药学学报

Gene	Description	Percentage of gene alterations	Mutation type
GNAQ	G protein subunit α q	50%	Missense mutation: activating hot spot mutations on Gln209 and Arg183^{[9, 13]}
GNA11	G protein subunit α 11	45%	Missense mutation: activating hot spot mutations on Gln209 and Arg183^{[9, 13]}
CYSLTR2	Cysteinyl leukotriene receptor 2	4%	Missense mutation^{[9, 38]}
EIF1AX	Eukaryotic translation initation factor 1A, X-linked	13%	Missense mutation and inframe mutation^[38]
SF3B1	Splicing factor 3b subunit 1	23%	Missense mutation^[38]
BAP1	BRCA1-associated protein-1	33%	Truncating mutation^[38]

Gene	Description	Percentage of gene alterations	Mutation type
GNAQ	G protein subunit α q	50%	Missense mutation: activating hot spot mutations on Gln209 and Arg183^{[9, 13]}
GNA11	G protein subunit α 11	45%	Missense mutation: activating hot spot mutations on Gln209 and Arg183^{[9, 13]}
CYSLTR2	Cysteinyl leukotriene receptor 2	4%	Missense mutation^{[9, 38]}
EIF1AX	Eukaryotic translation initation factor 1A, X-linked	13%	Missense mutation and inframe mutation^[38]
SF3B1	Splicing factor 3b subunit 1	23%	Missense mutation^[38]
BAP1	BRCA1-associated protein-1	33%	Truncating mutation^[38]

Gq突变在葡萄膜黑色素瘤中的作用及其抑制剂研究进展

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石硕 ¹ , 朱凯 ² , 熊小峰 ¹^,^* , 张小雷 ¹^,^*

药学学报 | 综述 2020,55(7): 1382-1392

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药学学报 | 综述 2020, 55(7): 1382-1392

Gq突变在葡萄膜黑色素瘤中的作用及其抑制剂研究进展

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石硕¹, 朱凯², 熊小峰¹^,^*, 张小雷¹^,^*

作者信息

1.中山大学药学院, 广东广州 510006

2.长春中医药大学, 吉林长春 130117

通讯作者:

*熊小峰, E-mail:xiongxf7@mail.sysu.edu.cn;

张小雷, Tel:86-20-39943021, E-mail:zhangxlei5@mail.sysu.edu.cn

Study of Gq mutations and their inhibitors in uveal melanoma

Shuo SHI¹, Kai ZHU², Xiao-feng XIONG¹^,^*, Xiao-lei ZHANG¹^,^*

Affiliations

1. School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China

2. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China

出版时间: 2020-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-0743

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摘要

收起

葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UM）是成人眼部最常见的恶性肿瘤，恶性程度极高，且目前尚无有效治疗手段，一旦发生转移生存期仅2~7个月。研究发现83%以上UM存在编码异源三聚体G蛋白的Gαq亚基（GNAQ）或编码异源三聚体G蛋白的Gαq11亚基（GNA11）互斥突变，其中95%以上的GNAQ/GNA11突变是大鼠肉瘤（rat sarcoma，RAS）样结构域209位谷氨酰胺（Q）定点突变为亮氨酸（L）或脯氨酸（P）。突变导致三磷酸鸟苷水解酶（guanine triphosphatase，GTPase）活性丧失并引起G蛋白持续活化。持续活化的G蛋白激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、Rho激酶（Ras homologue，Rho）/Rho相关激酶（Rho associated kinase，Rock）/Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）等信号通路是诱发UM的重要原因，因此靶向GNAQ与GNA11突变可能是治疗UM的全新策略。本文拟从G蛋白结构与功能、G蛋白突变与UM发生、GNAQ/GNA11小分子抑制剂的发现及其在UM中的抗癌活性等角度展开，以期为相关临床及基础研究提供参考。

关键词

葡萄膜黑色素瘤 / G蛋白 / GNAQ/GNA11 / G蛋白偶联受体 / 小分子

Abstract

收起

Uveal melanoma (UM) is one of most common ocular cancers and is extremely malignant; so far there is no effective treatment. Moreover, the survival period is only 2-7 months after metastasis. It has been proven that more than 83% of uveal melanomas harbor mutations in G protein subunit α q (GNAQ) or G protein subunit α 11 (GNA11), among which 95% are a Q209P/L single-site mutation. Q209P/L mutations lead to dysfunction of guanine triphosphatase (GTPase) in the G protein and result in constitutive activation of downstream pathways including mitogen-activated protein kinase (MAPK), phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT), Ras homologue (Rho)/Rho-associated kinase (Rock)/Yes-associated protein (YAP) and others. Therefore, targeting GNAQ/GNA11 mutations are potential strategies for UM treatment. This review will focus on roles of G protein mutations in UM progression, and the potential therapeutic effects of GNAQ/GNA11 inhibitors, and will provide insights into basic and clinical research on UM treatment.

Key words

uveal melanoma / G protein / GNAQ/GNA11 / G protein-coupled receptor / small molecule

引用本文

石硕, 朱凯, 熊小峰, 张小雷. Gq突变在葡萄膜黑色素瘤中的作用及其抑制剂研究进展. 药学学报, 2020 , 55 (7) : 1382 -1392 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-0743

Shuo SHI, Kai ZHU, Xiao-feng XIONG, Xiao-lei ZHANG. Study of Gq mutations and their inhibitors in uveal melanoma[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2020 , 55 (7) : 1382 -1392 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-0743

正文

收起

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)是成人眼部最常见的恶性肿瘤, 年发病率为1.3/10⁶~8.6/10⁶^[1], 约占眼部黑色素瘤的83%、占所有黑色素瘤的3%~5%^[2]。UM好发于脉络膜(90%)、睫状体(6%)和虹膜(4%)。针对UM的原位治疗主要包括保留眼球治疗(放疗和激光治疗等)和眼球摘除手术。经原位治疗后, 90%的UM响应良好, 但仍有50%患者在原位治疗后的1~15年内发生血行转移, 80%以上转移至肝脏并导致死亡, 一旦发生转移生存期仅2~7个月^[3]。针对转移性的UM可采用的有效治疗手段不足1%^[4], 包括化疗和靶向治疗在内的临床常用手段均未显著改善转移性UM患者生存期^{[1, 2, 5]}。临床常将皮肤性黑色素瘤(cutaneous melanoma, CM)治疗手段用于转移性UM探索性治疗^[4], 虽然以程序性细胞死亡1 (programmed cell death-1, PD-1)与程序性死亡配体1 (programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)相互作用为免疫检查点的阻断疗法在CM上疗效明显, 但在转移性的UM中, PD-1抑制剂纳武单抗(nivolumab, 商品名OPDIVO)和派姆单抗(MK-3475, 商品名Keytruda)在Ⅱ期临床中均无显著疗效^[6], 这可能与UM低肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB)和免疫抑制因子表达上调有关^[2]。有数据显示, 83%以上UM患者存在编码异源三聚体G蛋白的Gαq亚基(G protein subunit α q, GNAQ)或编码异源三聚体G蛋白的Gαq11亚基(G protein subunit α 11, GNA11)激活突变, 该突变是UM发生的致癌因素^{[7, 8]}。

UM致瘤信号通路具有复杂性, 在UM的临床治疗中, 常以G蛋白下游丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)、Rho激酶(Ras homologue, Rho)/Rho相关激酶(Rho associated kinase, Rock)/Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)等级联信号通路以及受体酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase, RTK)通路激活为依据开展靶向治疗^[9-14] (图 1)。据统计, 45%~86%的原发性UM肿瘤存在MAPK通路过活化^{[15, 16]}, G蛋白作为该通路上游调节分子通过经典的第二信使途径触发MAPK通路激活^[10]。当G蛋白发生突变活化时可直接与Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(Rho family guanine nucleotide exchange factor, RhoGEF)结合, 激活Rho/Rock信号通路, 促进F-肌动蛋白(F-actin)积聚、黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)磷酸化激活。F-actin通过竞争性结合促进YAP从无活性的胞质相关蛋白复合物中游离出来; FAK抑制YAP 127位丝氨酸(S)磷酸化, 促进YAP 357位酪氨酸(Y)磷酸化(YAP 127位丝氨酸磷酸化导致YAP失活, 357位酪氨酸磷酸化提高YAP稳定性和活性^[11]), 促进YAP转运至细胞核与转录因子TEAD (transcriptional enhanced associate domain)、SMAD (Smad protein)发生转录激活^[17]。经证实在多种癌细胞内, YAP激活可以诱导肿瘤干细胞特性, 促进肿瘤生长、转移、增强耐药性等^[18]。此外, G蛋白突变激活下游PI3K/AKT信号通路, 研究统计50%的UM存在PI3K/AKT信号通路过活化, 但在UM中该通路激活主要是由于RTK自分泌激活^[9]和紧张素同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)功能缺失^[12], 抑癌因子PTEN促进PIP3去磷酸化抑制PI3K/AKT通路激活^[12]。目前, 临床上已经评估了丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal regulated kinase, MEK)抑制剂(司美替尼、曲美替尼)、蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)抑制剂(AEB071)、PI3K抑制剂(BYL719)、RTK抑制剂(c-Kit抑制剂舒尼替尼、c-Met抑制剂卡博替尼)等对转移性UM的治疗效果^[19-21], 不幸的是, Khoja等^[22]回溯性分析近20年开展的29例针对转移性UM的Ⅱ期临床试验研究表明, 治疗组应答率普遍低于10%。因此, 针对转移性UM急需更为有效的治疗策略。G蛋白突变激活作为UM发生的关键, 其选择性抑制剂的发现提高了科研工作者将G蛋白作为药物研发靶点的信心^[23]。临床前研究证实, 选择性G蛋白抑制剂FR900359在G蛋白突变的UM细胞中具有良好的抗肿瘤效果^{[24, 25]}。因此, 靶向G蛋白突变的抑制剂开发可能是治疗UM极具前景的发展方向。

1 G蛋白的生理功能与突变激活

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G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)家族是一个庞大的细胞表面跨膜受体家族, 已经发现有800多个成员。GPCR参与内分泌和代谢等多种生理功能, 同时与肿瘤、免疫和心脏等重多疾病发生有密切联系, 是最重要的药物靶点之一, 目前靶向GPCR的药物占市售药物的20%~30%^{[26, 27]}。作为GPCR下游关键的分子开关, 鸟核苷酸结合蛋白(G蛋白)是一类对二磷酸鸟苷(guanine dinucleotide phosphate, GDP)和三磷酸鸟苷(guanine trinucleotide phosphate, GTP)有高度亲和力的膜内蛋白, 具有水解GTP为GDP的GTPase活性。G蛋白分为单体G蛋白(小G蛋白)和异源三聚体G蛋白复合物(大G蛋白)。大G蛋白由Gα (39~52 kDa)、Gβ (37 kDa)、Gγ (6~9 kDa) 3个亚基组成^{[28, 29]} (图 2)。

1.1 G蛋白的活化周期与生理功能

G蛋白的活化呈周期样循环, 在非活化状态下Gα亚基与GDP结合, 维持G蛋白以异源三聚体(Gαβγ)形式与GPCR形成复合体(图 2a)。当上游GPCR受到外界刺激并通过构象变化将信号传递给G蛋白后, GTP取代GDP (图 2b)^{[30, 31]}。随后Gα与GβGγ二聚体解聚, 并各自传递信号。Gα亚基在与效应蛋白结合的同时或之后, 将结合的GTP水解为GDP (图 2c)^[32], 并再次与GβGγ形成三聚体回到非活化状态(图 2d), 等待下一次信号转导。

基于Gα亚基序列和功能的相似性, 可以将G蛋白分为4种亚类家族: Gi、Gs、G12/13和Gq^{[23, 33]} (图 3)。Gs家族包含Gα_s和Gα_olf^[34], 活化后促进腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)产生第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP), 继而激活cAMP依赖的蛋白激酶。Gi是G蛋白中最大且最多样的家族, 主要包括Gα_i1、Gα_i2、Gα_i3、Gα_oA、Gα_oB、Gα_s、Gα_t1、Gα_t2、Gα_gust和Gα_z^[34], Gi活化后产生与Gs相反的生物学功能。G12/13家族包含Gα₁₂和Gα₁₃, 其活化后主要负责调控RhoGEFs^[28]。人源性Gq家族主要包括Gα_q、Gα₁₁、Gα₁₄、Gα₁₆。Gα_q和Gα₁₁在体内广泛分布, 且二者氨基酸序列相似性高达88%^[33]。Gα₁₄主要分布在肾、肺和肝等器官, Gα₁₆只在特定的造血细胞内表达^[34]。Gq活化后促进磷脂酶Cβ (phospholipase Cβ, PLCβ)水解4, 5-二磷酸脂酰醇(phosphatidylinositol 4, 5-biphosphate, PIP2)产生第二信使三磷酸肌醇(inositol 1, 4, 5-triphosphate, IP3)和二酰甘油(diacylglycerol, DAG), IP3可进一步导致胞质Ca²⁺浓度增高并引发一系列生理反应。

1.2 G蛋白与GPCR信号传导的选择性

GPCR家族包含800多个成员, 可以被上千种配体激活, 而G蛋白数量却极其有限, GPCR与G蛋白间偶联模式错综复杂。研究表明, GPCR与G蛋白间的偶联存在选择性^[35], 如β1肾上腺素受体(β1-adrenoceptor, β1AR)和五羟色胺受体6 (5-hydroxytryptamine receptor 6, 5-HT6)均偶联Gs (图 4a); 又如某些GPCR可以偶联多种G蛋白, 如β2肾上腺素受体(β2-adrenoceptor, β2AR)既可以偶联Gs又可以偶联Gi^{[35, 36]} (图 4b); 某些GPCR只偶联某一种G蛋白, 如乙酰胆碱受体1 (muscarinic acetylcholine receptor 1, M1)激活后仅偶联Gq; Flock等^{[35, 37]}认为GPCR与G蛋白选择性偶联取决于Gα上一段特定的保守氨基酸序列, 该序列可以被GPCR的不同区域所识别, 不同的GPCR通过不同的残基与Gα上保守氨基酸序列结合, 而GPCR长期进化导致了不同配体使用不同识别残基来识别相同Gα蛋白, 以此提高信号转导效率。GPCR在基因分化期间主要积累两种突变类型:一种维持Gα蛋白偶联选择性, 但改变配体结合特异性; 另一种保持配体结合特异性, 但改变Gα蛋白偶联选择性。偶联相同Gα蛋白的GPCR如果其Gα蛋白偶联选择性是从同一祖先继承而来, 则共享相同的结合残基(GPCR-R1与GPCR-R2, 图 4c), 但如果GPCR通过改变原始祖先Gα蛋白选择性而实现偶联相同Gα蛋白, 则享有不同的结合残基^[35] (GPCR-R3与GPCR-R2', 图 4c)。GPCR与G蛋白间偶联选择性为G蛋白小分子抑制剂的开发和功能验证提供了基础理论依据。

1.3 G蛋白的激活突变与UM

UM是一种以突变为典型特征的肿瘤, 如GNAQ、GNA11、半胱氨酰白三烯受体2 (cysteinyl leukotriene receptor 2, CYSLTR2)间互斥突变, 以及真核翻译起始因子1X (eukaryotic translation initiation factor 1A, X-linked, EIF1AX)、剪切因子3B1亚基(splicing factor 3b, subunit 1, SF3B1)、BRCA1相关蛋白1 (BRCA1 associated protein 1, BAP1)间互斥突变等(表 1^{[9, 13, 38]})^{[38, 39]}, G蛋白突变激活与UM的发生和转移密切相关^{[7, 8]}。测序结果表明, 95%以上的GNAQ、GNA11突变集中在209位^[40], 以209位谷氨酰胺(Q)突变为亮氨酸(L)或脯氨酸(P)为主。209位谷氨酰胺位于GNAQ和GNA11的RAS结构域, 该结构域对Gq的GTPase活性至关重要^[17]。209位突变可能导致Gα的GTPase活性丧失, 从而使Gα处于持续活化状态^{[7, 8]}。Q209L和Q209P突变提高Gα亚基对效应器的亲和力, 促进Gα与GβGγ亚基解聚。此外, Q209P突变还可抑制G蛋白信号转导调节蛋白(regulator of G protein, RGS)对Gα负性调控^[40] (图 5), RGS是一类GTPase激活蛋白(GTPase-accelerating protein, GAP), 通过直接与激活的Gα结合加速GTP水解(> 1 000倍), 促进G蛋白信号通路失活^{[32, 41]}。部分突变也发生于183位, 以R (精氨酸) 183C (半胱氨酸)突变为主, 但该突变的发生频率和对G蛋白激动效果都远不及209位突变^[8]。因此, 靶向Gα亚基突变, 尤其是Q209位突变研发新型UM治疗药物具有重大意义。

2 靶向Gq抑制剂的研发进展

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基于GNAQ/GNA11在UM的高频突变, 靶向GNAQ/GNA11小分子抑制剂开发可能是UM治疗极具前景的策略。然而, 靶向Gq突变的研究仍处于初始阶段。目前经确证的选择性Gq抑制剂仅有YM-254809和FR900359及其衍生物, 泛G蛋白抑制剂包括BIM-46714及其二聚体BIM-46187和多肽类G蛋白拮抗剂-2A、27残基肽(I860A)等。

2.1 选择性Gq抑制剂FR900359和YM-254890

FR900359又名UBO-QIC, 于1988年从植物朱砂根Ardisia crenata sims中提取分离得到, 具有抑制血小板聚集和降血压等作用^[42]。YM-254890于2003从色素杆菌sp.QS3666发酵液中分离得到, 起初作为一种新型血小板凝集抑制剂^[43], 用于抗血栓和溶血栓研究^[44]。YM-254890和FR900359提取来源不同, 但结构却极其相似^[45] (图 6)。

YM-254890相对FR900359发现较晚, 但却是第一个被证实可选择性靶向Gq的抑制剂^[46]。YM-254890的发现及作为Gq选择性抑制剂对研究Gq激活及Gq偶联的信号通路具有重要意义。2010年Nishimura等^[47]成功得到了YM-254890与Gq蛋白的结晶, 首次提供了G蛋白与小分子结合的结构信息。基于结构相似性, 2015年Inamdar等^[48]证实FR900359也是一种选择性Gq抑制剂, 对G12/13、Gs和Gi均不具有抑制作用。YM-254890和FR900359作为核苷酸解离抑制剂(GDP dissociation inhibitor, GDI)均可结合到靠近核苷酸结合口袋的Gq铰链1 (linker 1)和开关Ⅰ (switch Ⅰ)结构域之间。Switch Ⅰ构象变动是启动G蛋白的关键^[49], 当化合物结合后阻碍了switch I运动, 导致GDP被束缚于核苷酸结合口袋内, 通过阻滞GDP/GTP交换致使Gq处于失活状态^{[25, 47]} (图 7)。由于YM-254890提取工艺复杂、产率低、合成困难, 因此长期以来仅作为Gq研究工具使用, 而未开展相关临床试验。2016年Xiong等^[45]报道了YM-254890和FR900359及其衍生物的全合成路线, 并首次测定出YM-254890和FR900359抑制Gq的IC₅₀分别为0.095和0.033 μmol·L^-1, 证实FR900359是目前对Gq抑制效果最强的化合物, 但复杂的合成过程使得YM-254890和FR900359的大规模制备仍然不可能实现。经测定YM-254890对Gαq R183C突变激活抑制效果明显好于Gαq Q209L^[46], 而FR900359无论对野生型、183突变和209突变都有明显的抑制作用^[25]。目前常以FR900359作为UM研究的工具化合物。

在体外实验中, Feng等^{[13, 24, 50, 51]}证明FR900359在GNAQ/GNA11突变的MEL270、OMM1.3、92.1和UM002B细胞中剂量依赖地抑制细胞存活, 而对BRAF突变的SK-MEK-28和OCM3细胞, 在同剂量下几乎不具有杀伤细胞作用。FR900359可在3D培养中剂量依赖抑制OMM1.3细胞克隆形成, 促进UM细胞G1期阻滞、细胞凋亡和抑制细胞迁移等。FR900359的作用效果与G蛋白突变具有强烈的相关性, 提示G蛋白突变激活作为UM驱动因素在UM恶性增殖中承担重任。在UM复杂的致瘤信号通路中, FR900359可抑制Rho/Rock/YAP通路关键蛋白FAK磷酸化, 并以剂量依赖方式促进YAP S127磷酸化, 抑制YAP转录入核^{[13, 24]}。在MAPK信号通路中, FR900359对G蛋白突变株可剂量依赖抑制下游ERK/MEK磷酸化水平, 而对多数非G蛋白突变株抑制效果不显著^{[24, 25]}。此外, FR900359可介导起始复合物2 (polycomb repressive complex 2, PRC2)沉默^[51], 促进黑色素细胞再分化, 经证实PRC2在包括UM在内的多种癌症中具有维持肿瘤干细胞特性和促进自我更新等作用^[52]。体内实验表明, 相较于BRAF突变的UM, FR900359对Gq突变的UM异种移植瘤有明显效果^[50]。以上研究提示, 直接靶向G蛋白突变作为抗肿瘤药物研发靶点是可行且有效的。

2.2 泛G蛋白抑制剂BIM-46174和BIM-46187

BIM-46174是一类咪唑并哌嗪类小分子化合物(图 8)。2006年Prévost等^[53]报道BIM-46174为泛G蛋白抑制剂, 可选择性抑制霍乱毒素(cholera toxin, CTX)介导Gs激活引起的cAMP水平升高, 而对毛喉素介导AC激活引起cAMP积累无抑制效果, 并以可逆方式抑制Gs偶联GPCR介导的cAMP积累。此外, BIM-46174在体内外实验中均显示出抑制肿瘤细胞增殖、存活和侵袭等作用, 其在细胞水平抑制细胞增殖的IC₅₀为0.6~25 μmol·L^-1 ^[53]。对G蛋白其他亚型, BIM-46174抑制Gq介导的IP1 (IP3水解产物^[54])产生, 并对偶联Gi/o的Wnt-2卷曲受体和偶联Gq的高亲和性神经降压素受体介导的癌细胞侵袭表现出抑制效果。初步说明, BIM-46174对泛G蛋白均有一定抑制作用^[53]。

BIM-46187是BIM-46174的氧化二聚体形式(图 8), 起初被发现可引起强烈的痛觉过敏反应, 并与吗啡有很强协同作用^[55]。2009年Ayoub等^[56]发现BIM-46174可抑制多种GPCR (抗利尿激素受体V2、β2肾上腺素受体、五羟色胺受体、蛋白酶激活受体1、溶血磷脂酸受体和γ氨基丁酸受体)介导的IP1、cAMP的产生和SRE-Luc荧光素酶报告基因表达, 表明BIM-46187对Gs、Gi、Gq和G12/13具有普遍抑制作用。使用生物发光(BRET^[57])和荧光共振能量转移(FRET^[54])发现, 在重组的GPCR、G蛋白细胞株中BIM-46174可通过直接与Gα亚基结合, 阻碍G蛋白与GPCR复合物间相互作用, 实现GDP/GTP交换抑制^[56]。2014年Schmitz等^[58]通过分子动力学模拟(molecular dynamics, MD)对BIM (BIM-46174和BIM-46187)的作用模式展开深入研究, 推测BIM (BIM-46174和BIM-46187)绑定到Gα亚基α4环(α4 loop)和α4螺旋(α4 helix)之间, 以允许GDP从核苷酸结合口袋中退出但阻止GTP进入方式将Gα困在空腔结构中, 有别于YM-254890和FR900359将GDP束缚在核苷酸结合口袋内^[58] (图 9)。该研究结果与Ayoub等^{[56, 58]}报道的BIM-46187作用于Gα_i2o偶联的白三烯受体时显示BIM-46187允许GDP解离但阻止GTP结合一致。虽然BIM-46187作为一种泛G蛋白抑制剂, 但呈细胞环境依赖方式干扰G蛋白信号。在特定细胞内BIM-46187只抑制Gq信号, 当胞内Gα蛋白表达丰度存在差异也会影响该化合物的抑制效果^[58]。在结构上BIM-46187比单体BIM-46174仅多了1个二硫键, 但Schmitz等^[58]报道在CHO细胞和HEK293细胞中, BIM-46187比BIM-46174显示更强的Gq抑制作用。此外, 在胞外特定条件下小单体BIM-46174可完全转化为二聚体形式, 表明二硫键的存在似乎不影响化合物的细胞膜透过性, 甚至改善了反应动力学和化学计量学效应, 致使二聚体比单体显示更高活性^[59]。

2.3 G蛋白拮抗剂-2A

G蛋白拮抗剂-2A (G protein antagonist-2A, GP-2A)是一类十一氨基酸神经肽(substance P, SP)类似物, 氨基酸序列为Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Met-NH₂ (图 10), 但二级结构一直未见报道。起初作为一种SP拮抗剂有刺激组胺释放作用^[60], 后被发现可抑制Gq偶联的M1受体介导的GTP水解, 而对Gi偶联的M2受体介导的GTP水解无明显抑制^[61]。有文献^[60]报道, GP-2A截短型肽GPAnt-2 (pGlu-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-D-Trp-Met-NH₂)可抑制Gi偶联的M2受体和Gs偶联的β2肾上腺素受体介导的GTP水解, GPAnt-2以可逆方式与Gi/Gs竞争性结合GPCR抑制G蛋白活化。而GP-2A对G蛋白抑制机制一直有待确证, 此外, 其细胞透过性、对G蛋白的选择性和疾病模型中的作用也需进一步考量。

2.4 27残基肽(I860A)

27残基肽(I860A) (27mer (I680A))是一类基于蛋白-蛋白相互作用衍生出的一类合成肽, 研究发现Gq下游效应器(PLCβ和p63RhoGEF)均以相似的卷曲螺旋结构(helix-turn-helix, HTH)结合到Gq的Switch Ⅱ和螺旋结构α3之间。27mer (I860A)是PLCβ HTH结构域860位异亮氨酸(I)突变为丙氨酸(A)的27残基肽(His-Gln-Asp-Tyr-Ala-Glu-Ala (860位)-Leu-Ala-Asn-Pro-Ile-Lys-His-Val-Ser-Leu-Met-Asp-Gln-Arg-Ala-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala), 期望以残基取代全长效应器竞争性结合Gq而抑制G蛋白活化。体外实验表明27mer (I860A)对活化的Gq有较高的亲和力(K_D = 400 nmol), 但不结合Gα_i1、Gα_t和Gα_s^[62]。但目前27mer (I860A)的构效关系、细胞透过性和G蛋白选择性等都需要进一步考究。

3 小结与展望

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UM中Gq的高频突变促使更多研究者把视线聚焦到GPCR-G蛋白通路高频突变与癌症发生上, 随着深度测序技术的发展, 越来越多G蛋白突变在各种癌症中被揭示, 如在某些类型的胰腺癌中Gα_s突变率高达70%^[63], 在上皮性T淋巴瘤中Gα_i2突变率在24%左右^[64], G蛋白突变在癌症研究中不断彰显。目前转移性的UM仍然是难以治疗的癌种, 临床治疗手段极其有限。基于UM中Gq的高突变率, 靶向Gq突变的抑制剂开发可能是攻克UM极具前景的方向。但由于不同亚型G蛋白在一级序列和三维结构等方面具有高度相似性, 因此, 开发对不同G蛋白亚型有高度选择性的抑制剂极富挑战性。目前经证实, 可以选择性靶向Gq的抑制剂仅有YM-254890和FR900359及其类似物, 但该类化合物提取分离工艺复杂、产率低、合成困难而难以批量化生产, 此外其在突变型和野生型Gq间选择性不强, 若开发成药物需要制定策略将化合物精准地传递到靶细胞, 以避免干扰正常的Gq级联信号。因此, 急需开发新型成药性良好的G蛋白选择性抑制剂。

UM致瘤信号通路具有复杂性, 基于UM致瘤信号通路开展的各项临床研究表明, 如果仅靶向单一潜在靶点开展单独用药, 难以取得显著生存获益, 因此, 目前针对转移性的UM一般主张多通路多靶点联合用药。此外, 对UM患者需要有针对性地检测基因表达谱从而更精准地判断预后, 制定更加个体化和更有效的诊疗方案。如Gq突变的UM患者中, 基于Gq突变可直接触发Rho/Rock/YAP信号通路激活^{[13, 17, 65]}, 提示对Gq突变的UM患者在进行靶向治疗时, 可针对Rho/Rock/YAP通路结合MAPK、PI3K等通路开展联合用药^{[9, 10, 15, 66, 67]}。总体来说, 针对UM患者, 开发高活性、高选择性的G蛋白抑制剂结合个体化联合治疗将是未来治疗的发展方向。

作者贡献:石硕和朱凯负责论文的书写、制图, 张小雷和熊小峰负责文稿的统筹和提高。

利益冲突:全体作者无利益冲突。

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2020年第55卷第7期

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作者信息

1.中山大学药学院, 广东广州 510006

2.长春中医药大学, 吉林长春 130117

通讯作者:

*熊小峰, E-mail:xiongxf7@mail.sysu.edu.cn;

张小雷, Tel:86-20-39943021, E-mail:zhangxlei5@mail.sysu.edu.cn

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本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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