药学学报

同步辐射X射线显微成像研究环糊精自组装beads的三维结构

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段效晖 ¹^,² , 伍丽 ² , 李雪 ² , 徐建 ² , 张国庆 ¹^,² , 李海燕 ² , 覃伟 ² , 殷宪振 ² , 张继稳 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2018,53(2): 291-296

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药学学报 | 研究论文 2018, 53(2): 291-296

同步辐射X射线显微成像研究环糊精自组装beads的三维结构

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段效晖¹^,², 伍丽², 李雪², 徐建², 张国庆¹^,², 李海燕², 覃伟², 殷宪振², 张继稳¹^,²^,^*

作者信息

1.安徽中医药大学药学院, 安徽合肥 230012

2.中国科学院上海药物研究所, 上海 201210

通讯作者:

* 张继稳, Tel/Fax:86-21-20231980, E-mail:jwzhang@simm.ac.cn; 殷宪振, xzyin@mail.shcnc.ac.cn

Three-dimensional structure of beads self-assembled by cyclodextrin using synchrotron radiation X-ray microcomputed tomography

Xiao-hui DUAN¹^,², Li WU², Xue LI², Jian XU², Guo-qing ZHANG¹^,², Hai-yan LI², Wei QIN², Xian-zhen YIN², Ji-wen ZHANG¹^,²^,^*

Affiliations

1. School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China

2. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201210, China

出版时间: 2018-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0989

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摘要

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环糊精和油自组装形成的beads是一种新型的药物递送系统，在油类药物固体化、改善脂溶性药物生物利用度方面具有较强的应用潜力，但beads的形成机制仍不完善。本研究利用同步辐射X射线显微成像技术，测定beads的三维结构，基于对干燥前后beads结构的定量分析，发现beads形成过程中Pickering乳滴的有序性。在添加脂溶性成分后，油相的表面张力改变，对beads的结构会产生影响。因此，在载脂溶性维生素K₁的过程中beads的三维结构会发生改变，但依然可见beads形成过程中Pickering乳滴的有序性。本研究从beads内部三维结构出发，揭示了环糊精半包合形成Pickering乳滴，再有序聚集、组装形成beads的微观过程，完善了beads的形成机制，为beads的进一步研究提供了结构学基础。

关键词

beads / 环糊精 / 同步辐射X射线显微成像技术 / 三维结构 / Pickering乳 / 维生素K₁

Abstract

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Beads, a novel drug delivery system self-assembled by cyclodextrins (CDs) and oil, has potential applications in the solidification of oil drugs and improving the bioavailability of lipid-soluble drugs. However, very few researches were dedicated to the mechanism of beads formation. In this study, three-dimensional structures of beads were visualized and investigated using synchrotron radiation X-ray microcomputed tomography (SR-μCT). The structural changes of beads attributed by drying process were analyzed and confirmed via visualization results of SR-μCT. Productively, it was proposed that Pickering emulsion droplets obtained during beads formation process were spatially localized orderly. Moreover, the effects of loading lipid soluble drug, namely, vitamin K₁, on the structural changes of beads were also analyzed. It is well known that the surface tension of oil phase could be changed by the addition of lipid soluble constituents. It was reasonable that the three-dimensional structure of beads might be altered during the drug loading of vitamin K₁ into the beads. However, although the morphologies of beads were changed to some extent, the ordered Pickering emulsion droplets during the process of beads formation was successfully illustrated based on the SR-μCT results. Conclusively, according to the three-dimensional structural analysis of the beads, this study revealed the organized architecture for Pickering emulsion droplet assembly and beads formation in cyclodextrin semi-inclusion complex, which significantly complements the formation mechanism of beads, and provides a structural basis for the further study of beads.

Key words

beads / cyclodextrin / synchrotron radiation X-ray microcomputed tomography / three-dimensional / Pickering emulsion / vitamin K₁

引用本文

段效晖, 伍丽, 李雪, 徐建, 张国庆, 李海燕, 覃伟, 殷宪振, 张继稳. 同步辐射X射线显微成像研究环糊精自组装beads的三维结构. 药学学报, 2018 , 53 (2) : 291 -296 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0989

Xiao-hui DUAN, Li WU, Xue LI, Jian XU, Guo-qing ZHANG, Hai-yan LI, Wei QIN, Xian-zhen YIN, Ji-wen ZHANG. Three-dimensional structure of beads self-assembled by cyclodextrin using synchrotron radiation X-ray microcomputed tomography[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2018 , 53 (2) : 291 -296 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0989

正文

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据统计, 近90%药物由于其水溶性差而影响其生物利用度, 进而限制了药物的广泛应用^[1-3]。微乳/微粒体系作为常用的制剂载体, 将药物部分或完全包裹于含有亲水基团的脂质中, 以提高药物的吸收。基于环糊精/油的自组装beads给药系统兼具油、水两相, 可在没有表面活性剂或有机溶剂的条件下, 通过脂溶性药物溶于beads的内油相, 实现油性药物固体化, 从而解决药物在水性介质中溶解度差的问题, 进而提高药物的生物利用度^[4-6]。环糊精/油beads作为一种自组装微粒系统, 具有毫米粒径及复杂的内部囊腔结构。受技术手段所限, 目前对于beads系统的认知还停留在基于光学显微镜^{[4, 5]}和扫描电子显微镜(scanning electron micrograph, SEM)^[7]的外观形态定性描述或半定量分析。采用SEM证实beads为表面粗糙的球状颗粒^[8], 若进一步研究其内部结构则必须剖开beads颗粒, 这将造成内部细微结构的破坏; 同时, 高分辨SEM分析方法要求样品绝对干燥, 而内部含有油相的beads很难达到; 采用激光共聚焦显微镜^{[6, 9]}可以观测beads的外部轮廓并实现内部腔室特征的半定量分析, 但由于激光的强度/焦深有限, 能够观测的深度也有限, 且需要对beads的不同成分进行荧光标记; 此外, 也有文献^[10]报道利用X射线衍射法对beads的结构数据进行测定, 但该方法的直观性较差。

同步辐射X射线显微断层扫描技术(synchrotron radiation X-ray microcomputed tomography, SR-μCT)是一种新型的成像技术, 相较于普通的X射线扫描技术, SR-μCT具有高空间分辨率、高物质区分度、结构信息可定量的特点, 可在微米、亚微米级分辨率上展示物体内部三维形貌特征, 高精确度的结构特征定量表征参数, 得到的参数更具有说服力^[11-15]。通过对采集的图片进行三维重建, 得到不同成分在制剂中的静态形貌, 再使用定量分析软件进行处理, 可获取微米及纳米级的定量结构参数等具体数值, 并同时获得固态制剂的内外部细致的结构信息, 经过对信息的整合, 可得到准确的定量数据^[16-18]。

本研究利用SR-μCT获得空白beads自组装结构的Slice和三维形貌图像, 结合三维重建分析其在干燥前后的结构变化, 并基于得到的图像探究beads的形成机制。以脂溶性维生素K₁为例, 对比分析载药前后beads的结构变化, 研究载维生素K₁对beads形态结构的影响。

材料与方法

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实验材料和仪器 α-环糊精(食品级, 德国瓦克化学有限公司); 大豆油(注射级, 铁岭北亚药用油有限公司); 维生素K₁ (安徽万和药物制剂有限公司); 其他所有化学试剂均为分析纯。台式恒温振荡器(THZ-D, 海门市其林贝尔仪器制造有限公司); CCD探测器(pco.2000, 德国PCO-AG公司); 倒置显微镜(TS-100F, 日本尼康株式会社); 真空冷冻干燥仪(FD5-3, 美国金西盟国际集团)。

Beads的制备 经过油与环糊精的种类和比例、制备温度和时间等处方工艺的考察, 最优beads制备方法确定为:将5.8 mL大豆油均匀分散至20 mL (8.1%, w/v) α-环糊精水溶液中, 设置恒温振荡器的温度为28 ℃、搅拌速度为200 r·min^-1, 振摇5天。收集制备得到的beads, 冷冻干燥48 h^[7]。将维生素K₁溶解于大豆油中, 采用同样的制备方法, 得到载维生素K₁的beads。

Beads的显微形态 取适量新制备的固液混合物, 平铺于载玻片上, 在光学显微镜下观察beads形态, 确定其形状和尺寸。

SR-μCT样品的固定 选择胶囊壳为容器来固定样品, 对于未干燥状态的beads, 利用液体或半固体之间的黏合力, 将干燥前的beads固定到胶囊壳内壁。为避免beads内容物的挤出和外观的变形, 小心地将beads稀疏地贴在胶囊内壳上。由于干燥后beads的刚度较好, 将beads填充进胶囊壳即可实现固定。

SR-μCT图像采集 将装有beads的胶囊壳固定到SR-μCT样品图像采集的旋转台上。依托于上海光源的BL13W1“X射线成像及生物医学应用光束线站”对beads进行图像采集, 得到beads的二维投射投影图像(TOMO图)。为获得beads最佳的吸收图像, 根据beads的组成, 基于预实验优化后的成像参数为: X射线能量为16.0 keV, 以分辨率为7.4 μm的CCD探测器对光信号进行采集, 采用2倍放大镜头, 有效分辨率为3.7 μm, 曝光时间2.0 s, 样品与探测器的距离为12 cm。旋转台旋转180°完成1次CT图像采集, 共采集720张投影图像。每间隔120张投影图像采集2张白场图像(即X射线光束路径上没有样本的图像), 最后采集5张暗场图像(即X射线照射关闭的图像), 以校正电子噪声和X射线源亮度的变化, 优化采集图像的质量。

SR-μCT图像处理与定量分析 对同步辐射显微CT输出的TOMO图做进一步的处理, 以便对微观结构进行定量描述。为提高具有微小密度差异的不同材料间的区分度, 使用由上海光源开发的软件PITRE (Phase-sensitive X-ray Image Processing and Tomography RE Construction)进行同轴成像的相位恢复, 并重建投影图像、得到Slice图。使用VG Studio Max (Version 2.1, Volume Graphics GmbH, Germany)和Image Pro Analyzer 3D (Version 7.0, Media Cybernetics, Inc., USA)分析渲染三维数据, 构建立体结构模型以获得数据。

统计学方法 对图像中提取得到的定量结构参数采用SPSS17.0软件处理, 利用t检验分析考察数据之间差异性及相关性:当P > 0.05时, 认为两组数据间差异不具有显著性。

结果

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1 Beads的二维Slices结构

普通光学显微镜下, 干燥前空白和载维生素K₁的beads在乳液体系中外观均呈圆形或椭圆形。通过光学显微镜只能观察到beads的外部形状, 难以得到精细的内部结构和外部形貌。

基于beads与胶囊壳、空气三者对X射线的吸收差异性, 可实现对beads结构的识别(图 1)。视野下的beads颗粒在干燥前后均具有相对均匀的形状和尺寸, 而beads内部各个区域的灰度值不均匀, 表明beads内部的材料分布不均匀。

干燥前后beads表面形态具有明显差异。对比beads的Slices图(图 1), 可见干燥前空白beads表面粗糙, 黏附在胶囊内壁上, 表面有不规则的突起。而干燥后的beads沉积在胶囊壳底部, 其表面相对光滑, beads之间相互挤压没有产生表面的形变, 可见beads的结构较为坚实。部分beads表面有向内凹陷的孔洞, 或在内部出现大的腔室结构, 此时依然可见beads内部灰度值的不均匀分布。

干燥前后beads的内部细微结构有明显区别。对比不同层面的Slices图(图 1), 可见干燥过程会在beads内部形成孔洞结构。干燥前空白beads中几乎无内部孔洞, 干燥后beads中既可见一些灰度值较低的腔室结构, 又可见与外周区域灰度值接近的孔洞。这些孔洞圆形度较好, 分布在beads的中心区域或外周、与外界空气连通, 而结合beads的制备过程, 推测孔洞是由于干燥过程中水分流失形成的, 而干燥前beads中较低灰度值的圆形区域即代表被包封的水或油成分。

基于灰度着色(从蓝色到红色代表密度逐渐增大), 选取具有代表性beads中间的Slices图进一步提取beads的内部结构(图 2), 同时也可得到beads中不同材料的分布情况。对比着色后Slices图可见, 空白beads在干燥前中心蓝色区域面积较大, 表明干燥前beads的整体密度较低, 其中圆形度良好的深蓝色区域代表内部密度最低的腔室结构。干燥后beads蓝色区域变少、红色区域变多, 认为是水分挥发后环糊精聚集导致其密度增大, 进而推测beads在干燥后粒径会适当地缩小。干燥beads中深蓝色区域分区更加明显, 可见该区域为被包裹的油成分, 而干燥后形成的孔洞是由被包裹的水分子挥发所造成的, 这样的孔洞不仅出现在靠近beads底部的位置, 在其中部表层同样可以发现成型的孔洞, 且有部分连通表面。

值得注意的是, beads内部液滴位置的分布具有规律性, 明显可见靠近外周的液滴排布呈现漩涡状, 推测这与beads的形成机制有关。

2 Beads的内部三维结构

渲染三维图像得到干燥前后空白beads的内部结构见图 3。干燥前beads内部液滴之间连接较多, 而干燥后beads内部液滴之间更为分散, 且部分与表面相连通的腔室内部液体挥发, 形成孔洞。经图像处理, 可见干燥后beads内部仍有未挥发的液滴, 依然被很好地保留在beads中, 表明beads的坚固外壳对部分油滴有较好的保护作用。观察beads内部腔室的分布规律, 可清晰地看到液滴集中在beads中心, 并从中心向外周环绕, 呈现单层面的漩涡状排列方式。对比干燥前后的外观形态, 可见空白beads干燥前外观形态较为规整, 而干燥后表面凹陷、出现坑洞。通过定量数据计算可得, 空白beads的球形度干燥前为0.92 ± 0.01 (n = 10), 干燥后为0.90 ± 0.04 (n = 10), 相比之下, 干燥前beads的平均球形度更接近于1, 认为干燥前的球形度更高, 但两组数据之间t检验结果表明没有明显差异(P = 0.258);干燥前后beads的半径比: 1.74 ± 0.02 (n= 10)、1.79 ± 0.27 (n = 10), 可见干燥前beads的半径比更接近于1, 但两组数据之间t检验结果没有明显差异(P = 0.615)。

3 Beads形成机制探究

已有文献^{[4, 6, 7]}对beads的形成机制进行了描述:振摇时从乳液中析出环糊精部分结构和油分子形成半包合物或超分子晶体物质, 该固体颗粒吸附在油滴的表面形成Pickering乳滴, 经外力不断振摇, 该种晶体物质在油滴表面聚集、油滴之间团聚, 直至形成坚硬的beads颗粒, 由于其性质上相对稳定, 可以起到稳定beads内部油滴的作用。但对于尺寸较小的Pickering乳滴是如何聚集形成beads, 并没有文献报道。从Slices图的动态解析中可见, beads内部油滴的分布呈现出一定的规律性:油滴集中在beads的中心位置, 并在某一平面上向外呈漩涡状扩展, 部分油滴连通至beads表面(图 4), 形成beads表面的孔洞以及与外界相连通的腔室。在对多个beads的不同层面Slices图的比较中, 可推测这样的内部结构和beads的形成机制是密不可分的。

结合beads的制备过程, 分析beads的形成机制(图 5)可知:油水混合物在振荡过程中, 环糊精和大豆油中的甘油三酯结合, 最先形成半包合物并析出超分子晶体。这些超分子物质的亲油基团吸附在油滴表面, 亲水基团向外, 形成相对稳定的Pickering乳滴。进一步的振摇使得Pickering乳滴团聚, 部分Pickering乳滴之间会发生融合, 聚集成更大的乳滴参与团聚。由于内部的油滴变大, 整体的比表面积变小, 导致形成大乳滴所需的固体颗粒变少, 多余的颗粒可能会堆积在乳滴表面, 这样的形成方式也可以解释beads内部每层油滴之间距离较远的现象。持续的振摇形成beads最初的核心部分, 新的乳滴不断地团聚在初生beads的表面并逐渐形成肉眼可见的beads颗粒。并且可认为在振摇制备过程中, beads的滚动方向较为单一, 在内核形成后不断地在某一平面上滚动并团聚乳滴, 进而推测在一定范围内beads的含油量会随着振荡时间的延长而逐渐加大。

4 载药对beads形成机制的验证

本研究选择脂溶性药物维生素K₁作为模型药物, 考察载药beads的形成机制。将维生素K₁加到油相中, 按相同的方法制备得到载药beads。通过SR-μCT观察干燥后载药beads的二维结构(图 6a, b), 可见其形态与空白beads有较大的差异性。对基于灰度值着色(从蓝色到红色代表密度逐渐增大)后的载药beads进行分析(图 6b), 其内部的对比度相较于空白beads明显增大, 表明载药后beads内部的密度差异更大, 其表面可见红色区域, 同时beads内部存在明显的蓝色区域, 说明聚集在表面的环糊精较空白beads更为密集。由于油相中含维生素K₁, 油相的表面张力改变, 油滴的体积增大而比表面积减小, 即Pickering乳滴变大, 形成乳滴所需的环糊精量减少, 从而单个beads里可包裹更多的油分子, 形成如图 6b中的形态。

在渲染得到载维生素K₁的beads三维图像中(图 6c, d), 可明显看到载维生素K₁后beads的外部形态不规则, 外观更为皱缩, 表面崎岖, 球形度较低, 其粒径相对于空白beads略小。通过定量数据计算可得, 载维生素K₁的beads球形度为0.67 ± 0.03 (n= 10), 其半径比为5.65 ± 2.92 (n= 10)。对比干燥前空白beads的球形度(0.92 ± 0.01, n= 10)和半径比(1.74 ± 0.02, n= 10), 经t检验两组数据均具有明显差异(P < 0.01), 故载药后beads的球形度降低。

对比空白beads和载维生素K₁的beads三维图像, 可见空白beads内部腔室之间相对独立, 而载维生素K₁的beads内部液滴分布更为集中, 部分腔室相互连接形成较大的液滴腔室, 且内部没有发现明显的水分干燥后形成的孔洞, 油滴相对集中于beads的中心位置, 但仍可见漩涡状的液滴排布(图 6c), 说明在振摇的过程中, 由于油相表面张力的变化, 乳滴之间发生了进一步的聚集, 最终形成了比空白beads中粒径更大的内部油滴。

讨论

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环糊精是一种可用于载药的基础材料, 而beads是一种新型载体, 对于其形成机制的研究, 大多数文献均认可从半包合物的形成到Pickering乳滴的形成, 但这样的形成机制并不完善, beads形成机制的不明确限制了该剂型的进一步发展。SR-μCT作为一种原位、无损的检测工具, 在beads外观形态及内部精细结构的表征上发挥了重大的作用, 能够多层次多角度地观测beads形态结构, 为探索其在形成过程中可能遵循的机制提供了可能。通过SR-μCT对beads三维图像分析, 不仅可以清晰地看到beads表面的形态, 更能够深入观察beads内部液滴腔室的分布情况。本研究从beads内部结构出发, 揭示了由环糊精半包合形成Pickering乳滴, 再有序聚集、组装形成beads的过程, 完善了beads的形成机制。经过载药实验验证, 载脂溶性维生素K₁的beads透视图依然可见乳滴的形成规律, 同时揭示了油相表面张力的改变对beads形态结构的影响。

基金

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国家科技重大专项资助项目(2017zx09101-001)
中国博士后科学基金资助项目(2017M610284)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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2018年第53卷第2期

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157

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0989

接收时间：2017-10-09
首发时间：2026-01-15
出版时间：2018-02-12

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收稿日期：2017-10-09
录用日期：2017-11-27

基金

国家科技重大专项资助项目(2017zx09101-001)

中国博士后科学基金资助项目(2017M610284)

作者信息

1.安徽中医药大学药学院, 安徽合肥 230012

2.中国科学院上海药物研究所, 上海 201210

通讯作者:

* 张继稳, Tel/Fax:86-21-20231980, E-mail:jwzhang@simm.ac.cn; 殷宪振, xzyin@mail.shcnc.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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