

静脉注射药物应对其生物相容性进行评估以确保对红细胞没有毒性。通过使用不同浓度的载体与红细胞共孵育, 然后测量血红蛋白释放到上清液中的量以评价载体的溶血率。PBS和Triton X-100作为阴性(0%血红蛋白释放)和阳性对照(100%血红蛋白释放)。PEI 25K为已知的具有显著溶血性的阳离子聚合物。由图 5A表明, 在不同浓度下HMSN和LHMSN的血红蛋白释放极低, 提示该纳米载药体系具有良好的安全性, 无不良反应。

6 纳米药物的体外抗肿瘤活性及流式细胞分析

检测游离DOX、LHMSN、LHMSN-DOX/miR-375对HepG2、Huh7和Hep3B细胞增殖的抑制作用。如图 5B所示, 处理48 h后, 空白载体在高浓度时不会对细胞产生毒性, LHMSN与DOX对HepG2、Hep3B和Huh7细胞的细胞毒性相当, 但与LHMSN-DOX或DOX相比, LHMSN-DOX/miR-375的细胞毒性更高。这表明, 负载于LHMSN内部后并未降低DOX本身的增殖抑制效果, 而由于miR-375的加入, 这一抑制效果显著提高, 并且随着浓度增大抑制增强。即将miR-375与DOX共载入LHMSN显著增强了抗肿瘤活性, 证明DOX与miR-375之间具有协同效应。

采用Annexin V/PI双染法标记细胞, 流式细胞术检测细胞凋亡情况, 细胞被分为4个区域(图 5C): Q1、Q2、Q3和Q4, 分别代表坏死细胞、晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞和活细胞。结果显示:处理细胞36 h后, 游离DOX凋亡率为19.31% (Q2+Q3), LHMSN-DOX的凋亡率为18.47%, 说明药物进入载体后完全释放, 同样能够很好地发挥抗肿瘤的目的。而在联合使用miR-375后, LHMSN-DOX/miR-375载体诱导细胞的早期凋亡率为28.89%, 细胞凋亡率明显增高。进一步表明, miR-375和LHMSN-DOX具有协同效应, 与MTT结果一致。

7 LHMSN-DOX/miR-375对HepG2迁移和侵袭能力的影响

划痕实验结果如图 6显示, DOX、LHMSN-DOX和LHMSN-DOX/miR-375处理后迁移率分别为22%、20%和9%。与对照组相比, LHMSN-DOX/miR-375能显著降低HepG2细胞迁移。在Transwell实验中, DOX、LHMSN-DOX和LHMSN-DOX/miR-375对HepG2细胞侵袭结果如图 6所示, 与DOX (44%)相比, LHMSN-DOX (37%)显著降低HepG2细胞侵袭, 而LHMSN-DOX/miR-375 (22%)对HepG2细胞侵袭进一步降低。表明纳米化的DOX载药系统能够降低细胞的迁移和侵袭力, 在miR-375协同下抑制效果显著增强。

8 蛋白水平检测LHMSN-DOX/miR-375对HepG2的影响

Western blot实验表明(图 7), 在HepG2细胞中, LHMSN-DOX对cleaved caspase-3、Bax和Bcl2三种凋亡蛋白表达的影响相对高于DOX组。这表明负载于LHMSN内部的DOX释放后可以有效诱导肝癌细胞凋亡。而LHMSN-DOX/miR-375组与DOX和LHMSN-DOX组相比则显著增加了Bax和cleaved caspase-3并降低了Bcl2的表达。且对miR-375下游基因AEG-1和YAP1产生了显著的抑制作用。这表明由LHMSN-DOX/ miR-375递送的DOX可以有效递送外源miR-375发挥内源性miR-375作用, 且由于DOX的存在发挥协同作用使凋亡进程大大增强。

讨论

收起

本研究制备了脂包被中空硅纳米粒共载DOX和miR-375系统, 中空介孔硅表面具有密集分布的介孔、内部空隙巨大及独特的释放药物性质的优点, 同时还兼具有脂质体良好的生物相容性的优势^[16]。相比普通介孔材料, 脂质-中空介孔硅纳米粒可以达到很高的载药量, 减少药物的泄漏, 使药物在肿瘤部位聚集。介孔硅表面的脂质材料可以轻松地将基因药物miR-375通过静电吸附作用荷载上去, 进而达到共载药的目的。

本研究中, 同等条件下脂包被后的纳米粒LHMSN释药速度显著降低, 这可能是由于脂质双分子层作为纳米粒的控制阀, 为药物泄露增加了一道屏障。同时, 脂质双分子层由于介孔氧化硅的支撑, 提高了其物理稳定性, 减少制剂到达肿瘤前的泄漏。脂包被纳米粒在低pH条件下释放速度加快, 体现出一定的酸敏感性, 由于酸性条件下脂质层更容易被破坏进而释放出DOX, 这与肿瘤的微酸环境相适应, 使得药物实现在肿瘤细胞内的集中释放, 发挥药效^[10]。这一特性可以有效提高治疗效率且降低组织毒性。

电泳结果显示, 在达到合适比例时脂包被纳米粒可以最大限度地将miR-375吸附于纳米粒表面。进一步荧光摄取图片证实共载药纳米系统能同时将DOX和miR-375递送入胞且随时间延长摄取量显著增加。MTT结果证实共载药纳米系统对肿瘤细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性。同一条件下, 与游离的DOX相比, LHMSN-DOX/miR-375呈现出更高的细胞增殖抑制率, 可以推测LHMSN-DOX/miR-375可能通过分子水平的双重作用增加了细胞增殖抑制效应。

肿瘤细胞的迁移和侵袭与肿瘤不良的预后、极高死亡率密切相关。因此, 开发新型药物递送系统降低其转移与死亡率迫在眉睫。而本研究中设计的纳米药物递送系统LHMSN-DOX/miR-375被证实能够有效降低HepG2细胞的迁移和侵袭能力, 具体的作用机制还有待于进一步研究^[17]。

Western blot实验表明, 共载药系统对DOX下游凋亡信号Bax、cleaved caspase-3、Bcl2和miR-375下游基因AEG-1的表达均存在一定的抑制作用, 且LHMSN-DOX/miR-375组显著高于其他组。表明共载药系统在蛋白表达水平的抑制作用使两种药物发挥协同抗肿瘤效应。

已知Bax、cleaved caspase-3和Bcl2为DOX作用靶点^[18], 同时cleaved caspase-3和Bcl2为miR-375下游基因AEG-1的靶点。故研究中推测DOX和miR-375同时作用可引起细胞凋亡的发生。流式细胞实验也证实, LHMSN-DOX/miR-375通过协同引起肝癌细胞凋亡。

本研究表明, LHMSN-DOX/miR-375作为抗肿瘤药物的智能药物传递系统具有一定的应用前景。然而, 该阶段仅限于体外初步实验, 其体内抗肿瘤活性还有待进一步探索, 同时其肿瘤组织靶向性及对耐药细胞的作用也值得研究与探索。

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参考文献引证文献

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[1]

Chen

, Zheng

, Baade

et al . Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66: 115-132.

https://doi.org/10.3322/caac.21338

[2]

Wang

, Xu

, Chan

et al . Nanoparticle-mediated inhibition of survivin to overcome drug resistance in cancer therapy[J]. J Control Release, 2016, 240: 454-464.

https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2016.04.018

[3]

Oda

, Uto

, Mawatari

et al . Clinical features of hepatocellular carcinoma associated with nonalcoholic fatty liver disease:a review of human studies[J]. Clin J Gastroenterol, 2015, 8: 1-9.

https://doi.org/10.1007/s12328-014-0548-5

[4]

Tao

, Ji

, Li

et al . Distinct anti-oncogenic effect of various microRNAs in different mouse models of liver cancer[J]. Oncotarget, 2015, 6: 6977-6988. http://cn.bing.com/academic/profile?id=3e4db8cb03f63c735f7a9a8ec85ea1f2&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn

[5]

Xue

, Liu

, Liao

et al . Gold nanoparticles delivered miR-375 for treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2016, 7: 86675-86686. http://cn.bing.com/academic/profile?id=e9b62baa2914eaca526f3f17e7174cfa&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn

[6]

, Chang

, Meng

et al . MicroRNA-375 targets AEG-1 in hepatocellular carcinoma and suppresses liver cancer cell growth in vitro and in vivo[J]. Oncogene, 2012, 31: 3357-3369.

https://doi.org/10.1038/onc.2011.500

[7]

Wang

, Lieberman

, Pan

et al . miR-375 induces docetaxel resistance in prostate cancer by targeting SEC23A and YAP1[J]. Mol Cancer, 2016, 15: 70.

https://doi.org/10.1186/s12943-016-0556-9

[8]

Chen

, Hong

, Shi

et al . Engineering of hollow mesoporous silica nanoparticles for remarkably enhanced tumor active targeting efficacy[J]. Sci Rep, 2014, 4: 5080. http://cn.bing.com/academic/profile?id=f7ec9a0b18f66edc6a2e44f94d2d3aa4&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn

[9]

Chen

, Chen

, Guo

et al . Hollow/rattle-type mesoporous nanostructures by a structural difference-based selective etching strategy[J]. ACS Nano, 2010, 4: 529-539.

https://doi.org/10.1021/nn901398j

[10]

, Zhang

, Guo

et al . Preliminary study on pH-sensitive lipid bilayer-coated mesoporous silica nanoparticles as a novel drug carrier for antitumor drug[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48: 291-297. http://www.yxxb.com.cn:8081/aps/CN/abstract/abstract14407.shtml

[11]

Fei

, Tao

, Song

et al . Advance in research of biodegradable mesoporous silica nanoparticles[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2018, 53: 716-726. http://www.yxxb.com.cn:8081/aps/CN/abstract/abstract17160.shtml

[12]

Deng

, Su

, Huang

et al . Co-delivery of paclitaxel and cyclosporine by a novel liposome-silica hybrid nano-carrier for anti-tumor therapy via oral route[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2014, 49: 106-114. http://www.yxxb.com.cn:8081/aps/CN/abstract/abstract6593.shtml

[13]

, Tao

, Yang

et al . Preparation of mesoporous silica nanoparticles in different pore size and its use in the solidification of sirolimus loaded self-microemulsifying drug delivery system[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2017, 52: 985-991. http://www.yxxb.com.cn:8081/aps/CN/abstract/abstract16727.shtml

[14]

, Chiang

, Li

et al . Multifunctional nanocarriers for simultaneous encapsulation of hydrophobic and hydrophilic drugs in cancer treatment[J]. Nanomedicine (Lond), 2014, 9: 1499-1515. http://cn.bing.com/academic/profile?id=1abbb25b575aebbde15e6d6805265b3c&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn

https://doi.org/10.2217/nnm.14.97

[15]

Liu

, Stace-Naughton

, Brinker

. Silica nanoparticle supported lipid bilayers for gene delivery[J]. Chem Commun (Camb), 2009, 34: 5100-5102. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=5e35527e08d314b1423aad8b842e5f4e

[16]

Tang

, Li

, Chen

. Mesoporous silica nanoparticles:synthesis, biocompatibility and drug delivery[J]. Adv Mater, 2012, 24: 1504-1534.

https://doi.org/10.1002/adma.201104763

[17]

Wang

, Chen

, Guo

et al . Silica nanoparticles suppress fibronectin-mediated adhesion and migration in normal human keratinocytes[J]. J Nanosci Nanotechnol, 2012, 12: 293-299.

https://doi.org/10.1166/jnn.2012.5127

[18]

Bao

, Yin

, Hu

et al . A safe, simple and efficient doxorubicin prodrug hybrid micelle for overcoming tumor multidrug resistance and targeting delivery[J]. J Control Release, 2016, 235: 182-194.

https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2016.06.003

2019年第54卷第1期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2018-0747

接收时间：2018-08-16
首发时间：2026-01-26
出版时间：2019-01-12

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收稿日期：2018-08-16
修回日期：2018-09-10

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作者信息

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部, 湖北武汉 430030

2.华中科技大学同济医学院药学院, 湖北武汉 430030

通讯作者:

*李娟, Tel:86-27-69378114, E-mail:lijuan@tjh.tjmu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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