药学学报

儿茶素对脂多糖诱导的BV-2细胞炎性反应的作用

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王青 ¹ , 贾哲琳 ² , 宋丽娟 ¹ , 尉杰忠 ³ , 杨智超 ¹ , 姜维佳 ¹ , 肖保国 ⁴ , 马存根 ¹^,³^,^*

药学学报 | 研究论文 2018,53(2): 244-248

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儿茶素对脂多糖诱导的BV-2细胞炎性反应的作用

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王青¹, 贾哲琳², 宋丽娟¹, 尉杰忠³, 杨智超¹, 姜维佳¹, 肖保国⁴, 马存根¹^,³^,^*

作者信息

1.山西中医药大学国家中医药管理局益气活血重点研究室, 山西晋中 030619

2.山西医科大学第一临床医学院, 山西太原 030001

3.山西大同大学脑科学研究所, 山西大同 037009

4.上海复旦大学神经病学研究所, 上海 200040

通讯作者:

* 马存根, Tel/Fax:86-352-7158665, E-mail:macungen2001@163.com

The effects of catechin on inflammatory response induced by lipopolysaccharide in BV-2 cells

Qing WANG¹, Zhe-lin JIA², Li-juan SONG¹, Jie-zhong YU³, Zhi-chao YANG¹, Wei-jia JIANG¹, Bao-guo XIAO⁴, Cun-gen MA¹^,³^,^*

Affiliations

1. The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China

2. First Affiliated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

3. Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, China

4. Institute of Neurology, Fudan University, Shanghai 200040, China

出版时间: 2018-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0993

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摘要

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探索儿茶素对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的BV-2细胞炎性反应的作用。MTT法观察儿茶素对BV-2细胞增殖的影响；1 mg·L^-1 LPS处理BV-2细胞建立体外小胶质细胞炎症模型；在该模型下加入儿茶素共孵育后，分别用ELISA法、HE染色和Western blot法检测儿茶素对LPS诱导的BV-2细胞分泌的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）及细胞形态改变和NF-κB磷酸化的影响。另外，采用transwell法检测不同浓度儿茶素对LPS介导的细胞趋化行为的影响。儿茶素对BV-2细胞无毒性；且与LPS组相比，儿茶素可显著降低LPS引起的BV-2细胞的TNF-α和IL-1β的释放及细胞趋化行为，逆转细胞形态改变，抑制NF-κB的磷酸化。因此，儿茶素能够抑制LPS诱导的BV-2细胞的炎性反应。

关键词

儿茶素 / 脂多糖 / BV-2细胞 / 炎性反应

Abstract

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The effects of catechin on inflammatory response of BV-2 cells were investigated using the lipopolysaccharide (LPS) model. BV-2 cells were incubated with LPS (1 mg·L^-1) for 12 h in the microglia inflammatory model in vitro. After catechin and LPS co-incubation for 12 h, MTT, ELISA and Western blot were used to detect cell viability, cytokines, cell migration and protein expression. In addition, transwell assay was conducted to investigate the effect of catechin on cell chemokaxis. Catechin did not show any cytotoxicity effect on BV-2 cells, but reversed the change in cell morphology and inhibited the release of TNF-α and IL-1β, cell chemotaxis and phosphorylation of NF-κB/p65. In conclusion, Catechin could inhibit the LPS-induced inflammatory response in BV-2 cells.

Key words

catechin / lipopolysaccharide / BV-2 cell / inflammatory response

引用本文

王青, 贾哲琳, 宋丽娟, 尉杰忠, 杨智超, 姜维佳, 肖保国, 马存根. 儿茶素对脂多糖诱导的BV-2细胞炎性反应的作用. 药学学报, 2018 , 53 (2) : 244 -248 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0993

Qing WANG, Zhe-lin JIA, Li-juan SONG, Jie-zhong YU, Zhi-chao YANG, Wei-jia JIANG, Bao-guo XIAO, Cun-gen MA. The effects of catechin on inflammatory response induced by lipopolysaccharide in BV-2 cells[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2018 , 53 (2) : 244 -248 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0993

正文

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众多研究结果表明, 人类大部分高发的慢性疾病可能与炎症有关, 如中枢神经系统变性疾病—阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)、帕金森(Parkinsons disease, PD)和多发性硬化(multiple sclerosis, MS)等的发生、发展都有神经炎症的参与^[1]。在循环系统疾病—动脉粥样硬化病(atherosclerosis, AS)、血液黏稠和原发性高血压等的发病过程中炎症起着重要作用^[2], 而各类恶性肿瘤也与炎症有着密切的关系^[3]。因此, 开发具有抗炎活性的药物是现在的发展趋势。儿茶素(catechin, C)是广泛存在于自然界中的一种黄烷醇型黄酮化合物, 能够清除氧自由基和抗炎, 还可以通过血脑屏障, 到达中枢神经系统^{[4, 5]}。因此, 研究儿茶素能否抑制中枢系统神经炎性反应, 对于预防和缓解中枢神经疾病的发生、发展具有重要的现实意义。

小胶质细胞(microglia, MG)是中枢神经系统的常驻免疫细胞, 它的持续活化是诱发和加重中枢神经炎症的关键因素, 因此, 本研究以脂多糖(lip-opolysaccharide, LPS)诱导的BV-2细胞(MG系)体外炎症模型为研究对象^{[6, 7]}, 初步探索儿茶素对小胶质细胞引起炎性反应的影响, 为进一步的临床开发奠定理论和实验基础。

材料与方法

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试剂与仪器 CO₂培养箱(Thermo公司); 全波长酶标仪(Molecular Devices公司); 小型垂直电泳槽、小型基础通用电源、小型半干转膜仪(Bio-Rad公司); 凝胶成像系统(上海天能科技有限公司); DMEM高糖培养基(Gibco公司); BV-2细胞(小胶质细胞系, 武汉大学细胞库); 脂多糖(Sigma公司); 胎牛血清(HyClone公司); Leu-Glu-Ser-Ile-Phe-Arg-Ser-Leu-Leu-Phe-Arg-Val-Met (MMK-1) (Tocris Bioscience公司); 噻唑蓝、DAPI (碧云天生物技术公司); PVDF膜(Milipore公司); BCA试剂盒(康为世纪生物科技有限公司); RAPI细胞裂解液[生工生物工程(上海)股份有限公司]; ECL [爱必信(上海)生物科技有限公司]; 小鼠β-actin抗体(Santa Cruz公司); IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒(R&D公司), 辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

MTT实验 高糖DMEM培养液(10%胎牛血清)培养BV-2细胞, 调整细胞数为每毫升1×10⁵个, 接种于96孔细胞培养板, 每孔100 μL细胞悬液, 培养12~24 h后, 各孔加入浓度为2.5、5、10、20、30、50和100 mg·L⁻¹儿茶素, 孵育24、48和72 h后, 各孔加入5% MTT 10 μL, 37 ℃孵育4 h后, 移除培养液, 各孔再加入DMSO 100 μL溶解, 震荡混匀后, 在490 nm处读取其OD值。

ELISA法检测IL-1β和TNF-α 高糖DMEM培养液(10%胎牛血清)培养BV-2细胞, 调整细胞数为每毫升1×10⁵个, 接种于96孔细胞培养板, 实验设为空白组、LPS组和LPS+儿茶素组, 每组6个复孔, 每孔100 μL。LPS组: BV-2细胞加入1 mg·L⁻¹ LPS孵育12 h; LPS+儿茶素组: BV-2细胞用不同浓度的儿茶素(5、10、20和50 mg·L⁻¹)和1 mg·L⁻¹ LPS共同孵育12 h。用ELISA法检测其上清液中IL-1β和TNF-α的分泌情况。

Transwell 趋化实验 取对数生长期的BV-2细胞, 接种于35 mm细胞培养皿, 预孵育12 h后, 胰酶消化、离心, 用新鲜的完全培养液重悬; 设空白组和LPS组; LPS组分为5组, LPS各组加入0、5、10、20和50 mg·L⁻¹儿茶素, 分别调整细胞数为每毫升5×10⁵个。各取细胞200 μL置于transwell小室上室, 下室以20 nmol·L⁻¹ MMK-1为趋化剂; CO₂培养箱孵育12 h后, 弃去培养液, 用PBS漂洗3次, 甲醇室温固定10 min, 5 mg·L⁻¹ DAPI室温孵育20 min, PBS漂洗3次, 荧光显微镜下观察计数细胞。实验结果用趋化指数表示, 趋化指数为给药组与空白组细胞个数的比值^[8]。

HE染色法 取对数生长期的BV-2细胞, 接种于6孔板中, 培养12 h后, 分为空白组、LPS组和LPS+儿茶素组。LPS组: BV-2细胞加入1 mg·L⁻¹ LPS孵育12 h; LPS+儿茶素组: BV-2细胞用20 mg·L⁻¹儿茶素和1 mg·L⁻¹ LPS共同孵育12 h。移除培养液, 用PBS洗3次, 用甲醇固定10 min, 双蒸水洗涤后, 每孔加入苏木素1 mL染色5 min, 自来水洗涤, 1%盐酸乙醇分化10 s后, 自来水洗涤, 每孔加入伊红1 mL染色2 min, 自来水洗涤后, 显微镜下观察。

Western blot实验 取对数生长期的BV-2细胞, 分为空白组、LPS组和LPS+儿茶素组。LPS组: BV-2细胞加入1 mg·L⁻¹ LPS孵育20 min; LPS+儿茶素组: BV-2细胞用20 mg·L⁻¹儿茶素和1 mg·L⁻¹ LPS共同孵育20 min。收集各组细胞, 使用RAPI裂解液, 提取总蛋白, Bicinchoninic acid法检测蛋白浓度。然后, 蛋白用5×上样缓冲液配制后, 上样量为20~40 μg, 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 采用半干法将蛋白转到PVDF膜, 5%脱脂奶粉封闭2 h, 一抗4 ℃孵育过夜, 二抗孵育后, ECL法曝光。

统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。数据用$\overline{x}±s$表示。单因素方差分析(one-way ANOVA)后, 用Dunnett’s test方法比较组间差异, P < 0.05具有统计意义^[9]。

结果

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1 儿茶素对BV-2细胞存活的影响

不同浓度儿茶素作用BV-2细胞24、48和72 h, 没有表现出细胞毒性, 且高浓度的儿茶素(50和100 mg·L⁻¹), 与空白组相比, 能显著促进BV-2细胞增殖(图 1)。结果表明, 儿茶素在100 mg·L⁻¹之内对体外培养的BV-2细胞无细胞毒性, 为后续实验药物浓度的确定提供了依据。

2 儿茶素对BV-2细胞趋化的影响

MG异常活化后, 其表面受体密度急剧增加, 介导炎症因子分泌和细胞趋化^{[9, 10]}。因此, 甲酰肽受体-2 (formylpeptide receptor-2, FPR2)的激动剂MMK-1可诱导LPS刺激的BV-2细胞趋化(图 2)。不同浓度的儿茶素孵育BV-2细胞后, 与LPS组相比, 20和50 mg·L⁻¹儿茶素可以显著减少MMK-1诱导的BV-2细胞趋化。

3 儿茶素对BV-2细胞炎性因子分泌的影响

与空白组相比, LPS孵育BV-2细胞后, 可以使细胞上清液中IL-1β和TNF-α分泌显著升高。不同浓度的儿茶素孵育BV-2细胞后, 发现与LPS组相比, 20和50 mg·L⁻¹儿茶素可以显著抑制IL-1β和TNF-α的分泌(图 3)。

4 儿茶素对BV-2细胞形态的影响

BV-2细胞经过1 mg·L⁻¹ LPS处理后, 形态发生明显的变化; 处理前的MG呈现相对静息状态, 胞体较小, 突出细而长; 处理后的细胞, 突起回缩并变粗, 呈阿米巴样(图 4)。用20 mg·L⁻¹儿茶素和LPS共同处理BV-2细胞12 h后, 发现儿茶素能够逆转LPS引起的BV-2细胞形态改变。

5 儿茶素对BV-2细胞NF-κB磷酸化的影响

经1 mg·L⁻¹ LPS刺激后, BV-2细胞的NF-κB/p65磷酸化增加, 而20 mg·L⁻¹儿茶素可显著下调NF-κB/ p65的磷酸化水平(图 5)。

讨论

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儿茶素广泛分布于植物中, 是天然来源的最佳的抗氧化剂之一, 具有防癌抗癌、防治心血管疾病和保护神经等多种功能。且关于儿茶素提取分离、含量测定和纯度检查的技术成熟, 质量可控; 在体内的反应方式、作用路线、代谢过程的研究较为充分; 长期深入的基础和临床数据也表明儿茶素及其制剂毒副作用少, 安全性高, 不易蓄积、残留极少; 这些内容增进了人们对儿茶素的认识, 将促进儿茶素的开发利用^[10]。本研究在此基础上, 从炎症的角度初步探讨了儿茶素对LPS诱导的MG细胞系BV-2活化的影响, 为下一步的在体实验提供理论依据, 为其开发为预防和治疗神经炎症所致中枢神经系统退行性疾病药物奠定基础。

MG是中枢神经系统的“巡查员”, 一旦遭遇异物或有害刺激, MG会被迅速活化, 释放大量的细胞因子来发挥免疫和炎症调节作用, 能够消除或缓解所牵涉神经组织或细胞的生化代谢紊乱^[11]。但是持续激活的MG会释放过量的炎性因子, 促进神经炎症的恶性循环, 对正常的神经组织造成损伤。LPS可诱导MG产生一系列的炎症反应, 可使MG膜表面炎症相关的受体表达急剧升高, 炎症因子分泌增加, 促进神经炎症的发生和发展。因此, 抑制MG的异常活化和炎性反应对于改善炎性微环境、保护神经元免受损伤, 具有重要的临床意义。本研究发现, 儿茶素显著抑制炎性BV-2 MG细胞释放炎症因子, 影响其炎症受体的功能和核转录因子NF-κB的磷酸化, 说明儿茶素可以通过抑制MG的异常活化, 预防和缓解中枢神经系统炎性损伤。

MG细胞异常活化后, TNF-α和IL-1β是其分泌的主要炎性细胞因子, 是推动神经炎症的关键因素。TNF-α不仅是促进多种促炎因子分泌的诱因, 还能引起细胞凋亡, 诱发炎症级联反应, 其在脑部表达量的增多可直接反映神经炎症的严重程度^[12]; 而IL-1β是IL-1家族的重要促炎因子之一, 是一种调节蛋白, 可通过MG中的NF-κB磷酸化促进TNF-α、IL-6、干扰素和趋化因子的分泌, 从而诱导神经炎症持续恶化^[13]。本研究发现, 儿茶素显著抑制LPS诱导的BV-2细胞分泌TNF-α和IL-1β, 进而可以缓解神经炎症引起的循环恶化。

FPR2是趋化受体家族中的一员, 是7次跨膜的G蛋白偶联受体, 由于其遗传和基因的多态性, 具有复杂的功能, 能通过与不同起源和高度结构多样性的配体结合介导炎症和免疫反应^[14]。其特异性的激动剂MMK-1可通过FPR2趋化和激活中性粒细胞、单核细胞和T细胞, 促进IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子的分泌, 促进细胞趋化, 发挥促炎的作用^[15]。本研究发现, 儿茶素显著抑制MMK-1诱导的BV-2细胞趋化, 表明儿茶素可通过抑制FPR2的功能, 影响炎症的发生。

近年来, 参与炎症、免疫调节、细胞黏附和趋化的核转录因子NF-κB引起了国内外专家学者的广泛关注。其信号转导通路可被氧化应激、LPS和细胞因子(IL-1β)等激活, 调控细胞促炎因子、黏附分子和其他转录因子等的生成分泌和活化, 进而介导细胞行为^[16]。因此, 抑制NF-κB的活化, 可以阻断NF-κB介导的细胞炎性反应, 减少炎症对受累神经细胞和组织的损伤。儿茶素可以抑制NF-κB的激活, 说明儿茶素可通过其信号通路影响细胞行为, 但具体的机制还需进一步研究。

综上所述, 儿茶素可以抑制LPS诱导的BV-2细胞的炎性反应, 其抗炎作用与抑制免疫细胞炎症因子释放、减少炎性细胞趋化和NF-κB磷酸化有关。为探索儿茶素抑制神经炎症作用机制提供了理论依据和实验基础。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81473577)
山西省卫生计生委科研课题资助项目(201601112)
山西中医药大学校内博士启动基金资助项目(2014BK04)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2018年第53卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0993

接收时间：2017-10-11
首发时间：2026-01-15
出版时间：2018-02-12

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收稿日期：2017-10-11
录用日期：2017-11-18

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国家自然科学基金资助项目(81473577)

山西省卫生计生委科研课题资助项目(201601112)

山西中医药大学校内博士启动基金资助项目(2014BK04)

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1.山西中医药大学国家中医药管理局益气活血重点研究室, 山西晋中 030619

2.山西医科大学第一临床医学院, 山西太原 030001

3.山西大同大学脑科学研究所, 山西大同 037009

4.上海复旦大学神经病学研究所, 上海 200040

通讯作者:

* 马存根, Tel/Fax:86-352-7158665, E-mail:macungen2001@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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