药学学报

Gene	Primer sequence (5'-3')
Runx 2	Forward: -CATCCTTCCCTCCGAGACCCTAA- Reverse: -CCCAACATGGCTGCTCCCTTC-
OCN	Forward: -CTCACTCTGCTGGCCCTGAC- Reverse: -CACCTTACTGCCCTCCTGCTTG-
GAPDH	Forward: -TGAACGGGAAG CTCACTGG- Reverse: -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-

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1, 2, 3, 4, 6-五没食子酰葡萄糖的骨保护作用与Nrf2/HO-1信号通路的相关性研究

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陈婷婷 ¹^,²^,³ , 黄天一 ¹^,²^,³ , 李梦雨 ¹^,²^,³ , 崔杰 ¹^,²^,³ , 华永庆 ¹^,²^,³^,^* , 许惠琴 ²^,³^,^*

药学学报 | 研究论文 2020,55(5): 907-914

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药学学报 | 研究论文 2020, 55(5): 907-914

1, 2, 3, 4, 6-五没食子酰葡萄糖的骨保护作用与Nrf2/HO-1信号通路的相关性研究

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陈婷婷¹^,²^,³, 黄天一¹^,²^,³, 李梦雨¹^,²^,³, 崔杰¹^,²^,³, 华永庆¹^,²^,³^,^*, 许惠琴²^,³^,^*

作者信息

1.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 江苏南京 210023

2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室, 江苏南京 210023

3.南京中医药大学药学院, 江苏南京 210023

通讯作者:

*华永庆, Tel:86-25-85811248, E-mail:huayongqing@126.com;

许惠琴, Tel:86-25-85811933, E-mail:hqxu309@sina.com

Correlation between bone protection of 1, 2, 3, 4, 6-pentyl-O-galloyl-beta-D-glucose and Nrf2/HO-1 signaling pathway

Ting-ting CHEN¹^,²^,³, Tian-yi HUANG¹^,²^,³, Meng-yu LI¹^,²^,³, Jie CUI¹^,²^,³, Yong-qing HUA¹^,²^,³^,^*, Hui-qin XU²^,³^,^*

Affiliations

1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, China

2. Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medical, Nanjing 210023, China

3. School of Pharmacy, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

出版时间: 2020-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0773

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摘要

收起

研究1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖（1，2，3，4，6-pentyl-O-galloyl-beta-D-glucose，PGG）骨保护作用及其抗成骨细胞凋亡相关机制。建立泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型，钙黄绿素染色观察PGG对斑马鱼骨骼面积的影响。体外培养骨髓间充质干细胞，茜素红染色观察钙化结节数目，qRT-PCR法检测成骨细胞分化相关指标Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx 2）和骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）的mRNA水平；体外培养前成骨细胞系MC3T3-E1，过氧化氢（400 μmol·L^-1）建立氧化应激模型，观察在该模型下PGG对成骨细胞的作用。采用MTT法检测PGG对成骨细胞活力的影响；Hoechst 33342染色观察PGG对细胞凋亡的作用；Western blot检测PGG对抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）及下游蛋白血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表达；DCFH-DA荧光染色检测细胞内的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；JC-1荧光染色检测线粒体膜电位水平。结果显示，与模型组相比，PGG可以显著提高斑马鱼模型椎骨面积；成骨细胞分化第14天时，与空白组相比，PGG组钙化结节数目显著增多，Runx 2、OCN的mRNA水平显著提高；此外，在氧化应激环境下，PGG可以提高成骨细胞活力，显著减少凋亡细胞数，提高Bcl-2/Bax的比率；荧光染色结果显示，PGG降低细胞内ROS荧光密度，提高线粒体膜电位。Western blot实验数据显示，PGG可以促进核内Nrf2蛋白表达，并增强下游蛋白HO-1的表达。综上，PGG可改善斑马鱼骨质疏松，且该作用可能与调控Nrf2/HO-1信号通路改善线粒体功能障碍，抗氧化应激环境下成骨细胞凋亡从而促进骨形成有关。本研究为抗骨质疏松治疗药物的发现提供新的思路与线索。

关键词

骨质疏松 / 1, 2, 3, 4, 6-五没食子酰葡萄糖 / MC3T3-E1 / 细胞凋亡 / 线粒体 / Nrf2/HO-1

Abstract

收起

To study the osteoprotective effect of 1, 2, 3, 4, 6-pentyl-O-galloyl-beta-D-glucose (PGG) its anti-osteoblast apoptosis related mechanism was investigated. A model of zebrafish osteoporosis induced by prednisolone (Pred, 25 μmol·L^-1) was established in vivo, and calcein staining was used to detect the effect of PGG on the bone area of zebrafish. Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in vitro, and the number of calcified nodules was observed by alizarin red staining, and the relevant indexes of osteoblast differentiation runt-related transcription factor 2 (Runx 2), osteocalcin (OCN) mRNA level were detected by qRT-PCR. The osteoblast cell line MC3T3-E1 cells was cultured in vitro, and 400 μmol·L^-1 hydrogen peroxide (H₂O₂) was used to intervene the injury to detect the effect of PGG on osteoblasts under oxidative stress. The effect of PGG on osteoblast activity was detected by MTT assay. The effect of PGG on apoptosis was observed by Hoechst 33342 staining. Western blot was used to detect the expression of Bcl-2, Bax, nuclear factor erythroid-2-related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase-1 (HO-1). DCFH-DA fluorescence staining for detection of reactive oxygen species (ROS) levels. JC-1 staining was used to detect mitochondrial membrane potential levels. The results showed that PGG could significantly increase the vertebral area of the zebrafish model when compared with the model group. On the 14 th day of osteoblast differentiation, the number of calcified nodules in the PGG group was significantly increased when compared with the control group and the mRNA levels of Runx 2 and OCN were also significantly increased. In addition, under oxidative stress, PGG could increase osteoblast viability, significantly reduce the number of apoptotic cells, and increase the ratio of Bcl-2/Bax. Fluorescence staining results show that PGG decreased intracellular ROS fluorescence density and increased mitochondrial membrane potential. Western blot data showed that PGG could promote the expression of Nrf2 in the nuclear and enhance the expression of downstream protein HO-1. In conclusion, PGG could improve osteoporosis in zebrafish, and this effect may be related to the regulation of Nrf2/HO-1 signaling pathway to improve mitochondrial dysfunction, anti-oxidative stress in osteoblast apoptosis and promote bone formation. This study provides new ideas and clues for the discovery of anti-osteoporosis drugs.

Key words

osteoporosis / 1, 2, 3, 4, 6-pentyl-O-galloyl-beta-D-glucose / MC3T3-E1 / cellular apoptosis / mitochondria / Nrf2/HO-1

引用本文

陈婷婷, 黄天一, 李梦雨, 崔杰, 华永庆, 许惠琴. 1, 2, 3, 4, 6-五没食子酰葡萄糖的骨保护作用与Nrf2/HO-1信号通路的相关性研究. 药学学报, 2020 , 55 (5) : 907 -914 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0773

Ting-ting CHEN, Tian-yi HUANG, Meng-yu LI, Jie CUI, Yong-qing HUA, Hui-qin XU. Correlation between bone protection of 1, 2, 3, 4, 6-pentyl-O-galloyl-beta-D-glucose and Nrf2/HO-1 signaling pathway[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2020 , 55 (5) : 907 -914 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0773

正文

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骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种全身性骨代谢疾病, 在中国大陆慢性病中发病率高居第3位^[1], 其特征在于骨量和微结构的全身性损伤, 导致脆性骨折。目前研究认为衰老、雌激素水平下降等多种因素引起的氧化应激是OP发生的重要原因^[2]。体内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平过高, 可导致线粒体肿胀, 线粒体膜通透性增加, 功能降低, 从而进一步加剧ROS产生, 诱导细胞凋亡^[3]。成骨细胞是参与骨骼形成的主要细胞, 其过度凋亡会影响骨骼修复, 导致OP^[4]。

目前, 临床用于OP治疗的一线药物主要是双磷酸盐类, 但长期使用会增加非典型骨折、骨坏死等不良反应风险^[5]。中医药治疗OP具有显著的潜力和优势, 正逐渐被接受和使用。中医药治疗OP主要以滋补肝肾、养肾健脾和活血化瘀为主。白芍具有补血、柔肝和滋阴等作用, 是组成治疗OP中药复方制剂的重要单味药之一, 其使用频率可达约1/3^[6]。白芍的主要化学成分是萜类和酚类化合物。已有报道^[7]证实芍药苷等萜类化合物具有抗OP的活性。而以1, 2, 3, 4, 6-五没食子酰葡萄糖(1, 2, 3, 4, 6-pentyl-O-galloyl-beta-D-glucose, PGG)为代表的酚类活性成分尚未获得重视。已有研究表明, 酚类化合物可促进成骨细胞增殖、分化, 对成骨细胞具有保护作用, 并且该作用可能与抗氧化作用有关^[8]。然而, PGG对成骨细胞是否具有保护作用尚未见报道。核因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2)是抗氧化的重要信号通路, 能调控下游多种抗氧化酶表达, 如血红素氧合酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)^[9]。本文旨在通过斑马鱼OP模型观察PGG的骨保护作用, 并进一步探讨其在氧化应激环境下对成骨细胞的作用及其与Nrf2/HO-1通路的关系。

材料与方法

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实验动物与细胞 AB品系受精后1天(1 day post fertilization, 1 dpf)斑马鱼, 购自江苏凯基生物技术股份有限公司。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)提取于1~2周龄的SD大鼠, 前成骨细胞系MC3T3-E1购自中国科学院上海细胞库。

主要试剂 PGG(上海源叶生物有限公司, 批号: lw16041905, 纯度为99.9%); 17β-雌二醇(17β-estradiol, E2, Sigma公司); 茜素红染液(武汉谷歌生物科技有限公司); HiScript^®Ⅱ Q RT SuperMix For qPCR (+ g DNA wiper) (Vazyme Biotech公司); Bcl-2抗体、Bax抗体、Nrf2抗体、β-tublin抗体(Proteintech公司); HO-1抗体(Santa Cruz biotechnology公司); Hoechst 33342试剂盒、活性氧检测试剂盒、JC-1检测试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天公司); 泼尼松龙(prednisolone, Pred)、钙黄绿素(上海源叶生物有限公司)。

主要仪器 酶标仪(Bio-Tek, 型号: SyneRgy2)、电泳仪(型号: mini-protean powerpac basic)、数字化凝胶成像工作站(型号: ChemiDocTMRS+) (美国BIO-RAD公司); 体式显微镜(型号: stemi 2000-C); 活细胞工作站(AXIO vert A1) (德国ZEISS公司)。

斑马鱼实验 挑选出培养2天后卵健康的3 dpf斑马鱼随机分为6组:空白组、Pred组、阳性药E2组(1×10^-8 mol·L^-1)、PGG组(1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8 mol·L^-1), 置于6孔板中, 每孔给予3 mL培养基。从3 dpf开始, 空白组斑马鱼培养基中含0.1%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO), Pred组及其他各加药组参照文献[10]方法选取含0.1% DMSO的Pred (25 μmol·L^-1)。从5 dpf开始给药, 空白组斑马鱼培养基不变, Pred组按Pred (25 μmol·L^-1)给药, E2组选取含0.1% DMSO对应浓度给药, PGG组按0.1% DMSO对应浓度给药, 每天换液, 连续给药4天。为了检测斑马鱼幼鱼椎骨钙沉积, 进行钙黄绿素染色, 将9 dpf的斑马鱼置于二次蒸馏水中静置1 h, 除去斑马鱼体表药物, 然后将斑马鱼放于暗室中, 用0.2%钙黄绿素(pH 7)孵育1 h, 最后在水中漂洗3次, 并在二次蒸馏水中再静置1 h, 除去未结合染液。置于荧光显微镜下观察拍照。

细胞培养 MC3T3-E1细胞及BMSCs均用含10%热灭活胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养基, 在37 ℃、5% CO₂和饱和湿度的培养箱中进行培养。隔天换液, 当细胞长至85%左右时, 用含0.02%乙二胺四乙酸的0.25%胰酶消化。

茜素红染色检测钙化结节 BMSCs以5×10⁴个/孔接种于24孔板中, 分为空白组、PGG组(1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8 mol·L^-1)。细胞贴壁24 h后, 空白组加入成骨细胞分化液, PGG组加入含有相应浓度药物的成骨细胞分化液, 每3天换1次分化液。分化第14天时, 每孔加入4%多聚甲醛1 mL固定10 min, 磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤2次, 加入500 μL茜素红染液染色5 min, 三蒸水洗净, 置于显微镜下拍照。

RT-qPCR检测Runx 2、OCN mRNA水平 通过总RNA提取试剂(Vazyme Biotech公司)分离和纯化总RNA。使用Synergy 2多模式微孔板读数器测定RNA浓度。然后, 使用ABI 7500测序检测系统(Applied Biosystems)和AceQ^®qPCRSYBR^®两个母体混合系统(Vazyme Biotech, Q111-02)进行qRT-PCR, 每组设置3个复孔, 以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参, 计算复孔的C_t平均值, 按照2^-ΔΔ^Ct相对定量计算公式得到相对定量结果。序列如下表 1。

MTT检测细胞活力 MC3T3-E1以每孔含培养液200 μL, 1×10⁴个/孔接种于96孔细胞培养板中。细胞分为6组, 分别为空白组、过氧化氢组(hydrogen peroxide, H₂O₂, 400 μmol·L^-1), PGG组(1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7 mol·L^-1), 每孔各设置3个复孔。细胞贴壁24 h后, 除空白组外, 进行H₂O₂损伤, 4 h后除去上清。空白组、H₂O₂组加入含0.1% DMSO的α-MEM培养液200 μL, PGG组加入含对应浓度PGG的培养液200 μL。孵育24 h后弃除板中培养液, 每孔加入MTT溶液(5 mg·mL^-1) 10 μL和不含血清的α-MEM培养基100 μL, 4 h后弃去培养上清, 每孔加入DMSO 150 μL, 使用酶标仪检测490 nm波长处的吸光度(A)值。

Hoechst 33342染色检测细胞凋亡 细胞按5×10³个/孔接种于96孔细胞培养板中, 分为4组:空白组、H₂O₂组、E2组(1×10^-8 mol·L^-1)和PGG组(1×10^-9 mol·L^-1), 每组设置3个复孔。给药24 h后, PBS洗涤2次, 将染液用PBS稀释100倍, 每孔加入50 μL稀释后的染液, 细胞培养箱孵育10 min。吸除含染料的培养液, PBS洗涤2~3次即可在荧光显微镜下观察。

DCFH-DA荧光染色检测ROS水平 细胞按3×10⁴个/孔接种于24孔细胞培养板中, 分为4组:空白组、H₂O₂组、E2组(1×10^-8 mol·L^-1)和PGG组(1×10^-9 mol·L^-1), 每组设置3个复孔。给药24 h后弃去培养基, 用PBS冲洗2次, 加入DCFH-DA (10 μmol·L^-1), 于37 ℃孵育20 min, PBS洗涤2~3次, 置于荧光显微镜下观察拍照。

JC-1荧光染色检测线粒体膜电位 细胞按3×10⁴个/孔接种于24孔细胞培养板中, 分为4组:空白组、H₂O₂组、E2组(1×10^-8 mol·L^-1)和PGG组(1×10^-9 mol·L^-1), 每组设置3个复孔。给药24 h后弃去培养基, 用PBS冲洗2次, 加入JC-1染液工作液, 于37 ℃孵育20 min, PBS洗涤2~3次再置于荧光显微镜下观察。

细胞核、细胞质蛋白Nrf2提取 接种1×10⁶个细胞于100 mm×60 mm大皿中, 细胞分为6组, 分别为空白组、H₂O₂组、PGG组(1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7 mol·L^-1)。按说明书步骤提取细胞核及胞质内蛋白。

Western blot检测Bcl-2和Bax、Nrf2、HO-1蛋白的表达 细胞以3×10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板中, 每孔含培养液1.5 mL。细胞分为6组, 分别为空白组、H₂O₂组、PGG组(1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7 mol·L^-1)。每孔各设置3个复孔。给药24 h后, 按照BCA试剂盒说明书对细胞中总蛋白含量进行测定, 加上样缓冲液, 100 ℃变性10 min。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离, 转移至PVDF膜上, 5%脱脂牛奶封闭1 h, 再分别于Bcl-2抗体(1:1 000)和Bax抗体(1:1 000)、HO-1抗体(1:1 000)、Nrf2抗体(1:1 000)、β-tublin (1:1 000)中过夜(4 ℃), 次日TBST洗膜3次, 包被二抗, 曝光, 以β-tublin作为内参。

统计学分析 实验结果采用$\bar{x} \pm s$表示, 使用Graphpad Prism 7.0软件中单因素方差分析方法比较各组间差异, 运用Dunnett检验方法进行组间比较, P < 0.05具有统计学意义。

结果

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1 PGG改善斑马鱼骨质疏松

钙黄绿素染色结果所示, 与空白组相比, Pred组斑马鱼椎骨节数减少, 椎骨面积减少; 与Pred组相比, E2 (1×10^-8 mol·L^-1)和PGG (1×10^-9、1×10^-8 mol·L^-1)可以显著增加斑马鱼椎骨节数与面积, 促进骨形成(图 1)。该结果显示, PGG可以改善斑马鱼OP模型, 促进骨形成, 具有骨保护作用。

2 PGG促成骨细胞分化

茜素红染色结果所示, 在BMSCs分化第14天时, 与空白组相比, PGG (1×10^-9、1×10^-8 mol·L^-1)出现大量钙化结节, 并且可以显著提高成骨分化指标Runx 2、OCN的mRNA水平(P < 0.05或P < 0.01)。见图 2。

3 PGG提高氧化应激环境下MC3T3-E1细胞活力

MC3T3-E1在H₂O₂的干预下, 细胞活力明显降低(P < 0.01), 当加入1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7 mol·L^-1 PGG时, 可明显升高MC3T3-E1的细胞活力(P < 0.01或P < 0.001)。见图 3。该结果显示, PGG可提高氧化应激环境下MC3T3-E1的细胞活力, 在1×10^-9 mol·L^-1浓度下已有显著作用。因此, 本研究选择该浓度进行后续实验。

4 PGG抑制氧化应激环境下MC3T3-E1细胞凋亡

Hoechst 33342染色结果显示, 与空白组相比, H₂O₂组细胞核发生形态皱缩, 出现明亮、致密浓染的凋亡细胞; 与H₂O₂组相比, E2、PGG组具有凋亡特征的细胞核数目明显减少。并且, 与空白组相比, H₂O₂组可促使抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达降低, 促凋亡蛋白Bax表达升高, Bcl-2/Bax比率显著降低(P < 0.05);与H₂O₂组相比, PGG促进Bcl-2蛋白的表达, 降低Bax蛋白的表达, 显著提高了Bcl-2/Bax的比率(P < 0.01)。见图 4。

5 PGG降低氧化应激环境下MC3T3-E1细胞ROS水平

DCFH-DA荧光染色结果显示, H₂O₂组细胞内ROS荧光密度值显著高于空白组(P < 0.001);与H₂O₂组相比, E2、PGG组细胞内的ROS荧光密度值显著降低(P < 0.01)。见图 5。结果表明, PGG可清除氧化应激环境下MC3T3-E1细胞内的ROS。

6 PGG提高氧化应激环境下MC3T3-E1细胞线粒体膜电位

JC-1荧光染色结果显示, 与空白组相比, H₂O₂组绿色荧光增强, 红色荧光减弱, 合并图偏绿代表线粒体膜电位下降; 与H₂O₂组相比, E2、PGG组绿色荧光减弱, 红色荧光增强, 合并图偏黄代表线粒体膜电位提高。见图 6。结果表明, PGG可改善氧化应激环境下MC3T3-E1细胞的线粒体功能障碍。

7 PGG上调Nrf2/HO-1蛋白的表达

与空白组相比, H₂O₂组核内Nrf2表达降低, 胞质内Nrf2表达升高; 与H₂O₂组相比, PGG可促进核内Nrf2表达, 降低胞质内Nrf2表达。同时, H₂O₂可降低Nrf2下游蛋白HO-1表达, PGG可升高HO-1表达。见图 7。结果表明, PGG可能通过Nrf2/HO-1通路发挥对氧化应激环境下MC3T3-E1的保护作用。

讨论

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机体步入衰老期后, 体内氧化应激水平升高, 骨吸收速率超过骨形成速率, 骨重建失衡形成OP^[11]。目前, 抑制破骨细胞介导的过度骨吸收是治疗OP的主要策略, 而对成骨细胞介导骨形成的干预研究相对较少, 促进骨形成治疗OP的策略已经成为一个新热点。白芍在治疗OP方剂中常被重用, 用量约10~15 g。作为白芍的主要活性成分, 芍药苷被发现可通过调节NF-κB信号通路抑制骨吸收, 并可抑制成骨细胞凋亡、促进骨形成从而改善OP^{[12, 13]}。PGG在白芍中是仅次于芍药苷的标志性成分, 含量高达约20 mg·g^{-1 [14]}。然而PGG对OP的干预效应尚未见报道。研究发现多酚类化合物可促成骨细胞矿化从而促进骨形成, 同时也具有抗成骨细胞凋亡和抑制骨吸收的作用, 该作用可能与其抗氧化能力有关^[15]。PGG是一种典型的多酚化合物, 其抗氧化能力也早已被证实。Ahn等^[16]发现PGG可增强超氧化物歧化酶的活性, 清除细胞内ROS水平, 可延长秀丽隐杆现虫的寿命。Choi等^[17]发现PGG在神经2A细胞中可增强HO-1的表达, 对保护神经细胞有很大的潜力。本研究证实了作为白芍代表性活性成分PGG具有显著的骨保护作用。

成骨细胞起源于骨髓基质的间质细胞, 在骨形成过程中经历增殖、分化、基质矿化及凋亡等过程。本研究采用泼尼松龙诱导的斑马鱼OP模型在整体上观察了PGG对OP的作用。斑马鱼与人类基因高度同源, 具有体积小、产卵量多、发育迅速、胚胎透明, 可直接在体观察骨骼发育等特点, 是研究OP的理想模式生物^[18]。泼尼松龙作为糖皮质激素类药物, 过量使用会导致体内氧化应激水平升高, 骨吸收增强, 骨形成抑制, 使骨量降低最终导致OP^[19]。泼尼松龙诱导的OP模型已获得广泛应用。Zhao等^[20]运用25 μmol·L^-1 Pred成功建立了斑马鱼OP模型, 并验证了淫羊藿低糖苷组分有良好的抗斑马鱼OP作用。本课题组也运用该模型, 用钙黄绿素染色观察斑马鱼脊椎骨荧光强度, 证明了藁本内酯及芍药苷对斑马鱼OP模型有明显改善作用^{[10, 13]}。本研究结果表明PGG可显著增加斑马鱼椎骨节数, 增加斑马鱼骨量, 促进骨形成, 对斑马鱼OP模型有明显改善作用。在成骨分化过程中, Runx 2主要调节骨基质蛋白的表达, 是分化早期的标志物, OCN是中晚期成骨细胞形成的标志物, 其可通过与钙及羟基磷灰石结合促进骨形成。本研究体外进行了BMSCs分化实验, 进一步验证PGG促进骨形成的作用。结果显示, PGG可促进BMSCs产生大量钙化结节, 并可提高Runx 2、OCN mRNA水平, 促进骨形成。

在骨形成过程中, 成骨细胞凋亡引起成骨减少, 抑制其凋亡对促进骨形成至关重要。研究表明, 氧化应激水平升高是导致成骨细胞凋亡的重要因素^[21]。体内过高的ROS水平会引发线粒体膜电位降低, ATP产生减少, 导致线粒体结构和功能受损, 加速细胞凋亡。Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2之间的平衡控制细胞线粒体凋亡途径^[22]。ROS水平过高时, Bax促进线粒体通透性转换孔(PTP)开放, 导致线粒体结构和功能的紊乱, 线粒体的内、外膜依次裂解, 释放出细胞色素C, 诱导细胞凋亡, Bcl-2作用与之相反^[23]。本研究发现, 氧化应激环境下PGG可上调Bcl-2蛋白的表达, 降低Bax蛋白的表达, 清除细胞内的ROS, 恢复线粒体膜电位, 具有抗成骨细胞凋亡的作用。Nrf2是细胞氧化还原稳态的主要调节因子。在生理条件下, Nrf2分布于细胞质内, ROS水平过高时, Nrf2易位至细胞核, 激活下游抗氧化基因HO-1的表达。HO-1可催化血红素分解释放胆绿素, 然后进一步降解为抗氧化活性更强的胆红素^[24], 清除细胞内的ROS。本研究进一步发现, PGG在氧化应激环境下对成骨细胞的保护作用可能与促进Nrf2入核、增强HO-1表达有关。

综上所述, 体内外实验证明, PGG可促进骨形成, 具有骨保护作用, 该作用可能与激活Nrf2/HO-1通路, 改善线粒体功能从而抗成骨细胞凋亡有关。本研究为临床应用PGG治疗OP提供了依据, 为OP治疗药物发现提供了新思路。

基金

收起

国家自然科学基金资助项目(81473390)
江苏省中药资源产业化过程协同创新中心开放课题(ZDXM-2-7)
江苏省中药药效与安全性评价重点实验室资助项目(JKLPSE201818)
江苏省高校优势学科建设项目(PAPD)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Bai

, Xie

, Li

et al . Epidemiological studies on osteoporosis in the past five years in China[J]. Chin J Osteoporosis (中国骨质疏松杂志), 2018, 24: 253-258. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zggzsszz201802025

[2]

Sun

, Gen

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Akkaya

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2020年第55卷第5期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0773

接收时间：2019-09-24
首发时间：2026-01-21
出版时间：2020-05-12

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作者

出版历史

收稿日期：2019-09-24
修回日期：2019-11-12

基金

国家自然科学基金资助项目(81473390)

江苏省中药资源产业化过程协同创新中心开放课题(ZDXM-2-7)

江苏省中药药效与安全性评价重点实验室资助项目(JKLPSE201818)

江苏省高校优势学科建设项目(PAPD)

作者信息

1.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 江苏南京 210023

2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室, 江苏南京 210023

3.南京中医药大学药学院, 江苏南京 210023

通讯作者:

*华永庆, Tel:86-25-85811248, E-mail:huayongqing@126.com;

许惠琴, Tel:86-25-85811933, E-mail:hqxu309@sina.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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