药学学报

Position^a	δ_H
3	3.93 (1H, d, J = 17.0 Hz)	3.92 (1H, d, J = 17.0 Hz)	4.03 (1H, m)	3.90 (1H, d, J = 17.0 Hz)
	4.23 (1H, d, J = 17.0 Hz)	4.23 (1H, d, J = 17.0 Hz)	4.29 (1H, m)	4.20 (1H, d, J = 17.0 Hz)
6	6.16 (1H, s)	6.16 (1H, s)	6.18 (1H, s)	6.13 (1H, s)
8	7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz)	7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz)	7.31 (1H, d, J = 8.0 Hz)	7.28 (1H, d, J = 8.0 Hz)
9	7.06 (1H, t, J = 7.5 Hz)	7.06 (1H, t, J = 7.5 Hz)	7.06 (1H, m)	7.04 (1H, t, J = 7.5 Hz)
10	7.00 (1H, t, J = 7.5 Hz)	7.00 (1H, t, J = 7.5 Hz)	7.00 (1H, m)	6.98 (1H, t, J = 7.5 Hz)
11	7.54 (1H, d, J = 8.0 Hz)	7.54 (1H, d, J = 8.0 Hz)	7.54 (1H, d, J = 7.7 Hz)	7.52 (1H, d, J = 8.0 Hz)
12	2.95 (1H, m)	2.95 (1H, m)	2.96 (1H, m)	2.95 (1H, m)
	3.49 (1H, m)	3.49 (1H, m)	3.50 (1H, m)	3.49 (1H, m)
12a	4.43 (1H, dd, J = 12, 4.5 Hz)	4.42 (1H, dd, J = 12, 4.5 Hz)	4.4 (1H, dd, J = 11.6, 4.1 Hz)	4.42 (1H, dd, J = 12, 4.5 Hz)
13	3.55 (2H, m)	3.55 (2H, m)	3.49-3.21 (2H, m)	3.52 (2H, m)
14	1.66 (2H, m)	1.66 (2H, m)	3.88 (1H, br m)	1.63 (2H, m)
15	3.39 (2H, m)	3.37 (2H, m)	1.04 (3H, d, J = 6.3 Hz)	3.35 (2H, m)
2'	6.85 (1H, s)	6.84 (1H, s)	6.85 (1H, s)	6.82 (1H, s)
5'/6'	6.75 (2H, m)	6.77 (2H, m)	6.77 (2H, m)	6.73 (2H, m)
7'	5.92 (2H, s)	5.92 (2H, s)	5.92 (2H, s)	5.90 (2H, s)
N-H	11.08 (1H, s)	11.07 (1H, s)	11.08 (1H, s)	11.05 (1H, s)
O-H	4.52 (1H, s)	4.50 (1H, s)	3.35 (1H, s)	4.50 (1H, s)

Position^a	δ_H
3	3.93 (1H, d, J = 17.0 Hz)	3.92 (1H, d, J = 17.0 Hz)	4.03 (1H, m)	3.90 (1H, d, J = 17.0 Hz)
	4.23 (1H, d, J = 17.0 Hz)	4.23 (1H, d, J = 17.0 Hz)	4.29 (1H, m)	4.20 (1H, d, J = 17.0 Hz)
6	6.16 (1H, s)	6.16 (1H, s)	6.18 (1H, s)	6.13 (1H, s)
8	7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz)	7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz)	7.31 (1H, d, J = 8.0 Hz)	7.28 (1H, d, J = 8.0 Hz)
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12	2.95 (1H, m)	2.95 (1H, m)	2.96 (1H, m)	2.95 (1H, m)
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13	3.55 (2H, m)	3.55 (2H, m)	3.49-3.21 (2H, m)	3.52 (2H, m)
14	1.66 (2H, m)	1.66 (2H, m)	3.88 (1H, br m)	1.63 (2H, m)
15	3.39 (2H, m)	3.37 (2H, m)	1.04 (3H, d, J = 6.3 Hz)	3.35 (2H, m)
2'	6.85 (1H, s)	6.84 (1H, s)	6.85 (1H, s)	6.82 (1H, s)
5'/6'	6.75 (2H, m)	6.77 (2H, m)	6.77 (2H, m)	6.73 (2H, m)
7'	5.92 (2H, s)	5.92 (2H, s)	5.92 (2H, s)	5.90 (2H, s)
N-H	11.08 (1H, s)	11.07 (1H, s)	11.08 (1H, s)	11.05 (1H, s)
O-H	4.52 (1H, s)	4.50 (1H, s)	3.35 (1H, s)	4.50 (1H, s)

一种他达拉非衍生物的的发现与鉴定

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冯亭亭 ¹^,²^,³ , 孙健 ² , 张静娴 ² , 于泓 ² , 冯睿 ² , 张甦 ² , 毛秀红 ² , 胡青 ²^,^* , 季申 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2020,55(8): 1877-1881

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药学学报 | 研究论文 2020, 55(8): 1877-1881

一种他达拉非衍生物的的发现与鉴定

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冯亭亭¹^,²^,³, 孙健², 张静娴², 于泓², 冯睿², 张甦², 毛秀红², 胡青²^,^*, 季申¹^,²^,^*

作者信息

1.中国医药工业研究总院, 上海 201203

2.上海市食品药品检验所, 国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室, 上海 201203

3.河北北方学院, 河北张家口 075000

通讯作者:

*胡青,Tel/Fax:86-21-50798195, E-mail:huqingyjs@163.com;

季申,E-mail:jishen2013@163.com

Discovery and identification of a tadalafil analogue

Ting-ting FENG¹^,²^,³, Jian SUN², Jing-xian ZHANG², Hong YU², Rui FENG², Su ZHANG², Xiu-hong MAO², Qing HU²^,^*, Shen JI¹^,²^,^*

Affiliations

1. China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China

2. Shanghai Institute for Food and Drug Control, NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

3. Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China

出版时间: 2020-08-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-0033

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摘要

收起

采用超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱（UHPLC/Q-TOF HRMS）法，从两种宣称具有缓解疲劳、增强免疫力的保健食品中发现了一种他达拉非衍生物。该化合物与2-羟丙基去甲他达拉非的质谱图特征非常相似，但保留时间却略有差异。采用制备液相色谱仪对该衍生物进行分离纯化，经质谱和氢核磁共振分析鉴定为3-羟丙基去甲他达拉非（3-hydroxypropylnortadalafil），为国内首次报道。

关键词

他达拉非衍生物 / 四级杆-飞行时间高分辨质谱 / 磷酸二酯酶5抑制剂 / 保健食品

Abstract

收起

A tadalafil analogue was detected during routine screenings from two "fatigue reliever, immunity enhancer" dietary supplements by using UHPLC/Q-TOF HRMS. The MS² spectrum of this compound was almost identical to that of 2-hydroxypropylnortadalafil. However, the retention time of this analogue was different from that of the 2-hydroxypropylnortadalafil isomers. The analogue was purified by using preparative HPLC and the structure was elucidated by mass spectrometric and NMR spectroscopic experiments. The spectral data suggested that the analogue bore a 3-hydroxypropyl group instead of the N-methyl group in tadalafil. The structure was further confirmed by comparison of the ¹H NMR spectra data with those of the reference standard, and thus named as 3-hydroxypropylnortadalafil. The structure is first reported in China.

Key words

tadalafil analogue / UHPLC/Q-TOF HRMS / PDE-5 / dietary supplement

引用本文

冯亭亭, 孙健, 张静娴, 于泓, 冯睿, 张甦, 毛秀红, 胡青, 季申. 一种他达拉非衍生物的的发现与鉴定. 药学学报, 2020 , 55 (8) : 1877 -1881 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-0033

Ting-ting FENG, Jian SUN, Jing-xian ZHANG, Hong YU, Rui FENG, Su ZHANG, Xiu-hong MAO, Qing HU, Shen JI. Discovery and identification of a tadalafil analogue[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2020 , 55 (8) : 1877 -1881 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-0033

正文

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近年来, 中成药和保健食品中非法添加壮阳作用的磷酸二酯酶(phosphodiesterase 5, PDE-5)抑制剂屡见报道^[1]。针对这种现象, 国家食品药品监督管理局先后颁布了多项法规, 2017年以前主要针对西地那非、豪莫西地那非、伐地那非、他达拉非、氨基他达拉非等13种PDE-5抑制剂检测。不法生产厂商为了逃避监管, 非法添加上述PDE-5抑制剂的衍生物, 其中最常见的是在西地那非、他达拉非、艾迪地非、伐地那非等化合物母核的基础上进行结构修饰, 如文献报道中成药或保健食品中发现了用乙酰氨基^[2]、羟乙基^[3]等取代甲基结构的他达拉非类衍生物。这些衍生物的药理毒理学作用尚不明确, 严重危害消费者健康。同时, 层出不穷的衍生物也给食品药品监管工作带来了一定的挑战。为全面监测和打击食品中添加PDE-5抑制剂衍生物和其他具备抗疲劳的非法药物, 国家食品药品监督管理局2018年颁布了本课题组制定的《食品中那非类物质的测定》 (BJS201805), 对那非类物质的监管增加至了90种, 但是新的PDE-5抑制剂衍生物仍然不断的出现。

本课题组前期已经建立了中成药和保健食品中102种PDE-5抑制剂的快速定性定量分析方法^[4]。在日常检验中, 从两批声称具有缓解体力疲劳、提高免疫力的咖啡饮品中发现了一种新型他达拉非衍生物。采用制备液相色谱方法从样品中分离该未知化合物, 通过质谱信息与核磁数据分析, 对其进行了准确结构鉴定。

材料与方法

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仪器与试药 超高效液相色谱仪串联四级杆-飞行时间高分辨质谱仪(Agilent 1290/Agilent 6530, 美国Agilent公司), 分析天平(CP 224S, 德国Sartorius赛多利斯公司)。制备液相色谱仪(Agilent 1260 InfinityⅡ, 美国Agilent公司), Varian核磁共振仪(500 MHz, 美国瓦里安公司)。乙腈(MS级)、甲醇、甲酸、甲酸铵(色谱纯)均购自德国默克公司; 去离子水(Milli-Q超纯水); 2-羟丙基去甲他达拉非(加拿大TLC公司, 批号1516-091A7, 异构体混合物)。两种咖啡饮品购自网络平台。

供试品溶液制备 分别取两种咖啡饮品1 g, 加甲醇10 mL, 超声30 min, 过滤, 稀释1 000倍, 作为供试品溶液。

色谱条件 Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×3 mm, 1.8 μm); 柱温: 30 ℃; 进样体积: 1 μL; 流动相: A为0.1%甲酸-水溶液, B为0.1%甲酸-乙腈溶液; 梯度洗脱程序: 0~2 min, 20%~30% B; 2~5 min, 30% B; 5~6 min, 30%~45% B; 6~12 min, 45%~70% B; 12~14 min, 70%~98% B; 14~16 min, 98% B; 16~1 min, 98%~20% B; 17~20 min, 20% B。流速: 0.4 mL·min^-1。

质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)正离子模式检测, 扫描范围m/z: 100~1 000。离子源参数:雾化气(N₂): 35 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); 干燥气(N₂)流速15 L·min^-1, 温度200 ℃; 鞘气(N₂)流速12 L·min^-1, 温度350 ℃; 毛细管电压3.5 kV, 碎裂电压250 V, 二级谱碰撞池(CID)电压5~40 eV。

分离纯化 分离纯化采用Varian Prep Star制备液相色谱仪和岛津Shim-pack PREP-ODS色谱柱(20 mm×250 mm, 15 μm); 流动相为甲醇-水(65:35), 流速为20 mL·min^-1, 检测器为紫外检测器(检测波长222 nm)。分别取咖啡饮品12 g, 加甲醇120 mL, 振摇30 min, 过滤, 滤液浓缩至20 mL进样。

结果

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1 未知化合物的发现及结构推断

采用UHPLC/Q-TOF HRMS法对试样中非法添加物筛查时, 在两个咖啡饮品中同时发现一个m/z为434.172 0的未知化合物, 保留时间约为10.20 min, 与2-羟丙基去甲他达拉非具有相同的元素组成(C₂₄H₂₃N₃O₅), 但保留时间略有差别, 2-羟丙基去甲他达拉非为一对光学异构体, 保留时间分别为10.93和11.56 min (图 1), 二级质谱图相似(图 2), 主要碎片离子包括m/z 135.043 8、169.075 5、197.069 0、262.086 0、284.138 6和312.135 5, 推断其可能为2-羟丙基去甲他达拉非的同分异构体。

2 未知化合物的分离纯化

采用制备液相色谱仪对两个咖啡饮品中未知化合物进行分离纯化, 收集主色谱峰(波长220 nm)成分, 减压浓缩除去溶剂, 干燥后分别得未知化合物8.2 mg、13.3 mg。

3 ¹H NMR结构解析

从两个样品中分离出来的化合物具有相似的¹H NMR数据, 见表 1^[5]δ_H6.75 (2H, m)和6.85 (1H, s)为苯并二噁唑苯环的1, 3, 4取代的H信号; δ_H5.9 (2H, s)为苯并二噁唑亚甲基的H信号; δ_H7.54 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.00 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.06 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz)是邻二取代苯的H信号; δ_H 4.52 (1H, s)和11.06 (1H, s)分别为O-H和N-H信号; δ_H 4.43 (1H, dd, J = 12, 4.5 Hz)为烯烃次甲基质子信号; δ_H 6.16 (1H, s)提示次甲基连接多个吸电子基; δ_H 3.93 (1H, d, J = 17 Hz)和4.23 (1H, d, J = 17 Hz)为亚甲基两个不等价氢相互偶合的H信号; 与2-羟丙基去甲他达拉非的母核H信号一致。但是, 未知化合物的¹H NMR没有2-羟丙基去甲他达拉非的δ_H 3.88 (1H, br m)信号(连氧脂肪族次甲基H信号)和δ_H1.04 (3H, d, J = 6.3 Hz)信号(脂肪族甲基H信号), 而多出了δ_H 3.42 (2H, m)信号(与氧相连的亚甲基信号)和δ_H 1.66(2H, m)信号(脂肪族亚甲基H信号), 推测可能为2-羟丙基去甲他达拉非结构中2-羟丙基被3-羟丙基取代。

为了进一步确定未知化合物结构, 定制了构型为6R, 12aR的3-羟丙基去甲他达拉非对照品(加拿大TLC公司), 经比较发现, 未知化合物的保留时间、精确分子量、高分辨二级质谱图及¹H NMR数据与对照品均一致。由此, 可确证未知物的结构为2-羟丙基去甲他达拉非的同分异构体3-羟丙基去甲他达拉非, 化合物结构见图 3。3-羟丙基去甲他达拉非的可能的质谱裂解途径如图 4所示。m/z 312.135 3为母离子失去苯并二噁唑基团的碎片, 且提示双酮哌嗪环结构上有一个C₃H₇O片段。m/z 169.075 5和m/z 197.069 0为他达拉非类化合物中吡啶并吲哚环系统部分的碎片, m/z 135.043 8为苯并二噁唑基团的碎片, 这三个离子是具有双酮哌嗪环的他达拉非类衍生物常见的离子碎片。

讨论

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他达拉非及其衍生物具有较稳定的母核结构, 通过其质谱碎片信息, 可以快速对他达拉非衍生物进行结构推测。目前发现的他达拉非衍生物多数都是双酮哌嗪环上发生结构变化, 一类是在2-N的取代上有差异, 如N-ethyl nortadalafil^[6]、cyclopentyl nortadalafil^[7], 另外一类没有双酮哌嗪环, 如chloropretadalafil^[8]、diethylaminopretadalafil^[9]。比较这些化合物的二级质谱图, 一般含有m/z 135、169、197、262等碎片离子, 低质量区碎片分子量比较类似, 可以帮助此类化合物的快速推断。在他达拉非母核6、12a位有两个手性中心, 存在4种构型, 但顺式他达拉非衍生物(6R, 12aR)活性明显优于反式^[10], 根据产品所描述的功效推断该非法添加的衍生物结构最大可能性为6R、12aR构型。经分离得到的非法添加的未知化合物与定制的6R、12aR构型3-羟丙基去甲他达拉非对照品的保留时间、一级二级质谱及¹H NMR均能匹配, 故确定其为6R、12aR构型的3-羟丙基去甲他达拉非。

后期实验中进一步测定了两种咖啡饮品中3-羟丙基去甲他达拉非含量, 结果显示该化合物含量分别高达1.70和2.05 mg·g^-1, 根据产品标签的用法用量, 每次服用量高达22和25 mg, 超过了同类上市药物他达拉非的每次服用量(10 mg), 对人体存在严重的潜在危险。该化合物在国内尚未被报道, 药理毒理作用尚不清楚, 对人体的潜在危害认知还较为有限, 值得引起关注和追踪。

结论

收起

采用UHPLC/Q-TOF HRMS从两种咖啡饮品中检测发现了2-羟丙基去甲他达拉非的同分异构体, 经分离纯化和¹H NMR确证, 该化合物为2-羟丙基去甲他达拉非的同分异构体3-羟丙基去甲他达拉非, 该化合物化学名为(6R, 12aR)-6-(1, 3-苯并间二氧戊环-5-基)-2-(3-羟丙基)-2, 3, 6, 7, 12, 12a-六氢化吡嗪并[1', 2':1, 6]-吡啶并[3, 4-b]吲哚-1, 4-二酮。此化合物的发现提供了一种新型他达拉非衍生物发现的新思路, 有助于新型衍生物结构的发现, 保障监管工作及时有效。

作者贡献:冯亭亭负责数据采集、分析与撰写文章; 孙健负责实验设计、数据分析和阐释; 张静娴负责数据采集、分析与审阅文章; 于泓负责数据采集、分析; 冯睿负责数据采集、分析; 张甦和毛秀红负责指导; 胡青负责审阅文章与行政支持; 季申负责技术与材料支持, 获取研究经费。

利益冲突:本文无任何利益冲突。

基金

收起

国家科技部重点研发计划(2017YFC1700800)
上海市科委研发平台专项(18DZ2292200)
上海市科委仪器专项(18142202300)
上海科委长三角合作项目(18395810300)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2020年第55卷第8期

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引用本文

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文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-0033

接收时间：2020-01-10
首发时间：2026-01-21
出版时间：2020-08-12

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收稿日期：2020-01-10
修回日期：2020-03-25

基金

国家科技部重点研发计划(2017YFC1700800)

上海市科委研发平台专项(18DZ2292200)

上海市科委仪器专项(18142202300)

上海科委长三角合作项目(18395810300)

作者信息

1.中国医药工业研究总院, 上海 201203

2.上海市食品药品检验所, 国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室, 上海 201203

3.河北北方学院, 河北张家口 075000

通讯作者:

*胡青,Tel/Fax:86-21-50798195, E-mail:huqingyjs@163.com;

季申,E-mail:jishen2013@163.com

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2020-0033

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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