药学学报

Gene symbol	Primer sequences (5'-3')	Amplicon size/bp
DoCIPK1	1-5'-RACE-R: GTCCGTCCTGCCGCATCTGTTCG 1-3'-RACE-F: CGGTTTCCGAACAGATGCGGCAGG	541 1 086
1-ORF-F: ATGGCGTCGGAGCCG 1-ORF-R: TTACTCTCTTTCAGAGTCATATTCAGAT	1 422
1-qPCR-F: GGTGAGTCCGTCGCCATTAAGG 1-qPCR-R: TCCGTCCTGCCGCATCTGTT	396
DoCIPK2	2-5'RACE-R: AGCTGGAGTCCCACAAGTAGTATGGAGTAAG 2-3'-RACE-F: CTACTTGTGGGACTCCAGCTTATGTCGC	840 1 061
2-ORF-F: TCTGTCTAAGTCCAATAGGGCT 2-ORF-R: CCAAAGTCACAATTTTTAGCTC	1 636
2-qPCR-F: TCCTCTAAGCCAGCTTCCACCA 2-qPCR-R: CACCTTGCCATGCCCACACAA	280
DoCIPK3	3-5'-RACE-R: GCGTGCCTCATCTTCTCTCATTCTTCCAT 3-3'-RACE-F: GCATCCAAATGTTGTTCGCCTCCACG	681 1 461
3-ORF-F: ATGCACAAGATGAGCACACCA 3-ORF -R: CTAGTACTGCATCCTCTGATCTGAAA	1 356
3-qPCR-F: GTGGGAGGAGGAGGAGAAAGCA 3-qPCR-R: CGTGGAGGCGAACAACATTTGG	390
DoCIPK4	4-5'-RACE-R: ATCCTTCTCAAGCCTGCCCTTAGCAATC 4-3'-RACE-F: TGTGGAACTCCAGCTTATGTTGCTCCTGAG	824 994
4-ORF-F: ATGGTGAATAAAGGGTGTTTATTG 4-ORF-R: TCAAATCTGCAGCTGCTGTAAATA	1 323
4-qPCR-F: GCTAAGGGCAGGCTTGAGAAGG 4-qPCR-R: CCAGCTTCATCCAGGAGGAGGT	134

Gene symbol	Primer sequences (5'-3')	Amplicon size/bp
DoCIPK1	1-5'-RACE-R: GTCCGTCCTGCCGCATCTGTTCG 1-3'-RACE-F: CGGTTTCCGAACAGATGCGGCAGG	541 1 086
1-ORF-F: ATGGCGTCGGAGCCG 1-ORF-R: TTACTCTCTTTCAGAGTCATATTCAGAT	1 422
1-qPCR-F: GGTGAGTCCGTCGCCATTAAGG 1-qPCR-R: TCCGTCCTGCCGCATCTGTT	396
DoCIPK2	2-5'RACE-R: AGCTGGAGTCCCACAAGTAGTATGGAGTAAG 2-3'-RACE-F: CTACTTGTGGGACTCCAGCTTATGTCGC	840 1 061
2-ORF-F: TCTGTCTAAGTCCAATAGGGCT 2-ORF-R: CCAAAGTCACAATTTTTAGCTC	1 636
2-qPCR-F: TCCTCTAAGCCAGCTTCCACCA 2-qPCR-R: CACCTTGCCATGCCCACACAA	280
DoCIPK3	3-5'-RACE-R: GCGTGCCTCATCTTCTCTCATTCTTCCAT 3-3'-RACE-F: GCATCCAAATGTTGTTCGCCTCCACG	681 1 461
3-ORF-F: ATGCACAAGATGAGCACACCA 3-ORF -R: CTAGTACTGCATCCTCTGATCTGAAA	1 356
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DoCIPK4	4-5'-RACE-R: ATCCTTCTCAAGCCTGCCCTTAGCAATC 4-3'-RACE-F: TGTGGAACTCCAGCTTATGTTGCTCCTGAG	824 994
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4-qPCR-F: GCTAAGGGCAGGCTTGAGAAGG 4-qPCR-R: CCAGCTTCATCCAGGAGGAGGT	134

		DoCIPK1	DoCIPK2	DoCIPK3	DoCIPK4
Physiochemical	Formula	C₂₃₉₆H₃₇₉₀N₆₅₆O₇₀₀S₁₆	C₂₃₀₀H₃₆₅₀N₆₁₄O₆₅₇S₁₆	C₂₃₁₆H₃₆₆₈N₆₃₂O₆₇₀S₁₃	C₂₂₆₇H₃₆₀₁N₅₉₉O₆₃₈S₂₂
property	Amino acid	473	449	451	440
	MW (KD)	53.50	50.93	51.50	50.16
	pI	7.99	9.25	8.81	9.11
Secondary	α helix	34.04%	37.19%	41.69%	39.32%
structure	Random coil	34.25%	27.62%	27.05%	24.77%
	Extended strand	18.60%	23.39%	17.07%	22.73%
	β turn	13.11%	11.80%	14.19%	13.18%
Domain	PK domain	21-275	14-268	16-271	12-266
	NAF/FISL domain	333-357	310-334	308-332	302-326
Motif	N-glycos site	461-464	296-299	296-299
	PK C PS	119-121, 193-195, 325-327, 388-390, 470-472	163-165, 346-348, 365-367	6-8, 10-12, 67-69, 344-346, 441-443	161-163, 252-254, 301-303, 355-357, 373-375, 427-429
	Casein kinase Ⅱ PS	265-268, 293-296, 308-311, 318-321, 323-326, 376-379, 464-467, 466-469, 470-473	122-125, 301-304, 325-328, 410-413	21-24, 97-100, 286-289, 354-357, 425-428, 433-436	120-123, 293-296, 314-317, 347-450, 402-485
	Amidation site		185-188	381-384	183-186, 375-378
	Tyrosine kinase PS	430-437, 429-437		112-119
	N-Myr site	175-180, 400-405	168-173, 331-36	171-176	166-171
	PKs ATP-binding signature	27-50, 27-59	20-43	22-45	18-41
	Ser/Thr PKs active-site signature	139-151	132-144	135-147	130-142
	cAMP-and cGMP-dependent PK PS			338-341, 420-423	331-334
Localization	Nucleus				70.0%
	PM	60.0%	70.0%	70.0%	44.0%
	ER (membrane)	30.0%	20.2%	20.0%	85.0%
	MB (peroxisome)		20.0%	11.5%	47.4%
	CpT membrane	30.4%	13.7%	16.2%
	Golgi body	40.0%

		DoCIPK1	DoCIPK2	DoCIPK3	DoCIPK4
Physiochemical	Formula	C₂₃₉₆H₃₇₉₀N₆₅₆O₇₀₀S₁₆	C₂₃₀₀H₃₆₅₀N₆₁₄O₆₅₇S₁₆	C₂₃₁₆H₃₆₆₈N₆₃₂O₆₇₀S₁₃	C₂₂₆₇H₃₆₀₁N₅₉₉O₆₃₈S₂₂
property	Amino acid	473	449	451	440
	MW (KD)	53.50	50.93	51.50	50.16
	pI	7.99	9.25	8.81	9.11
Secondary	α helix	34.04%	37.19%	41.69%	39.32%
structure	Random coil	34.25%	27.62%	27.05%	24.77%
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Domain	PK domain	21-275	14-268	16-271	12-266
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Motif	N-glycos site	461-464	296-299	296-299
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Localization	Nucleus				70.0%
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	CpT membrane	30.4%	13.7%	16.2%
	Golgi body	40.0%

珍稀药用铁皮石斛4个CIPKs基因的鉴定与表达分析

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李依民 ¹ , 张娜 ¹ , 沈霞 ¹ , 李欢 ¹ , 黑小斌 ¹ , 郭顺星 ²^,^* , 张岗 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2018,53(2): 304-312

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药学学报 | 研究论文 2018, 53(2): 304-312

珍稀药用铁皮石斛4个CIPKs基因的鉴定与表达分析

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李依民¹, 张娜¹, 沈霞¹, 李欢¹, 黑小斌¹, 郭顺星²^,^*, 张岗¹^,²^,^*

作者信息

1.陕西中医药大学药学院/陕西省中药基础与新药研究重点实验室, 陕西西安 712046

2.中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193

通讯作者:

* 郭顺星, Tel/Fax:86-10-62829619, E-mail:sxguo1986@163.com;

张岗, Tel/Fax:86-29-38185165, E-mail:jay_gumling2003@aliyun.com

Identification and expression analysis of four CIPKs genes from a rare and medicinal plant, Dendrobium officinale

Yi-min LI¹, Na ZHANG¹, Xia SHEN¹, Huan LI¹, Xiao-bin HEI¹, Shun-xing GUO²^,^*, Gang ZHANG¹^,²^,^*

Affiliations

1. College of Pharmacy and Shaanxi Provincial Key Laboratory for Chinese Medicine Basis and New Drugs Research, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xi'an 712046, China

2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

出版时间: 2018-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-1066

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摘要

收起

类钙调磷酸酶B蛋白（calcineurin B-like protein，CBL）互作蛋白激酶（CBL-interacting protein kinase，CIPK）通过感应钙信号，在植物生长发育、逆境生理等生命活动中发挥重要作用。本研究利用RACE技术首次从珍稀药用铁皮石斛中克隆到4个CIPK基因cDNA全长，DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4（GenBank注册号KT957557、KT957558、KT957559和KT957560），编码蛋白分别含473、449、451、440个氨基酸，分子质量依次为53.50、50.93、51.50、50.16 kDa，等电点7.99、9.25、8.81、9.11；与多种植物CIPKs蛋白一致性在70%~90%、69%~80%、78%~93%、66%~82%之间；各含1个蛋白激酶的保守结构域（分别为第21~275、14~268、16~271、12~266位氨基酸）、1个CIPK家族特有的NAF/FISL结构域（335~391、313~370、310~369、305~362）和多个功能基元；4个蛋白均无信号肽或跨膜域，预测主要分布在质膜、内质网等亚细胞水平，与拟南芥AtCIPK24三维结构类似；DoCIPK1、DoCIPK3分别隶属于拟南芥和水稻CIPKs分子进化树的E、A类群，DoCIPK2和DoCIPK4属于C类群；DoCIPK1基因在石斛叶和茎中的相对表达量无显著差异，根中表达量为叶中的0.35倍；DoCIPK3转录本在茎和根中的丰度分别为叶中3.36倍和3.47倍；DoCIPK2与DoCIPK4的表达模式相似，二者在叶和茎中的相对表达量无显著差异，根中表达量分别为叶中的2.08倍和7.86倍。DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4基因克隆、生物信息特征及表达特性为下一步研究基因在铁皮石斛生理适应中的分子功能奠定基础。

关键词

铁皮石斛 / 激酶 / 定量PCR / 钙信号 / 结构域

Abstract

收起

The calcineurin B-like protein (CBL)-interacting protein kinase (CIPK) plays a vital role in the growth, development, and stresses adaptation in plants by interaction with the calcium signaling. In this study, four full length cDNAs of CIPKs genes, namely DoCIPK1, DoCIPK2, DoCIPK3 and DoCIPK4 (GenBank accession No. KT957557, KT957558, KT957559 and KT957560, respectively) were cloned from the rear and medicinal plant, Dendrobium officinale, by rapid amplification of cDNA ends (RACE) for the first time. The corresponding encoded proteins, consisting of 473, 449, 451 and 440 amino acids (aa), respectively, with a molecular weight of 53.50, 50.93, 51.50 and 50.16 kDa, and an isoelectric point (pI) of 7.99, 9.25, 8.81 and 9.11, respectively, shared 70%-90%, 69%-80%, 78%-93%, and 66%-82% identities CIPKs with various plants. Each deduced protein contained a conserved protein kinase domain (respectively at 21 -275, 14-268, 16-271 and 12-266 aa position), a CIPKs family characteristic NAF/FISL domain (respectively at 335-391, 313-370, 310-369 and 305-362 aa position) and some functional motifs. The four DoCIPK proteins, without signal peptide or transmembrane region, were located in the plasma membrane and endoplasmic reticulum at the subcellular level. The three dimensional structure of the proteins were similar to that of Arabidopsis AtCIPK24. DoCIPK1 and DoCIPK3 were respectively clustered in the group E and A of the Arabidopsis and rice CIPK evolutionary tree, while DoCIPK2 and DoCIPK4 belonged to group C. The relative expression of DoCIPK1 showed no significant difference in the leaves and stems, and its transcripts in the roots was 0.35 fold over that in the leaves. The abundance of DoCIPK3 transcripts in the stems and the roots were 3.36 fold and 3.47 fold higher, respectively, than those in the leaves. DoCIPK2 exhibited similar expression pattern to DoCIPK4. Their relative expression in the leaves and the stems had no apparent difference, and the transcript levels were higher in the roots than that in the leaves, with 2.08 fold and 7.86 fold, respectively. Cloning, bioinformatics analyses, and expression patterns of the four DoCIPK genes provide a basis for functional elucidation of these genes further during the physiological responses in D. officinale.

Key words

Dendrobium officinale / kinase / quantitative PCR / calcium signal / domain

引用本文

李依民, 张娜, 沈霞, 李欢, 黑小斌, 郭顺星, 张岗. 珍稀药用铁皮石斛4个CIPKs基因的鉴定与表达分析. 药学学报, 2018 , 53 (2) : 304 -312 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-1066

Yi-min LI, Na ZHANG, Xia SHEN, Huan LI, Xiao-bin HEI, Shun-xing GUO, Gang ZHANG. Identification and expression analysis of four CIPKs genes from a rare and medicinal plant, Dendrobium officinale[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2018 , 53 (2) : 304 -312 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-1066

正文

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钙既是植物体生长发育过程中的一种必需矿质元素, 又是一种非常重要的第二信使, 主导胞内信号转导, 参与调节植物对光、病原菌、非生物胁迫等各种环境的生理适应^{[1, 2]}。钙信号一般由钙调素、类钙调磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like protein, CBL)、钙网蛋白或钙依赖蛋白激酶等钙结合蛋白感应, 传递信号并激活下游基因表达, 进而调节细胞代谢^[2]。CBL互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases, CIPKs)特异的结合CBL蛋白, 感应钙信号, 共同构成Ca²⁺介导的CBL-CIPK调控网络, 介导植物应对各种环境的生理反应^{[3, 4]}。CIPKs蛋白由一个N-末端激酶结构域和一个C-末端调控域构成, 后者包含一个保守的NAF/FISL基序, 负责与绑定Ca²⁺的CBL互作, 靶向激活CIPKs^[5]。此外, C-末端还有一个蛋白磷酸酶2C结合结构域^[6]。

植物CIPKs系较大的基因家族。截止目前, CIPKs在拟南芥基因组中已鉴定26个^{[3, 7]}、水稻34个^[4]、玉米43个^[8]、杨树27个^[7]、油菜23个^[9]、木薯27个^[10]。大量研究证实, CIPKs在介导植物矿质元素转运与吸收、激素信号转导、生物胁迫或非生物胁迫等生命活动中起重要调控作用。AtCIPK23与AtCBL1/CBL9形成的复合体, 通过调节K⁺通道AtAKT1维系细胞K⁺稳态^[11], 番茄SlCIPK24和野大麦HbCIPK2也有类似保持K⁺平衡的作用^{[12, 13]}。AtCIPK24 (AtSOS2)与AtCBL4 (AtSOS3)的互作激活质膜Na⁺/H⁺反向转运体AtNHX7 (SOS1)和液泡H⁺-ATPase, 进而增强植物耐盐性^{[14, 15]}。GhCIPK6提高棉花对脱落酸(abscisic acid, ABA)、盐和干旱等非生物胁迫^[16]。AtCIPK26在种子萌发的ABA信号通路中与2C类蛋白磷酸酶ABI1、ABI2、ABI5相互作用中起重要作用^[17]。AtCIPK6能运输生长素进而影响根系发育和响应盐胁迫^[18]。最新研究揭示, 番茄CBL10-CIPK6能够通过钙信号、活性氧信号转导机制, 介导植物对病菌的免疫反应^[19]。可见, CBL-CIPKs网络在植物生长发育、抗逆胁迫中起着至关重要的作用。

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科石斛属最为珍稀名贵的种, 药用部位为新鲜或干燥茎, 具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳、明目强身等功效^[20]。石斛属植物普遍含有倍半萜类、菲酚类、双苄酚类、多糖以及生物碱等主要活性成分。石斛碱是药用石斛最重要的有效成分之一, 具有止痛解热、抗肿瘤的功效, 对心血管、胃肠道等疾病有抑制作用^[21]。铁皮石斛已在生物学、化学、药理学等方面取得一定的研究进展^[20-23]。但是基因功能研究相对匮乏, 限制了对石斛资源的可持续开发与利用。前期, 本课题组利用SSH富集菌根真菌侵染铁皮石斛的差异表达基因^[24], 分离得到长度分别为557、530、450、555 bp的4条差异基因, BLASTx分析显示其与多种植物CIPKs蛋白高度一致, 推测参与调控铁皮石斛生长发育和菌根生理适应。本研究以珍稀濒危药用植物铁皮石斛为对象, 采用RACE技术克隆获得4个CIPKs基因全长cDNA (DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4基因)并进行生物信息学、系统进化及组织表达模式等特征分析, 旨在为深入研究基因分子作用提供基础。

材料与方法

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材料野生铁皮石斛植物材料于2015年7月采自云南西双版纳, 取其根、茎、叶组织样品, 液氮速冻后置-80 ℃保存备用。

核糖核酸(RNA)提取和互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成 按照EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(北京爱德莱)操作说明提取纯化各样品总RNA; 采用NanoDrop^TM 2000分光光度计(Thermo Fisher, USA)测定总RNA质量和纯度, 1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。使用M-MLV Reverse Transcriptase kit (Promega, USA)反转录合成cDNA第一链, -20 ℃保存备用。

cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)克隆 以4条EST为模板, 设计4对特异引物(表 1), 按照SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit (Clotech, Japan)说明书分别进行5'/3'-RACE。

分别以4个基因5'/3'-RACE-R/F引物与试剂盒提供UPM引物组合, 进行各基因5'/3'-RACE扩增。反应体系为: 2.5 µL 10× Advantage^® 2 PCR buffer, 0.5 µL 10 mmol·L^-1 dNTPs, 0.5 µL 10 µmol·L^-1 5'/3'-RACE-R/F, 0.5 µL 10 µmol·L^-1 UPM, 1.0 µL 5'/3'-RACE ready cDNA, 0.5 µL 5 U·µL^-1 50× Advatange^® 2 Polymerase Mix, 补ddH₂O至25 µL。PCR程序为: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 5个循环; 94 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min 24个循环; 72 ℃ 10 min, 4 ℃保温。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳分析, 回收目标条带、克隆, 随机选取3个重组质粒, 利用ABI 3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems, USA)双向测序分析。

基因全长获取和验证 利用CAP3将5'、3'端cDNA序列与核心序列拼接后, 进行BLASTX和ORF Finder分析, 设计4对跨开放阅读框(open reading frame, ORF)引物(表 1), 分别进行4个全长基因的RT-PCR验证。反应体系为: 2.0 µL 10× Ex Taq^TM buffer, 0.4 µL 10 mmol·L^-1 dNTPs, 10 µmol·L^-1 ORF-F/R各0.4 µL, 1.0 µL cDNA, 0.2 µL 5 U·µL^-1 Ex Taq^TM Polymerase, 补ddH₂O至20 µL。PCR程序: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 32个循环; 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保温。PCR反应产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测, 回收目的条带、克隆并进行测序分析。

序列分析 使用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cg)、CAP3 (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)、ORF Finder (http://www.ncbi.nlh.nih.gov/gorf/gorf.html)等在线工具分析CIPKs cDNA序列。

采用 ExPASy Proteomics Server在线软件Protparam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)进行4个CIPKs基因编码蛋白的理化性质分析; 使用SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)预测蛋白质二级结构; 利用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/iprscan/)和PROSITE SCAN (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_proscan.html)预测蛋白保守结构域和基元; 采用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)进行DoCIPKs蛋白质三维建模分析; 用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行分泌蛋白预测; 借助PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html)进行蛋白亚细胞定位预测; 利用TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白跨膜区; 用DNASTAR 7.0和MEGA 6.0软件分别进行氨基酸序列比对和进化树分析。

实时定量PCR (real time quantitative PCR, qPCR)分析 分别以2 μg根、茎、叶样品总RNA反转录合成cDNA, 以EF1α为内参基因^[20], 采用qPCR检测4个CIPKs基因的组织表达模式, 各基因引物见表 1。应用ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems, USA)进行qPCR。反应体系为: 12.5 μL 2×SYBR^® Premix Ex Taq^TM Master Mix, qPCR-F/R各0.5 μL (10 μmol·L^-1), 0.5 μL Dye, 2 μL cDNA模板, 9 μL ddH₂O。PCR程序为: 95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环, 同时绘制熔解曲线。每个反应重复3次, 包括不加模板的对照(NTC), 本实验重复3次。根据ABI PRISM 7500 SDS软件(Applied Biosystems, USA)生成的CT (Cycle threshold)值, 2^-ΔΔCT计算基因相对表达量^[25]。

结果

收起

1 DoCIPKs基因克隆和全长验证

利用1-5'-RACE-R、2-5'-RACE-R、3-5'-RACE-R、4-5'-RACE-R与UPM组成4对引物组合, 5'-RACE ready cDNA为模板, 5'-RACE结合克隆与测序分别获得541、840、680和824 bp的cDNA序列。同时, 利用1-3'-RACE-R、2-3'-RACE-R、3-3'-RACE-R、4-3'-RACE-R与UPM组成4对引物组合, 3'-RACE ready cDNA为模板, 3'-RACE分别获得1 086、1 061、1 461和994 bp的cDNA序列。将5'、3'末端cDNAs序列, 分别与原EST拼接获得4个cDNAs, 长度分别为1 597、1 881、2 006、1 954 bp, 命名为DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4, 提交GenBank获得注册号为KT957557、KT957558、KT957559和KT957560。ORF Finder分析显示DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4基因ORF分别为1 422、1 350、1 356、1 323 bp, 5'-UTR分别长15、306、330、497 bp, 3'-UTR分别长160、225、320、134 bp, 含有真核生物mRNA末端polyA尾巴; 除DoCIPK3外, 其他3个基因起始密码子附近碱基序列符合KOZAK规则^[26]。

使用 1-ORF-F/R、2-ORF-F/R、3-ORF-F/R、4-ORF-F/R进行RT-PCR扩增验证基因全长, 获得长度分别为1 422、1 636、1 356、1 323 bp的单一条带(图 1), 克隆、测序分析显示其含有4个基因的完整ORF, 说明已成功获得4个CIPKs基因全长cDNAs。

2 DoCIPKs基因编码蛋白的序列分析

利用生物信息学软件分别对DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4基因进行同源性、理化特性、二级结构、结构域、基元、亚细胞定位等预测分析, 结果见表 2。

2.1 DoCIPKs基因编码蛋白同源性、理化特性分析

BLASTP分析显示DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4基因编码蛋白与GenBank已注册植物CIPKs蛋白高度同源, 一致性分别在70%~90%、69%~80%、78%~93%、66%~82%之间, 与小兰屿蝴蝶兰Phalaenopsis equestris XP_020574335、XP_020585983、XP_020585435、XP_020588196的一致性分别为90%、80%、93%、82%。Protparam分析获得DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4基因推定蛋白的分子式, 氨基酸数目分别为473、449、451、440个, 分子质量依次为53.50、50.93、51.50、50.16 kDa, 等电点分别为7.99、9.25、8.81、9.11。

2.2 DoCIPKs基因编码蛋白的二级结构、结构域和基元预测分析

SOPMA分析显示DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4基因编码蛋白质的二级结构中α-螺旋(alpha helix)和延伸链(extended strand)占主要比例, 其次为β-折叠(beta turn), 无规卷曲(random coil)数量较少。

InterProScan分析显示, DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4基因编码蛋白各含1个蛋白激酶的保守结构域(IPR000719;分别为第21~275、14~268、16~271、12~266位氨基酸)和1个CIPK家族特有的NAF/FISL结构域(IPR018451; 335~391、313~370、310~369、305~362), 符合已报道CIPKs蛋白的典型结构特征^[2]。PROSITE Scan分析表明, 4个CIPKs蛋白含有数目不等的保守基元(motif), 共有蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性基序、蛋白激酶ATP结合基序和N-豆蔻酰化位点5种基元; 另有4种基元不一致, DoCIPK4不含N-糖基化位点, DoCIPK1无酰胺化位点, DoCIPK2、DoCIPK4不含酪氨酸激酶磷酸化位点, DoCIPK1、DoCIPK2无cAMP/cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点。

2.3 DoCIPKs基因编码蛋白信号肽、跨膜和定位预测分析

SignalP 4.1和TMHMM分析4个蛋白均无信号肽或跨膜结构。PSORT预测显示DoCIPK1定位于质膜、内质网(膜)、叶绿体内囊体膜、高尔基体; DoCIPK2、3在质膜、内质网(膜)、微体、叶绿体内囊体膜中均有一定分布; 然而, DoCIPK4除了分布在质膜内质网(膜)和微体, 还以较高比率定位于细胞核内。

2.4 DoCIPKs基因编码蛋白的三维建模分析

以拟南芥AtCIPK24 (PDB No.: 4czt.1) B链为模板^[27], 利用SWISS-MODEL进行4个CIPKs蛋白三维结构建模。图 2结果显示, DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4与拟南芥AtCIPK24蛋白一致性分别为52.78%、57.48%、66.59%、53.49%, 空间结构类似。

2.5 DoCIPKs蛋白多序列和分子进化分析

运用DNAStar 7.0中的MegAlign程序对DoCIPK1~4蛋白进行多序列比对分析。图 3结果表明, 4个DoCIPKs蛋白具有一定的保守性, N端氨基酸序列保守性很高, C端氨基酸组成存在较大差异; N端蛋白激酶结构域内包含自DFG氨基酸残基起始到APE氨基酸残基结束、30个氨基酸构成的激活环(activation loop), 其中有磷酸化丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基位点; C端包含CIPKs蛋白特有的NAF/FISL结构域。

进一步用MEGA 6.0软件邻接法(Neighbour-joining)构建DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4与拟南芥和水稻CIPK蛋白家族成员的系统进化树。结果(图 4)表明, 所选CIPKs蛋白聚成A、B、C、D、E五大类群, DoCIPK1、DoCIPK3分别属于E和A类群, DoCIPK2和DoCIPK4同属于C类群。

3 DoCIPKs基因表达特异性分析

分别提取铁皮石斛根、茎、叶的RNA, 用qPCR技术检测4个基因的组织表达模式。图 5结果表明, 4个DoCIPKs基因在铁皮石斛3种器官中均为组成型表达, 但表达模式各有特点。以叶为校正样本, DoCIPK1基因在茎中相对表达量无较大变化, 根中的相对表达量较低, 仅为叶中的0.35倍; DoCIPK2在茎和叶中的相对表达量无显著差异, 根中表达量为叶中的2.08倍; DoCIPK3的转录本丰度在茎和根中处于同一水平, 均显著高于叶, 分别为叶中3.36和3.47倍; DoCIPK4在茎与叶中的相对表达量无显著差异, 根中表达量为叶中的7.86倍。此外, 通过各基因CT值比较分析发现, 4个基因丰度依次为DoCIPK2 > DoCIPK4 > DoCIPK1 > DoCIPK3。

讨论

收起

CIPKs作为植物中特有的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 通过与CBL蛋白互作来感应钙信号, 参与信号网络传递, 在植物生理代谢中起重要调控作用。对拟南芥、水稻、玉米、杨树、油菜、木薯等模式植物或重大作物的系统性分析初步揭示了植物CIPKs家族成员结构特点、蛋白分子进化、基因时空表达特性和部分基因的生物学功能^{[3, 4, 7-10]}。CIPKs家族基因结构与分子功能各有差异, 协同表达参与调控植物体生命活动。本研究利用RACE技术首次从珍稀濒危兰科药用铁皮石斛中分离到4个CIPKs基因cDNA全长, DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4与多种植物CIPKs基因高度同源。4个基因编码蛋白具有蛋白激酶保守结构域及激活环、NAF/FISL结构域, 为CIPK与CBL相互作用的位点^[6], 符合CIPKs蛋白的典型结构特征。进化分析将4个DoCIPKs蛋白分别聚为E、C、A 3大类群, 与已报道的拟南芥、水稻和葡萄等多种植物CIPKs蛋白分子进化一致^{[3, 8-11]}。这些结果说明4个CIPKs基因是铁皮石斛中新鉴定的类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶编码基因。

基因表达模式研究可为基因功能提供初步线索。CIPKs基因表达分子特性与调控生理代谢过程密切相关。大量研究表明, 植物CIPKs家族成员基因不仅具有组织表达特性, 参与调控细胞的基本生理代谢, 而且能够响应外界环境胁迫表达, 参与调控植物细胞钙信号、激素信号转导。水稻CIPKs家族基因在水稻发育3个营养阶段和11个生殖阶段的组织中差异表达, 且响应盐、低温和干旱胁迫^[4]。油菜12个CIPKs基因受盐、干旱、冷、热、脱落酸、甲基紫精、低钾等外源环境诱导或抑制^[9]。木薯21个CIPKs基因在3个根发育阶段、茎和叶中都有表达, 有4个基因转录本未能检测, 9个能响应盐、冷、脱落酸、H₂O₂等外源刺激^[10]。本研究qPCR分析揭示了4个CIPKs基因组织表达模式, DoCIPK1基因在根中相对表达量很低, DoCIPK2和DoCIPK4表达模式相似, 茎与叶中表达无差异, 后者根中表达量很高, DoCIPK3在茎和根中表达水平一致且高于叶, 结合4个基因在器官水平上的整体丰度差异, 推测这4个基因通过不同的表达和作用方式参与石斛营养器官的生长发育过程。

铁皮石斛是珍稀濒危兰科药用植物的重要代表, 不仅能提取临床疗效较好的名贵药材, 而且是兰科菌根的理想研究材料。但是, 石斛属植物生长条件特殊, 种子野生条件萌发率低, 限制了其繁殖及市场供应。当前, 铁皮石斛基因组草图序列已经公布, 有助于下一步解析该植物及其近似种的系统繁育及进化的分子机制^[28]。铁皮石斛基因组中至少发现有26个CIPK编码基因, 本研究获得的4个CIPK基因全长, 与基因组预测CIPK基因编码蛋白(XP_020702232、XP_020705240、XP_020701813、XP_020683888)相似为99%~100% (未发表数据), 证明了DoCIPK1~4的可靠性。然而, CIPK家族成员众多, 分子功能、信号网络如何相互作用, 如何参与调控石斛菌根发育或种子萌发, 尚需更加系统的基因功能研究, 从而有助于揭示CIPK网络调控石斛生理适应的分子机制, 将为全面解析石斛类道地药材形成分子机制及良种培育提供科学依据。

基金

收起

国家自然科学基金资助项目(31101608)
国家自然科学基金资助项目(31170314)
陕西省自然科学基金资助项目(2017JM8030)
陕西省科技计划青年科技新星项目(2012KJXX-44)
陕西省普通高校青年杰出人才计划项目
咸阳市中青年科技领军人才项目

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2018年第53卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-1066

接收时间：2017-10-25
首发时间：2026-01-15
出版时间：2018-02-12

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收稿日期：2017-10-25
录用日期：2017-11-15

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陕西省自然科学基金资助项目(2017JM8030)

陕西省科技计划青年科技新星项目(2012KJXX-44)

陕西省普通高校青年杰出人才计划项目

咸阳市中青年科技领军人才项目

作者信息

1.陕西中医药大学药学院/陕西省中药基础与新药研究重点实验室, 陕西西安 712046

2.中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193

通讯作者:

* 郭顺星, Tel/Fax:86-10-62829619, E-mail:sxguo1986@163.com;

张岗, Tel/Fax:86-29-38185165, E-mail:jay_gumling2003@aliyun.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Gene symbol	Primer sequences (5'-3')	Amplicon size/bp
DoCIPK1	1-5'-RACE-R: GTCCGTCCTGCCGCATCTGTTCG 1-3'-RACE-F: CGGTTTCCGAACAGATGCGGCAGG	541 1 086
1-ORF-F: ATGGCGTCGGAGCCG 1-ORF-R: TTACTCTCTTTCAGAGTCATATTCAGAT	1 422
1-qPCR-F: GGTGAGTCCGTCGCCATTAAGG 1-qPCR-R: TCCGTCCTGCCGCATCTGTT	396
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Gene symbol

Primer sequences (5'-3')

Amplicon size/bp

DoCIPK1

1-5'-RACE-R: GTCCGTCCTGCCGCATCTGTTCG
1-3'-RACE-F: CGGTTTCCGAACAGATGCGGCAGG

541
1 086

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1-ORF-R: TTACTCTCTTTCAGAGTCATATTCAGAT

1 422

1-qPCR-F: GGTGAGTCCGTCGCCATTAAGG
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DoCIPK2

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1 061

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1 636

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2-qPCR-R: CACCTTGCCATGCCCACACAA

280

DoCIPK3

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681
1 461

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1 356

3-qPCR-F: GTGGGAGGAGGAGGAGAAAGCA
3-qPCR-R: CGTGGAGGCGAACAACATTTGG

390

DoCIPK4

4-5'-RACE-R: ATCCTTCTCAAGCCTGCCCTTAGCAATC
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824
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4-ORF-R: TCAAATCTGCAGCTGCTGTAAATA

1 323

4-qPCR-F: GCTAAGGGCAGGCTTGAGAAGG
4-qPCR-R: CCAGCTTCATCCAGGAGGAGGT

134

		DoCIPK1	DoCIPK2	DoCIPK3	DoCIPK4
Physiochemical	Formula	C₂₃₉₆H₃₇₉₀N₆₅₆O₇₀₀S₁₆	C₂₃₀₀H₃₆₅₀N₆₁₄O₆₅₇S₁₆	C₂₃₁₆H₃₆₆₈N₆₃₂O₆₇₀S₁₃	C₂₂₆₇H₃₆₀₁N₅₉₉O₆₃₈S₂₂
property	Amino acid	473	449	451	440
	MW (KD)	53.50	50.93	51.50	50.16
	pI	7.99	9.25	8.81	9.11
Secondary	α helix	34.04%	37.19%	41.69%	39.32%
structure	Random coil	34.25%	27.62%	27.05%	24.77%
	Extended strand	18.60%	23.39%	17.07%	22.73%
	β turn	13.11%	11.80%	14.19%	13.18%
Domain	PK domain	21-275	14-268	16-271	12-266
	NAF/FISL domain	333-357	310-334	308-332	302-326
Motif	N-glycos site	461-464	296-299	296-299
	PK C PS	119-121, 193-195, 325-327, 388-390, 470-472	163-165, 346-348, 365-367	6-8, 10-12, 67-69, 344-346, 441-443	161-163, 252-254, 301-303, 355-357, 373-375, 427-429
	Casein kinase Ⅱ PS	265-268, 293-296, 308-311, 318-321, 323-326, 376-379, 464-467, 466-469, 470-473	122-125, 301-304, 325-328, 410-413	21-24, 97-100, 286-289, 354-357, 425-428, 433-436	120-123, 293-296, 314-317, 347-450, 402-485
	Amidation site		185-188	381-384	183-186, 375-378
	Tyrosine kinase PS	430-437, 429-437		112-119
	N-Myr site	175-180, 400-405	168-173, 331-36	171-176	166-171
	PKs ATP-binding signature	27-50, 27-59	20-43	22-45	18-41
	Ser/Thr PKs active-site signature	139-151	132-144	135-147	130-142
	cAMP-and cGMP-dependent PK PS			338-341, 420-423	331-334
Localization	Nucleus				70.0%
	PM	60.0%	70.0%	70.0%	44.0%
	ER (membrane)	30.0%	20.2%	20.0%	85.0%
	MB (peroxisome)		20.0%	11.5%	47.4%
	CpT membrane	30.4%	13.7%	16.2%
	Golgi body	40.0%

DoCIPK1

DoCIPK2

DoCIPK3

DoCIPK4

Physiochemical

Formula

C₂₃₉₆H₃₇₉₀N₆₅₆O₇₀₀S₁₆

C₂₃₀₀H₃₆₅₀N₆₁₄O₆₅₇S₁₆

C₂₃₁₆H₃₆₆₈N₆₃₂O₆₇₀S₁₃

C₂₂₆₇H₃₆₀₁N₅₉₉O₆₃₈S₂₂

property

Amino acid

473

449

451

440

MW (KD)

53.50

50.93

51.50

50.16

7.99

9.25

8.81

9.11

Secondary

α helix

34.04%

37.19%

41.69%

39.32%

structure

Random coil

34.25%

27.62%

27.05%

24.77%

Extended strand

18.60%

23.39%

17.07%

22.73%

β turn

13.11%

11.80%

14.19%

13.18%

Domain

PK domain

21-275

14-268

16-271

12-266

NAF/FISL domain

333-357

310-334

308-332

302-326

Motif

N-glycos site

461-464

296-299

PK C PS

119-121, 193-195, 325-327, 388-390, 470-472

163-165, 346-348, 365-367

6-8, 10-12, 67-69, 344-346, 441-443

161-163, 252-254, 301-303, 355-357, 373-375, 427-429

Casein kinase Ⅱ PS

265-268, 293-296, 308-311, 318-321, 323-326, 376-379, 464-467, 466-469, 470-473

122-125, 301-304, 325-328, 410-413

21-24, 97-100, 286-289, 354-357, 425-428, 433-436

120-123, 293-296, 314-317, 347-450, 402-485

Amidation site

185-188

381-384

183-186, 375-378

Tyrosine kinase PS

430-437, 429-437

112-119

N-Myr site

175-180, 400-405

168-173, 331-36

171-176

166-171

PKs ATP-binding signature

27-50, 27-59

20-43

22-45

18-41

Ser/Thr PKs active-site signature

139-151

132-144

135-147

130-142

cAMP-and cGMP-dependent PK PS

338-341, 420-423

331-334

Localization

Nucleus

70.0%

60.0%

70.0%

44.0%

ER (membrane)

30.0%

20.2%

20.0%

85.0%

MB (peroxisome)

20.0%

11.5%

47.4%

CpT membrane

30.4%

13.7%

16.2%

Golgi body

40.0%