药学学报


B1		＞10
B2		＞10
B3		＞10
B4		＞10
B5		＞10
GSK3326595		0.045
B6		＞10
B7		＞2.1
B8		0.037
B9		＞10
B10		＞10


B1		＞10
B2		＞10
B3		＞10
B4		＞10
B5		＞10
GSK3326595		0.045
B6		＞10
B7		＞2.1
B8		0.037
B9		＞10
B10		＞10


B8	0.037	2.2
C1	0.084	1.38
C2	0.034	0.733
C3	0.043	0.651
C4	0.029	0.565
C5	0.026	0.609
C6	0.022	0.413
GSK3326595	0.030	0.025


B8	0.037	2.2
C1	0.084	1.38
C2	0.034	0.733
C3	0.043	0.651
C4	0.029	0.565
C5	0.026	0.609
C6	0.022	0.413
GSK3326595	0.030	0.025

Compd.	Mean P_app/10^-6cm·s^-1	Efflux ratio	Mean Reconery/%	Rank^a
Nadolol	0.10	ND	-	101.57	ND^b	Low	-
Metoprolol	21.40	ND	-	97.79	ND	High	-
Digoxin	＜0.02	10.36	>441.98	＜91.77	93.73	Low	Likely
C3	0.04	23.64	546.46	89.34	91.86	Low	Likely
C4	＜0.04	19.58	4 951.21	＜105.57	104.53	Low	Likely

Compd.	Mean P_app/10^-6cm·s^-1	Efflux ratio	Mean Reconery/%	Rank^a
Nadolol	0.10	ND	-	101.57	ND^b	Low	-
Metoprolol	21.40	ND	-	97.79	ND	High	-
Digoxin	＜0.02	10.36	>441.98	＜91.77	93.73	Low	Likely
C3	0.04	23.64	546.46	89.34	91.86	Low	Likely
C4	＜0.04	19.58	4 951.21	＜105.57	104.53	Low	Likely

蛋白质精氨酸甲基转移酶5抑制剂的设计、合成及活性评价

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朱康乐 ¹^,² , 王亚洲 ²^,^* , 尤启冬 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2020,55(8): 1859-1871

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药学学报 | 研究论文 2020, 55(8): 1859-1871

蛋白质精氨酸甲基转移酶5抑制剂的设计、合成及活性评价

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朱康乐¹^,², 王亚洲²^,^*, 尤启冬¹^,^*

作者信息

1.江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室, 中国药科大学, 江苏南京 210009

2.南京圣和药业股份有限公司, 江苏南京 210000

通讯作者:

*王亚洲,Tel:86-25-81066791, E-mail:wangyzyf@sanhome.com;

尤启冬,Tel:13801580597, E-mail:youqd@cpu.edu.cn

Design, synthesis and activity evaluation of protein arginine methyltransferase 5 inhibitor

Kang-le ZHU¹^,², Ya-zhou WANG²^,^*, Qi-dong YOU¹^,^*

Affiliations

1. Jiangsu Key Laboratory of Drug Design and Optimization, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China

2. Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing 210000, China

出版时间: 2020-08-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-0568

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摘要

收起

蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）是人体中重要的Ⅱ型甲基转移酶，可以催化多种组蛋白及非组蛋白的对称性双甲基化，并在多种肿瘤中高表达，是一种潜在的治疗癌症的新靶点。本文根据已报道的EPZ015666与PRMT5复合物晶型，并分析其相互作用模式，开展对GSK3326595（原为EPZ015938）的结构改造，使用构象限制原理设计合成了16个化合物，经过生物学评价发现化合物B8和C系列6个化合物均具备与GSK3326595相当的PRMT5抑制活性。Caco-2细胞透膜性实验表明化合物C3、C4的透膜性较差，可能是细胞抗增殖活性较差的一个原因，为下一步结构设计提供思路。

关键词

PRMT5 / 结构优化 / 癌症 / GSK3326595

Abstract

收起

Protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) is an important type Ⅱ human methyltransferase. It catalyzes the symmetrical double-methylation of many histones and non-histones, and it is highly expressed in many kinds of tumors. PRMT5 has been proven to be a potential new target for cancer treatment. Based on the reported crystal complex of EPZ015666 with PRMT5, a series of new compounds was designed using GSK3326595 (EPZ015938) as the lead compound and using the conformational restriction approach. We found that compounds B8 and the C series of derivatives displayed enzyme inhibitory activity comparable to that of GSK3326595. Compounds C3 and C4 showed poor permeability in Caco-2 cells, and that might be one of the reasons for their poor anti-proliferative activity against Z-138 cells. These data provide insights for further structural optimization.

Key words

PRMT5 / structural optimization / cancer / GSK332659

引用本文

朱康乐, 王亚洲, 尤启冬. 蛋白质精氨酸甲基转移酶5抑制剂的设计、合成及活性评价. 药学学报, 2020 , 55 (8) : 1859 -1871 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-0568

Kang-le ZHU, Ya-zhou WANG, Qi-dong YOU. Design, synthesis and activity evaluation of protein arginine methyltransferase 5 inhibitor[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2020 , 55 (8) : 1859 -1871 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-0568

正文

收起

蛋白质精氨酸甲基化由蛋白质精氨酸甲基转移酶家族(protein arginine methyltransferase, PRMT)催化, 已成为最常见的翻译后修饰之一。在哺乳动物中PRMT5作为主要的II型甲基转移酶, PRMT5与MEP50形成异八聚体^[1], 通过催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)上的甲基转移到精氨酸残基胍基的氮原子上, 并释放一当量的S-腺苷-L-高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine, SAH), 实现甲基化修饰作用^[2]。现已证明其可以催化多种组蛋白(H4R3、H3R8)及非组蛋白(NF-κB、p53等)的甲基化从而参与生物调控过程^[3], 包括转录调控、RNA代谢、核糖体生物过程和细胞周期调亡^[4]。

PRMT5在许多类型的癌症中上调, 包括淋巴瘤^{[5, 6]}、肺癌^[7]、乳腺癌^[8]和结直肠癌^[9]。此外, PRMT5在套细胞淋巴瘤(MCL)中也有重要作用^[10]。PRMT5不仅在MCL患者样本中表达上调, 而且在MCL细胞系中, 当PRMT5基因敲除后, 具备抗增殖作用。PRMT5也可以抑制一些抑癌基因的转录, 包括致瘤性抑制因子7 (ST7)、非转移性基因23 (NM23)、视网膜母细胞瘤(RB)家族和程序性细胞死亡4 (PDCD4)^{[4, 11]}。总之, 这些发现表明PRMT5是一种潜在的治疗癌症的靶点。

另外, 通过检测人类的PRMT5序列, 发现当发生F327M突变后PRMT5失去了对称双甲基化的活性, 这表明Phe327在PRMT5发挥对称双甲基化功能中占据了重要作用, 这为选择性小分子抑制剂的研究提供了思路^[12]。

近年来, 越来越多的研究表明, 敲除PRMT5可以抑制肿瘤细胞的生长, 改善癌症患者的预后, 表明PRMT5可能成为治疗某些癌症的一个新的、有希望的靶点^[13], 但目前还没有抑制剂被批准上市^[14]。已知的处于临床研究的抑制剂有1 (JNJ-64619178)^[15]、2 (GSK-3326595)^[16]、PF-06939999、PRT811。结构如图 1所示, PF-06939999和PRT811的结构暂未披露^[2]。JNJ-64619178是SAM竞争性抑制剂, 而GSK-3326595是非SAM竞争性抑制剂。

GSK-3326595 (原为EPZ015938)是由化合物3 (EPZ015666)经过进一步结构优化得到的。EPZ015666是报道的第一个口服且具有细胞生物活性的高选择性PRMT5抑制剂, IC₅₀值为22 nmol·L^-1, 在Z-138人套细胞淋巴瘤细胞和Maver-1人淋巴细胞中IC₅₀值分别为96和450 nmol·L^-1^[10]。

由EPZ015666与PRMT5:MEP50:SAM复合物的晶体结构(PDB: 4X61)可以看出(图 2): EPZ015666结构中的羟基与PRMT5的Glu444、Leu437形成氢键作用; 酰胺羰基氧与Phe580、Ser439形成氢键作用; THIQ (四氢异喹啉)上的N原子与Glu435形成水分子介导的氢键; THIQ能与Phe327形成π-π堆积作用, 与SAM形成独特的阳离子-π相互作用, 这是保持活性的关键。当移去THIQ中的苯环时化合物4 (EPZ019896)的活性基本消失(IC₅₀ > 10 μmol·L^-1)。根据EPZ015666与PRMT5相互作用, 对GSK3326595进行结构改造设计了一类新型的PRMT5选择性抑制剂, 保留活性亚结构THIQ环(A区域)不变, 对B区域部分采用构象限制策略, 利用杂原子(N/NH、O/OH)模拟原手性羟基形成的氢键作用, 设计合成了B系列化合物(B1~B10)(图 3), 其中B8的酶抑制活性与GSK3326595相当。为了改善化合物B8的理化性质及细胞抗增殖活性, 对C区域设计合成了C系列化合物(C1~C6) (图 4)。

B1~B4的合成采用合成路线1, 使用不同卤代的芳环母核与四氢异喹啉进行亲核取代反应、硝基还原反应得到不同芳环的氨基取代产物(11), 然后再依次与6-氯嘧啶-4-羰基氯、1-乙酰基-4-氨基哌啶进行亲核取代反应得到B1~B4。B5使用吡咯烷酮(13)经过Wittig反应生成烯烃, 再经过环氧化后与四氢异喹啉进行亲核取代反应、脱保护基得到吡咯烷醇(17), 然后再依次与6-氯嘧啶-4-羰基氯、1-乙酰基-4-氨基哌啶进行亲核取代反应得到B5 (合成路线2)。B6~B10采用取代位置不同的吡唑酸或酯与四氢异喹啉缩合得到酰胺, 再经过硼氢化、氢气还原得到胺(26), 然后再依次与6-氯嘧啶-4-羰基氯、1-乙酰基-4-氨基哌啶进行亲核取代反应, 得到B6~B10 (合成路线3)。C系列的合成如合成路线4所示, 胺的合成通式如酰氯29与4-叔丁氧羰基氨基哌啶经过酰化反应、脱保护基, 然后再与化合物27c进行亲核取代反应得到C1~C6。

结果与讨论

收起

1 化合物的结构确证

所有目标化合物经检索均未见文献报道, 并采用¹H NMR、¹³C NMR、HR-ESI-MS进行结构确证, 纯度使用HPLC进行测定, 具体数据见实验部分。

2 化合物的生物活性评价

如表 1所示, 在所设计的10个化合物中发现化合物B8对PRMT5酶抑制活性与阳性药相当, 其他的化合物活性较差(大于10 μmol·L^-1)。根据结构分析: B1、B2两个化合物以杂环作为连接链, 希望能以氮原子模拟氢键受体作用, B3、B4希望以苯环羧基及苯环羟基模拟氢键给体作用, B5把柔性链固定构象变成吡咯烷环, 这三类化合物的活性都基本消失, 可能均失去了原手性羟基与Glu444的氢键作用; B6、B7、B8使用吡唑作为连接基团, 发现连接位置不同, 导致吡唑环中NH在结合腔中所处的空间位置不同, 对活性影响很大, 只有B8具有较好的活性。B9将吡唑环中NH甲基化后, 活性基本消失, 说明了吡唑环中NH的重要性。B10将吡唑环与THIQ之间用羰基连接, 活性基本消失。可能原因是二面角改变, 使吡唑NH的朝向发生改变, 失去了关键的相互作用。

对化合物B8进行人套细胞淋巴瘤细胞Z-138抗增殖活性测试发现, IC₅₀为2.2 μmol·L^-1, 比阳性药弱很多。希望改善化合物B8的理化性质, 以提高细胞活性, 使用不同大小的脂肪环或芳香环替换甲基, 得到化合物C1~C6。生物测试发现, 这些化合物对PRMT5的抑制活性基本保持, 对Z-138细胞的抗增殖活性随着环的增大显示出有规律的提高, 化合物C6比B8活性提高5.3倍, 但依然弱于阳性对照药GSK3326595 (表 2)。

为了研究细胞活性差的原因, 对C3、C4进行了Caco-2透膜性实验(表 3), 实验结果表明化合物C3、C4对Caco-2的透膜性很差, 外排率比较大, 可能是P-糖蛋白的底物。通过改善化合物的透膜性可能会提高化合物的细胞活性。

3 分子对接结果分析

采用分子对接的方法, 将化合物B8与PRMT5: MEP50: SAM复合物进行分子对接及分子叠合(PDB: 4X61)。从图 5B中可以看出, B8在SAM存在时与酶结合, 与EPZ015666的结合位点基本一致, 二者的THIQ部分基本重叠。由图 5A可以看出, B8吡唑环上的NH与Glu444形成氢键, 并且吡唑环与Tyr579形成π-π堆积作用; 嘧啶羰基与Phe580形成氢键; THIQ亦能与Phe327形成π-π堆积作用, 与SAM形成独特的阳离子-π相互作用。分子对接结果说明B8基本维持了EPZ015666与PRMT5关键的相互作用。

4 小结

根据EPZ015666与PRMT5的作用模式, 针对GSK3326595的手性醇柔性链, 采用构象限制策略, 首先设计合成了B1~B10共10个结构新颖的化合物, 并分别测试了对PRMT5的抑制活性, 发现化合物B8对PRMT5的抑制活性与阳性对照药相当, 但抗细胞增殖活性较弱。然后对该化合物进一步结构优化设计了6个化合物C1~C6, 这些化合物的酶活性得以保持, 化合物C6的抗细胞增殖活性比B8提高5倍, Caco-2细胞透膜性实验表明此类化合物的透膜性较差, 为该类型PRMT5小分子抑制剂的进一步设计提供参考。

实验部分

收起

本文化合物的¹H NMR使用Bruker Avance Ⅲ HD 400 MHz型核磁共振仪测定, 以四甲基硅烷(tetramethylsilane, TMS)为内标; ¹³C NMR使用Bruker Avance Ⅲ HD 100 MHz型核磁共振仪测定; LC-MS采用Agilent 1290 Infinity-Agilent 6130 Quadrupole LC/MS system质谱联用仪测定; HR-ESI-MS使用Q Exactive高分辨质谱仪测定; 柱色谱均使用青岛海洋化工厂的促控(ZCX-II)型200~300目柱色谱硅胶; TLC使用烟台江友有限公司生产的HSGF254型薄层色谱硅胶板, 用ZF-2007型暗箱式紫外分析仪254显色; 熔点由梅特勒-托利多MP70精密熔点仪测定; HPLC经Waters 2695型高效液相色谱仪测定(流动相是乙腈:水-0.1%甲酸=10%~90%:1;流速1.2 mL·min^-1, 总时长: 25 min; 检测波长: 254 nm)。所有试剂均为市售分析纯, 除特别说明外, 一般均不经纯化处理直接使用。

生物活性测试所用到PRMT5购自BPS公司; [³H]-SAM购自PerkinElmer公司; SAM、SAH购自Sigma公司; Z-138细胞株和Caco-2细胞购自ATCC细胞库; CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒购自Promega公司; 阳性对照化合物GSK3326595参照专利WO201410071 9A2自制, 纯度100%。

1 化学合成

1.1 2-(溴甲基)-3-硝基吡啶(6)

将2-甲基-3-硝基吡啶(5) (4 g, 29.0 mmol)溶于四氯化碳(60 mL)中, 加入N-溴代丁二酰亚胺(6.7 g, 37.6 mmol)与偶氮二异丁腈(0.71 g, 4.33 mmol), 80 ℃搅拌回流反应过夜。LC-MS检测反应完全后过滤, 减压浓缩滤液, 用乙酸乙酯和水萃取3次, 乙酸乙酯层减压浓缩得到黄色液体产物(4.5 g, 71.8%)。ESI-MS (m/z): 217.1/219.1 [M+H]⁺。

1.2 2-((3-硝基吡啶-2-基)甲基)-1, 2, 3, 4-四氢异喹啉

将化合物6 (4.32 g, 20.0 mmol)溶于乙醇(60 mL)中, 加入1, 2, 3, 4-四氢异喹啉(2.94 g, 20.0 mmol)与碳酸钾(5.52 g, 40.0 mmol), 室温搅拌反应过夜后, LC-MS检测原料基本消失。过滤, 减压浓缩滤液, 柱色谱(V_石油醚:V_乙酸乙酯=5:1)分离得到黄色固体(1.9 g, 35.3%)。ESI-MS (m/z): 270.1 [M+H]⁺。

采用类似的方法由化合物9合成化合物10, 产率92.0%. ESI-MS (m/z): 299.1 [M+H]⁺。

1.3 2-((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)吡啶-3-胺(11a)

将化合物7 (1 g, 3.72 mmol)溶于乙醇(20 mL)中, 加入钯碳(30 mg, 0.372 mmol), 氢气球存在下室温搅拌反应过夜, LC-MS检测原料基本消失。抽滤后减压浓缩滤液, 得到黄色油状产物(920 mg, 粗品)。ESI-MS (m/z): 240.2 [M+H]⁺。

化合物11c的合成方法与11a类似, 直接用于下一步. ESI-MS (m/z): 269.1 [M+H]⁺。

1.4 6-((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)吡啶-2-胺(11b)

将化合物8 (3.46 g, 20.0 mmol)溶于1, 2, 3, 4-四氢异喹啉(7.5 mL)中, 油浴140 ℃搅拌过夜后, LC-MS检测原料完全反应。停止加热, 冷却至室温, 加入乙酸乙酯稀释, 抽滤, 减压浓缩滤液, 柱色谱(V_石油醚:V_乙酸乙酯=5:1)分离得到黄色液体产物(3.82 g, 84.9%)。ESI-MS (m/z): 226.1 [M+H]⁺。

1.5 (2-氨基-6-(3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)苯基)甲醇(11d)

将化合物11c (1 g, 3.73 mmol)溶于无水四氢呋喃(10 mL)中, 冰浴下滴加氢化铝锂/四氢呋喃溶液(2.5 mol·L^-1)抽滤, 浓缩滤液, 得到深红色油状液体(800 mg, 84.4%)。ESI-MS (m/z): 255.1 [M+H]⁺。

1.6 6-氯-N-(2-(((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)吡啶基-3-基)嘧啶-4-羧酰胺(12a)

将化合物11a (920 mg, 3.85 mmol)溶于无水二氯甲烷(15 mL)中, 加入N, N-二异丙基乙胺(1 g, 7.75 mmol), 冰浴下滴加6-氯嘧啶-4-羰基氯无水二氯甲烷溶液(800 mg, 4.54 mmol)室温搅拌反应过夜, LC-MS检测原料基本消失。加入二氯甲烷与水萃取3次, 有机层干燥浓缩, 柱色谱(V_石油醚:V_乙酸乙酯=1:1)分离得到白色固体产物(550 mg, 37.7%)。ESI-MS (m/z): 379.1 [M+H]⁺。

化合物12b、12c、12d的合成方法与12a类似, 产率分别为38.5%、118%、90.2%. 12b: ESI-MS (m/z): 366.1 [M+H]⁺; 12c: ESI-MS (m/z): 409.1 [M+H]⁺; 12d: ESI-MS (m/z): 395.1 [M+H]⁺。

1.7 6-((1-乙酰基哌啶-4-基)氨基)-N-(2-((3, 4-二氢异喹啉-2-(1H)-基)甲基)吡啶-3-基)嘧啶-4-羧酰胺(B1)

将化合物12a (300 mg, 0.79 mmol)、1-乙酰基-4-氨基哌啶(224.8 mg, 1.58 mmol)溶于正丁醇(20 mL)中, 加入N, N-二异丙基乙胺(510.5 mg, 3.96 mmol), 140 ℃微波反应2 h, LC-MS监测反应完全后, 减压除去溶剂。加入水和乙酸乙酯萃取3次, 有机相经无水硫酸钠干燥后, 减压浓缩, HPLC制备分离(乙腈/水, 0.1%甲酸)得到白色固体(70 mg, 23.4%)。mp:144~146 ℃。ESI-MS (m/z): 486.3 [M+H]⁺。

HPLC: 98.96%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.81 (d, J = 23.7 Hz, 1H), 8.68 (dd, J = 8.2, 1.3 Hz, 1H), 8.27 (dd, J = 4.7, 1.3 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.38 (dt, J = 18.0, 9.0 Hz, 1H), 7.21~7.04 (m, 5H), 4.21 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 4.01 (s, 2H), 3.82~3.67 (m, 3H), 3.16 (t, J = 11.4 Hz, 1H), 2.94 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.84 (dd, J = 29.8, 13.0 Hz, 2H), 1.46~1.14 (m, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 168.48, 162.91, 162.70, 157.61, 154.12, 147.44, 144.07, 134.92, 134.87, 134.64, 128.83, 127.43, 126.78, 126.47, 125.89, 123.44, 104.23, 100.00, 63.56, 55.62, 50.25, 47.38, 44.82, 32.09, 31.35, 28.92, 21.74。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₇H₃₂N₇O₂) 486.261 2, Found 486.260 2。

化合物B2、B3、B4的合成方法与B1类似。B2产率13.3%。mp: 125~126 ℃。ESI-MS (m/z): 472.2 [M+H]⁺。HPLC: 100%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10.00 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 7.20 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.32~4.06 (m, 2H), 3.89~3.71 (m, 3H), 3.20 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 2.91 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 2.00 (s, 3H), 1.98~1.81 (m, 2H), 1.42 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.35~1.19 (m, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 168.52, 157.80, 148.85, 140.36, 135.52, 134.68, 128.80, 127.05, 126.78, 126.49, 104.24, 103.76, 101.41, 47.56, 46.88, 44.85, 42.40, 32.08, 31.35, 28.46, 21.80。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₆H₃₀N₇O₂) 472.245 5, Found 472.245 7。

B3产率24.0%。mp: 238~240 ℃。ESI-MS (m/z): 515.2 [M+H]⁺。HPLC: 99.95%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10.77 (s, 1H), 8.74~8.52 (m, 2H), 8.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.25 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 7.23~7.19 (m, 2H), 7.16 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.25 (d, J = 20.0 Hz, 3H), 4.14 (s, 1H), 3.80 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.40 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.20 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 3.07 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.02 (s, 3H), 1.99~1.83 (m, 2H), 1.35 (m, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 169.01, 166.63, 162.76, 161.63, 157.77, 146.56, 136.83, 132.28, 132.02, 129.09, 127.38, 126.57, 126.50, 126.10, 124.97, 123.68, 122.85, 55.92, 51.71, 45.16, 40.39, 32.42, 31.59, 29.09, 21.48。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₈H₃₁N₆O₄) 515.240 1, Found 515.240 2。

B4产率9.2%。ESI-MS (m/z): 501.2 [M+H]⁺。mp: 75~76 ℃。HPLC: 99.61%。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10.35 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.91 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.18~7.09 (m, 5H), 5.13 (s, 1H), 4.58 (s, 2H), 4.24 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 4.13 (s, 1H), 4.05 (s, 2H), 3.80 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.21 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.14 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 2.93 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 2.81 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 2.02 (s, 3H), 1.97~1.85 (m, 2H), 1.81 (s, 1H), 1.47~1.22 (m, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 168.53, 162.96, 161.83, 158.19, 154.58, 146.86, 137.51, 135.60, 134.51, 133.91, 129.17, 126.80, 126.59, 126.04, 120.84, 119.81, 104.29, 59.20, 54.74, 51.27, 47.48, 44.87, 32.13, 31.40, 29.59, 21.78。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₈H₃₃N₆O₃) 501.260 9, Found 501.260 3。

1.8 3-亚甲基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(14)

将溴化三苯基甲基鏻(14.5 g, 40.5 mmol)溶于无水四氢呋喃中, 冰浴下缓慢加入二异丙基氨基锂(20 mL, 2 mol·L^-1 in THF), 冰浴反应1 h后, 加入化合物13 (5 g, 27 mmol), 室温反应2 h, TLC监测反应完全后(高锰酸钾显色), 缓慢滴加乙酸乙酯和饱和氯化钠水溶液淬灭, 有大量不溶物生成, 过滤, 滤液用乙酸乙酯萃取3次, 有机层干燥浓缩。柱色谱(V_石油醚:V_乙酸乙酯=10:1)得到白色固体产物(1.5 g, 30.0%)。ESI-MS (m/z): 184.1 [M+H]⁺。

1.9 叔丁基-1-氧杂-5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-甲酸甲酯(15)

将化合物14 (1.5 g, 8.29 mmol)溶于二氯甲烷(15 mL)中, 加入间氯过氧苯甲酸(1.7 g, 9.94 mmol)。室温反应2 h, LC-MS监测反应完全后, 加乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠萃取3次, 合并有机相, 减压浓缩后直接进行下一步。ESI-MS (m/z): 200.3 [M+H]⁺。

1.10 叔丁基-1-氧杂-5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-甲酸甲酯(16)

将化合物15 (1.5 g, 7.5 mmol)溶于甲醇(15 mL)中, 加入四氢异喹啉(2 g, 15 mmol), 室温反应2 h, LC-MS监测反应完全后, 减压浓缩, 柱色谱(100%V_石油醚)得到黄色油状产物2.4 g (粗品)。ESI-MS (m/z): 333.2 [M+H]⁺。

1.11 叔丁基3-((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)-3-羟基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(17)

将化合物16 (2.4 g, 7.21 mmol)溶于无水二氯甲烷(20 mL)中, 加入三氟乙酸(5 mL), 室温反应过夜。LC-MS监测反应完全后, 加入水和乙酸乙酯萃取3次, LC-MS监测产物在水相, 合并水相, 减压浓缩冻干, 得到油状产物3.9 g (粗品)。ESI-MS (m/z): 233.1 [M+H]⁺。

1.12 (6-氯嘧啶-4基)(3-((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲酮(18)

1.13 1-(4-((6-(3-((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)-3-羟基吡咯烷-1-羰基]嘧啶-4-基）氨基）哌啶-1-基）乙-1-酮(B5)

将化合物18 (200 mg, 0.54 mmol)溶于异丙醇(4 mL)中, 加入N, N-二异丙基乙胺(139 mg, 1.08 mmol)、1-乙酰基-4-氨基哌啶(276 mg, 1.08 mmol), 100 ℃回流反应过夜, LC-MS监测反应完全后, 减压浓缩后, HPLC制备分离(乙腈/水, 0.1%甲酸)得到白色固体产物(58 mg, 22.5%)。mp: 59~60 ℃。ESI-MS (m/z): 479.3 [M+H]⁺。HPLC: 93.41%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.44 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 8.0, 4.0 Hz, 1H), 7.13~7.05 (m, 3H), 7.04~6.97 (m, 1H), 6.70 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.84 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.08 (s, 1H), 3.78 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 3.73 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 3.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.64~3.53 (m, 2H), 3.44 (s, 1H), 3.17 (t, J = 16.0 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 8.0, 4.0 Hz, 2H), 2.79~2.74 (m, 2H), 2.64 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 2.51 (s, 1H), 2.50 (s, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.97~1.76 (m, 4H), 1.37 (dd, J = 24.0, 12.0 Hz, 1H), 1.31~1.19 (m, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 167.43, 164.52, 161.26, 157.95, 156.94, 134.63, 133.49, 127.80, 125.71, 125.27, 124.80, 103.93, 78.91, 63.03, 62.78, 56.65, 51.70, 46.26, 44.36, 43.84, 31.14, 30.40, 28.11, 20.67。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₆H₃₅N₆O₃) 479.276 5, Found 479.276 0。

1.14 3-硝基-1-H-吡唑-5-羧酸(20)

将化合物19 (4 g, 31.47 mmol)、高锰酸钾(15 g, 94 mmol)置于烧瓶中, 加入50 mL水, 搅拌均匀, 回流反应5 h。LC-MS检测原料反应完全, 抽滤, 滤掉黑色固体, 滤液在冰浴下缓慢滴加1 mol·L^-1的稀盐酸调pH至3~4, 减压浓缩除去大部分水, 然后用乙酸乙酯萃取3次, 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压浓缩得到白色固体(2.8 g, 57.2%)。ESI-MS (m/z): 156.0 [M-H]^-。

1.15 (3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)(3-硝基-1H-吡唑-5-基）甲酮(21)

将化合物20 (1 g, 6.37 mmol)、1, 2, 3, 4-四氢异喹啉(1.02 g, 7.64 mmol)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸盐(4.84 g, 12.7 mmol)和N, N-二异丙基乙胺(1.65 g, 12.7 mmol)溶于N, N-二甲基甲酰胺(15 mL), 然后室温搅拌过夜。LC-MS监测原料反应完全。将反应液倒入水中, 用乙酸乙酯萃取3次, 合并有机相, 用饱和食盐水洗涤3次, 无水硫酸钠干燥。柱色谱(V_石油醚:V_乙酸乙酯=5:1)分离纯化得到白色固体(1.7 g, 98.2%)。ESI-MS (m/z): 273.1 [M+H]⁺。

1.16 2-((3-硝基-1H-吡唑-5-基)甲基)-1, 2, 3, 4-四氢异喹啉(22)

将化合物21 (1.7 g, 6.24 mmol)溶于20 mL四氢呋喃, 冰浴下加入硼烷-四氢呋喃溶液(18 mL, 1.0 mol·L^-1), 80 ℃反应过夜。TLC监测反应完成后, 加入20 mL甲醇淬灭剩余的硼烷, 搅拌30 min, 然后加入2 mol·L^-1氢氧化钠水溶液回流1 h, 用乙酸乙酯萃取3次, 乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥, 减压浓缩直接用于下一步。ESI-MS (m/z): 259.1 [M+H]⁺。

1.17 4-氨基-1H-吡唑-3-羧酸(24a)

将化合物23a (6.0 g, 38.7 mmol)溶于乙醇(80 mL)中, 加入氢氧化钠(2.5 g, 62.5 mmol)的水溶液(20 mL), 80 ℃回流反应过夜, LC-MS监测原料基本消失。减压除去溶剂, 加入浓盐酸调pH = 3~4, 冰浴下析出晶体, 抽滤, 用冰水洗涤3次滤饼, 得到白色滤饼(3.7 g, 75.3%)。ESI-MS (m/z): 128.0 [M+H]⁺。

化合物24b、24c的合成方法与24a类似, 产率分别为80.7%、74.0%。24b: ESI-MS (m/z): 128.0 [M+H]⁺; 24c: ESI-MS (m/z): 142.0 [M+H]⁺。

1.18 (4-氨基-1H-吡唑-3-基)(3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲酮(25a)

将化合物24a (3 g, 23.6 mmol)与四氢异喹啉(4.7 g, 35.3 mmol)溶于N, N-二甲基甲酰胺(30 mL)中, 加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸盐(10.7 g, 26.6 mmol)与N, N-二甲基乙二胺(6.1 g, 42.3 mmol), 室温搅拌反应过夜, LC-MS监测原料基本消失。加水和乙酸乙酯萃取3次, 饱和食盐水洗涤3次, 无水硫酸钠干燥, 减压浓缩, 柱色谱分离(V_石油醚:V_乙酸乙酯=1:1)得到黄色油状液体产物(420 mg, 7.4%)。ESI-MS (m/z): 243.1 [M+H]⁺。

化合物25b、25c的合成方法与25a类似, 产率分别为7.6%和9.2%。25b: ESI-MS (m/z): 243.1 [M+H]⁺; 25c: ESI-MS (m/z): 257.1 [M+H]⁺。

1.19 5-((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)-1H-吡唑-3-胺(26a)

将上一步未经纯化的化合物22溶于10 mL甲醇, 加催化量的Pd/C, 在氢气球存在下室温反应过夜。LC-MS监测无原料剩余, 停止反应, 抽滤除去固体不溶物, 滤液减压浓缩得到产物(1.38 g, 95.0%)。ESI-MS (m/z): 229.1 [M+H]⁺。

化合物26b、26c、26d的合成与26a类似, 分别由25a、25b、25c还原得到, 产率分别为37.8%、37.8%、42.3%。26b: ESI-MS (m/z): 229.1 [M+H]⁺; 26c: ESI-MS (m/z): 229.1 [M+H]⁺; 26d: ESI-MS (m/z): 243.1 [M+H]⁺。

1.20 6-氯-N-(5-((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)-1H-吡唑-3-基)嘧啶-4-羧酰胺(27a)

将化合物26a (1.38 g, 6.04 mmol)、三乙胺(1.22 g, 12 mmol)溶于10 mL二氯甲烷, 将6-氯嘧啶-4-羰基氯(1.18 g, 6.65 mmol)溶于二氯甲烷(10 mL), 冰浴下滴加到上述体系, 然后室温反应1 h, LC-MS检测反应完成。将反应液加到水中, 乙酸乙酯萃取, 有机相用饱和食盐水洗3次, 无水硫酸钠干燥, 柱色谱分离(V_二氯甲烷:V_甲醇=20:1)得到黄色固体(660 mg, 29.7%)。ESI-MS (m/z): 369.1 [M+H]⁺。

化合物27b、27c、27d、28的合成与27a类似, 分别由26b、26c、26d与6-氯嘧啶-4-羰基氯经过亲核取代反应得到, 27b、27c、27d产率分别为29.7%、30.7%、26.5%。化合物28产率为31.6%。27b: ESI-MS (m/z): 369.1 [M+H]⁺; 27c: ESI-MS (m/z): 369.1 [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.73 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.15 (s, 3H), 7.06 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.65 (s, 2H), 3.62 (s, 2H), 2.89 (s, 2H), 2.75 (d, J = 12.0 Hz, 2H)。27d: ESI-MS (m/z): 383.1 [M+H]⁺; 28: ESI-MS (m/z): 383.1 [M+H]⁺。

1.21 6-((1-乙酰基哌啶-4-基)氨基)-N-(5-((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)-1H-吡唑-3-基)嘧啶-4-羧酰胺(B6)

将化合物27a (300 mg, 0.813 mmol)、1-乙酰基-4-氨基哌啶(0.416 g, 1.63 mmol)和N, N-二异丙基乙基胺(0.54 mL)溶于异丙醇(10 mL), 100 ℃搅拌过夜, LC-MS检测反应完成, 冷却至室温。浓缩反应液后经HPLC制备色谱(乙腈/水, 0.1%甲酸)得到白色固体(110 mg, 28.5%)。mp: 77~78 ℃。ESI-MS (m/z): 475.2 [M+H]⁺。HPLC: 97.73%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.53 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.92 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.10 (s, 3H), 7.03 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 4.23 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.13 (s, 1H), 3.79 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.70 (s, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.19 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 2.82 (s, 3H), 2.69 (s, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.98~1.84 (m, 2H), 1.40 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.28 (d, J = 12.0 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 168.51, 162.90, 160.91, 158.31, 153.57, 146.27, 135.03, 134.41, 128.91, 126.83, 126.48, 125.97, 104.20, 96.74, 55.53, 52.74, 50.48, 47.49, 44.85, 32.10, 31.37, 29.06, 21.77。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₅H₃₁N₈O₂) 475.256 4, Found 475.255 3。

化合物B7、B8、B9、B10的合成与B6类似, 由27b、27c、27d、28分别与1-乙酰基-4-氨基哌啶经过亲核取代反应得到。B7:产率16.3%。mp: 131~132 ℃。ESI-MS (m/z): 475.2 [M+H]⁺。HPLC: 99.13%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.51 (s, 1H), 11.38 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.25~6.91 (m, 5H), 4.21 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.04 (s, 1H), 3.90 (s, 2H), 3.77 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.65 (s, 2H), 3.15 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 2.99 (s, 2H), 2.89~2.70 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.94~1.78 (m, 2H), 1.34 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.23 (d, J = 12.0 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 168.50, 162.85, 160.00, 157.51, 153.79, 134.88, 128.72, 126.80, 126.59, 125.77, 103.71, 55.93, 55.36, 50.97, 47.39, 44.85, 32.09, 31.35, 29.22, 21.72。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₅H₃₁N₈O₂) 475.256 4, Found 475.255 5。

B8:产率1.6%。ESI-MS (m/z): 475.2 [M+H]⁺。mp: 124~125 ℃。HPLC: 100%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.41 (s, 1H), 11.02 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.21 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.07 (s, 1H), 3.77 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 12.0 Hz, 4H), 3.22~3.12 (m, 1H), 2.88 (s, 2H), 2.83~2.74 (m, 1H), 2.69 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.00 (s, 3H), 1.95~1.78 (m, 2H), 1.36 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.23 (s, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 168.48, 162.88, 161.18, 157.82, 154.04, 135.30, 134.86, 128.77, 126.78, 126.34, 125.79, 107.45, 104.19, 55.83, 52.06, 50.56, 47.39, 44.84, 32.11, 31.37, 29.23, 21.76。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₅H₃₁N₈O₂) 475.256 4, Found 475.255 9。

B9:产率19.6%。mp: 55~56 ℃。ESI-MS (m/z): 489.2 [M+H]⁺。HPLC: 99.4%。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 11.53 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.22 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 7.01 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.68 (s, 1H), 4.50 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.78 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.72 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.20 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 2.98 (s, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 1.96 (s, 1H), 1.81 (s, 1H), 1.49~1.37 (m, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 168.91, 162.72, 160.77, 157.31, 145.31, 134.64, 129.36, 128.48, 126.41, 126.15, 125.52, 107.43, 70.61, 55.99, 51.99, 50.29, 47.58, 45.21, 40.44, 39.23, 32.11, 31.22, 29.16, 21.44。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₆H₃₃N₈O₂) 489.272 1, Found 489.271 1。

B10:产率29.5%。mp: 245~246 ℃。ESI-MS (m/z): 489.2 [M+H]⁺。HPLC: 95.07%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 13.46 (s, 1H), 12.18 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.23 (d, J = 20.0 Hz, 5H), 4.82 (s, 2H), 4.24 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.13 (s, 1H), 3.87 (s, 2H), 3.80 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 3.19 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 2.92 (s, 2H), 2.81 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 2.02 (s, 3H), 1.98~1.80 (m, 2H), 1.40 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.28 (d, J = 12.0 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO) δ 168.50, 164.37, 162.98, 162.86, 161.39, 159.04, 158.55, 152.99, 135.44, 133.88, 128.66, 127.00, 126.91, 126.64, 119.99, 104.59, 47.56, 44.86, 32.09, 31.36, 28.95, 21.72, 14.71。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₅H₂₉N₈O₃) 489.235 7, Found 489.236 9。

1.22 (4-氨基哌啶-1-基)(环丙基)甲酮(30-C1)

将4-叔丁氧羰基氨基哌啶(2 g, 10 mmol)溶于四氢呋喃(20 mL)中, 加入三乙胺(1.5 g, 15 mmol), 室温搅拌0.5 h, 将环丙酰氯(1.25 g, 12 mmol)溶于二氯甲烷中, 缓慢注入上述反应体系中, 室温反应1 h。LC-MS监测反应完全后, 减压除去溶剂, 加入二氯甲烷和饱和碳酸氢钠溶液萃取3次, 减压浓缩得到白色固体2 g, 然后溶于二氯甲烷(10 mL)中, 加入三氟乙酸(3 mL), 室温搅拌6 h。LC-MS监测反应完全后, 减压除去溶剂, 加入二氯甲烷减压除去多余的三氟乙酸, 得到黄色油状粗品(1.05 g, 62.5%)。ESI-MS (m/z): 169.1 [M+H]⁺。

其余胺的合成与此方法类似。30-C2:产率60.5%; ESI-MS (m/z): 183.1 [M+H]⁺。30-C3:产率40.1%; ESI-MS (m/z): 247.1 [M+H]⁺。30-C4:产率73.5%; ESI-MS (m/z): 213.1 [M+H]⁺。30-C5:产率76.2%; ESI-MS (m/z): 211.1 [M+H]⁺。30-C6:产率46.7%; ESI-MS (m/z): 205.1 [M+H]⁺。

1.23 6-((1-(环丙烷羰基)哌啶-4-基)氨基)-N-(4-((3, 4-二氢异喹啉-2(1H)-基)甲基)-1H-吡唑-3-基)嘧啶-4-羧酰胺(C1)

将化合物27c (120 mg, 0.32 mmol)溶于异丙醇(3 mL)中, 加入化合物30-C1 (109 mg, 0.65 mmol)与N, N-二异丙基乙胺(168 mg, 1.30 mmol), 100 ℃回流过夜, LC-MS监测原料基本消失。减压浓缩, 经HPLC制备(乙腈/水, 0.1%甲酸)分离得到白色固体产物(19 mg, 11.9%)。mp: 112~113 ℃。ESI-MS (m/z): 501.2 [M+H]⁺。HPLC: 100%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.45 (s, 1H), 10.83 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.20~6.85 (m, 5H), 4.16 (d, J = 32.0 Hz, 3H), 3.60 (d, J = 32.0 Hz, 4H), 2.86 (s, 4H), 2.68 (s, 2H), 2.06~1.78 (m, 3H), 1.30 (d, J = 48.0 Hz, 2H), 0.70 (d, J = 8.0 Hz, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 171.34, 162.82, 161.08, 157.83, 135.29, 134.85, 128.78, 126.78, 126.35, 125.80, 104.15, 55.83, 52.04, 50.56, 47.51, 44.03, 32.42, 31.40, 29.22, 10.71, 7.36。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₇H₃₃N₈O₂) 501.272 1, Found 501.271 5。

化合物C2~C6的合成方法与C1类似。C2:产率24.5%。mp: 122~123 ℃。ESI-MS (m/z):515.2 [M+H]⁺。HPLC: 99.64%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.45 (s, 1H), 10.84 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.10 (s, 4H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.21 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.07 (s, 1H), 3.61 (dd, J = 36.0, 12.0 Hz, 6H), 3.07 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 28.0, 16.0 Hz, 3H), 2.69 (s, 2H), 2.22~2.02 (m, 4H), 1.95~1.82 (m, 3H), 1.80~1.66 (m, 1H), 1.24 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 172.28, 162.82, 161.12, 157.82, 135.26, 134.83, 128.77, 126.78, 126.35, 125.80, 104.15, 55.81, 52.04, 50.55, 47.47, 43.46, 36.75, 32.27, 31.45, 29.20, 25.11, 25.05, 17.85。HR-MS (ESI): m/z Calcd for (C₂₈H₃₅N₈O₂) 515.287 7, Found 515.287 2。

C3:产率19.6%。mp: 144~145 ℃。ESI-MS (m/z): 579.3 [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.50 (s, 1H), 10.89 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.10 (s, 4H), 7.02 (s, 1H), 4.24 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.11 (s, 1H), 3.95 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.58 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 3.22 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.85 (d, J = 20.0 Hz, 4H), 2.69 (s, 2H), 2.05 (d, J = 20.0 Hz, 2H), 1.98~1.80 (m, 4H), 1.72 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 1.67~1.49 (m, 2H), 1.35 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.25 (d, J = 12.0 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 172.53, 162.83, 161.08, 157.83, 135.28, 134.85, 128.77, 126.78, 126.34, 125.79, 124.27, 121.89, 104.15, 55.83, 52.06, 50.57, 47.43, 43.89, 36.80, 32.91, 32.68, 32.56, 32.44, 31.47, 29.22, 26.10, 26.04。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₃₀H₃₇F₂N₈O₂) 579.300 2, Found 579.299 0。

C4:产率14.2%。mp: 80~81 ℃。ESI-MS (m/z): 545.3 [M+H]⁺。HPLC: 98.92%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.52 (s, 1H), 10.92 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.09 (s, 4H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.10 (s, 1H), 3.94 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 3.84 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.58 (d, J = 12.0 Hz, 4H), 3.38 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 3.20 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.79 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 2.69 (s, 2H), 1.91 (s, 2H), 1.70~1.54 (m, 2H), 1.50 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 1.30 (dd, J = 24.0, 12.0 Hz, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 172.58, 163.72, 162.85, 161.92, 157.95, 153.83, 143.15, 133.95, 133.39, 131.97, 128.81, 126.87, 126.14, 106.25, 104.38, 66.74, 54.54, 51.11, 49.89, 47.46, 43.79, 36.71, 32.56, 31.46, 29.44, 28.07。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₉H₃₇N₈O₃) 545.298 3, Found 545.297 2。

C5:产率18.6%。mp: 83~84 ℃。ESI-MS (m/z):543.3 [M+H]⁺。HPLC: 98.20%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.51 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.10 (s, 4H), 7.02 (s, 1H), 4.26 (s, 1H), 4.10 (s, 1H), 3.89 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.58 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 3.19 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.88 (s, 2H), 2.76 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.69 (s, 2H), 2.59 (s, 1H), 1.90 (d, J = 16.0 Hz, 2H), 1.70 (s, 2H), 1.62 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 1.31 (s, 6H), 1.08 (s, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 173.77, 164.13, 162.84, 161.29, 157.85, 153.88, 142.75, 134.81, 134.62, 131.26, 128.77, 126.80, 126.46, 125.87, 107.06, 104.21, 55.52, 51.82, 50.39, 47.50, 43.86, 32.60, 31.52, 29.70, 29.66, 28.94, 26.07, 25.63。HR-MS (ESI): m/z Calcd. for (C₂₉H₃₇N₈O₃) 543.319 0, Found 543.318 4。

C6:产率18.6%。mp: 135~136 ℃。ESI-MS (m/z): 537.2 [M+H]⁺。HPLC: 99.77%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.46 (s, 1H), 10.87 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.45 (s, 3H), 7.39 (s, 2H), 7.10 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 7.00 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.34 (s, 1H), 4.14 (s, 1H), 3.58 (d, J = 12.0 Hz, 5H), 3.17 (s, 1H), 3.10 (s, 1H), 2.87 (s, 2H), 2.69 (s, 2H), 1.92 (d, J = 32.0 Hz, 2H), 1.39 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 169.51, 162.86, 161.10, 157.82, 136.67, 135.29, 134.85, 129.90, 128.93, 128.76, 127.12, 126.77, 126.33, 125.78, 104.18, 55.83, 52.05, 50.56, 47.38, 46.17, 32.04, 31.40, 29.22。HR-MS (ESI): m/z Calcd for (C₃₀H₃₃N₈O₂) 537.272 1, Found 537.271 6。

2 分子模拟实验

采用Maestro 10.2处理蛋白(PDB: 4x61), 力场OPLS_2005, 用Discovery Studio 2.5处理小分子, 使用Glide Docking进行对接, 采用Pymol 2.0作图。

3 生物活性评价

3.1 化合物体外蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制实验

将制备的化合物和对照化合物GSK3326595用二甲基亚砜配制成10 mmol·L^-1溶液。依次3倍稀释至10.0 μmol·L^-1、3.33 μmol·L^-1、1.11 μmol·L^-1、370.4 nmol·L^-1、123.5 nmol·L^-1、41.2 nmol·L^-1、13.7 nmol·L^-1、4.6 nmol·L^-1、1.5 nmol·L^-1、0.5 nmol·L^-1。实验组:将15 μL的酶溶液移至384孔板, 室温孵育15 min; 对照组:将15 μL 1x反应缓冲液移至384孔板, 室温孵育15 min。向每个孔中添加5 μL底物溶液和5 μL [³H]-SAM溶液开始反应, 室温下孵育60 min。每孔添加5 μL终止溶液终止反应; 将384孔板每孔转移25 μL溶液至Flashplate, 室温至少孵育1 h, 用dH₂O + 0.1% Tween-20洗涤Flashplate 3次, 在Microbeta上读取数值, 计算IC₅₀。

3.2 化合物体外Z-138细胞活性抑制实验^[17]

将化合物用二甲基亚砜配制成10 mmol·L^-1, 依次稀释至33.3 μmol·L^-1、6.66 μmol·L^-1、1.33 μmol·L^-1、267 nmol·L^-1、53.3 nmol·L^-1、10.7 nmol·L^-1、2.13 nmol·L^-1、0.43 nmol·L^-1。用胰蛋白酶消化并确定细胞密度, 以每毫升2 000、4 000和6 000个细胞的密度将细胞浆稀释至所需的体积, 每孔加入100 μL细胞浆液, 在37 ℃潮湿条件下孵育24 h。用二甲基亚砜准备对照和测试化合物溶液(300×), 用1640培养基将对照和待测化合物从300×稀释到3×, 将50 μL化合物(3x)转移至96孔板(最终浓度: 1×), 在37 ℃潮湿条件下孵育。将测定试剂在室温下平衡30 min后, 在每个孔中加入75 μL试剂, 室温孵育, 震荡2 min, 室温孵育10 min, 检测化学发光信号。抑制率= 100-[(复合信号-最小信号)/(最大信号-最小信号)×100]。

3.3 体外化合物对Caco-2细胞透膜性研究^[18]

Caco-2细胞培养:将Caco-2细胞以1×10⁵ cells/cm²密度接种到96孔板的聚乙烯膜上, 平均4~5天更新一次培养液, 直到第21至28天形成融合细胞单层, 使用荧光黄测定Caco-2细胞单层的完整性。

化合物的测试:地高辛稀释到10 μmol·L^-1一式两份双向测试; 纳多洛尔和美托洛尔稀释到2 μmol·L^-1一式两份沿A至B方向测试; 所测化合物稀释到2 μmol·L^-1一式两份双向测试, 最终DMSO浓度不小于1%。将板在(37 ± 1) ℃ CO₂培养箱中以5%的CO₂浓度不摇动的情况下孵育2 h。与含有内标的乙腈溶液混合后所有样品以4 000 r·min^-1离心10 min。然后将100 μL上清液用100 μL蒸馏水稀释进行LC-MS/MS分析。使用分析物/内标物的峰面积比, 通过LC/MS/MS方法对起始溶液、供试溶液和接收液中测试化合物和对照化合物的浓度进行定量。

致谢感谢南京圣和药业药理部生物测试平台杨婷婷等对本文化合物的生物测试所做出的贡献, 感谢姜春环博士、宋开南、陈晓禹、孙洪信等对本文化合物的合成做出的贡献。

作者贡献:王亚洲、尤启冬负责提出研究思路、设计实验方案、修改论文; 朱康乐负责实施实验、整理数据及撰写论文。

利益冲突:本文研究内容无任何利益冲突。

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“重大新药创制”科技部重大专项(2018ZX09301014-006)
“重大新药创制”科技部重大专项(2019ZX09201001-003-005)

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2020年第55卷第8期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-0568

接收时间：2020-04-17
首发时间：2026-01-21
出版时间：2020-08-12

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收稿日期：2020-04-17
修回日期：2020-05-14

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“重大新药创制”科技部重大专项(2019ZX09201001-003-005)

作者信息

1.江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室, 中国药科大学, 江苏南京 210009

2.南京圣和药业股份有限公司, 江苏南京 210000

通讯作者:

*王亚洲,Tel:86-25-81066791, E-mail:wangyzyf@sanhome.com;

尤启冬,Tel:13801580597, E-mail:youqd@cpu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT


Compd.	Bx	PRMT5 IC50/μmol·L^-1
B1		＞10
B2		＞10
B3		＞10
B4		＞10
B5		＞10
GSK3326595		0.045
B6		＞10
B7		＞2.1
B8		0.037
B9		＞10
B10		＞10


Compd.	Cx	IC₅₀/μmol·L^-1
Compd.	Cx	PRMT5	Z-138 cells
B8		0.037	2.2
C1		0.084	1.38
C2		0.034	0.733
C3		0.043	0.651
C4		0.029	0.565
C5		0.026	0.609
C6		0.022	0.413
GSK3326595		0.030	0.025