药学学报

Compound	IC₅₀/nmol·L^-1
FL18	3.31 ± 0.12	12.47 ± 1.23	7.09 ± 0.88	372.01 ± 28.23

Compound

IC₅₀/nmol·L^-1

U-87 MG

T98G

Daoy

SH-SY5Y

FL18

3.31 ± 0.12

12.47 ± 1.23

7.09 ± 0.88

372.01 ± 28.23

Compound	IC₅₀/nmol·L^-1
FL18	3.31 ± 0.12	12.47 ± 1.23	7.09 ± 0.88	372.01 ± 28.23

Compound

IC₅₀/nmol·L^-1

U-87 MG

T98G

Daoy

SH-SY5Y

FL18

3.31 ± 0.12

12.47 ± 1.23

7.09 ± 0.88

372.01 ± 28.23

Compound	Dose /mg·kg^-1	No. of animals (n)		Body weight/g		Tumor volume/mm³	RTV	T/C /%	Tumor weight/g	IR/%
Control	-	6/6		20.9 ± 0.7	22.6 ± 0.9		123.3 ± 14.1	2 513.6 ± 1 233.4	-	20.86 ± 11.31	-	2.33 ± 1.04	-
FL18	30	6/6	21.2 ± 1.8	19.3 ± 1.5	121.4 ± 7.3	368.1 ± 121.4^**	85.36	3.03 ± 0.98^**	14.53	0.27 ± 0.14^***	88.52

Compound

Dose
/mg·kg^-1

No. of animals (n)

Body weight/g

Tumor volume/mm³

RTV

T/C
/%

Tumor weight/g

IR/%

Begin/End

Begin

End

Begin

End

IR/%

Control

6/6

20.9 ± 0.7

22.6 ± 0.9

123.3 ± 14.1

2 513.6 ± 1 233.4

20.86 ± 11.31

2.33 ± 1.04

FL18

6/6

21.2 ± 1.8

19.3 ± 1.5

121.4 ± 7.3

368.1 ± 121.4^**

85.36

3.03 ± 0.98^**

14.53

0.27 ± 0.14^***

88.52

Compound	Dose /mg·kg^-1	No. of animals (n)		Body weight/g		Tumor volume/mm³	RTV	T/C /%	Tumor weight/g	IR/%
Control	-	6/6		20.9 ± 0.7	22.6 ± 0.9		123.3 ± 14.1	2 513.6 ± 1 233.4	-	20.86 ± 11.31	-	2.33 ± 1.04	-
FL18	30	6/6	21.2 ± 1.8	19.3 ± 1.5	121.4 ± 7.3	368.1 ± 121.4^**	85.36	3.03 ± 0.98^**	14.53	0.27 ± 0.14^***	88.52

Compound

Dose
/mg·kg^-1

No. of animals (n)

Body weight/g

Tumor volume/mm³

RTV

T/C
/%

Tumor weight/g

IR/%

Begin/End

Begin

End

Begin

End

IR/%

Control

6/6

20.9 ± 0.7

22.6 ± 0.9

123.3 ± 14.1

2 513.6 ± 1 233.4

20.86 ± 11.31

2.33 ± 1.04

FL18

6/6

21.2 ± 1.8

19.3 ± 1.5

121.4 ± 7.3

368.1 ± 121.4^**

85.36

3.03 ± 0.98^**

14.53

0.27 ± 0.14^***

88.52

Group	Dose/mg·kg^-1	No. of animals (n)		Body weight/g	Tumor section	Tumor volume/mm³	IR/%
Control	-	6/6		19.3 ± 0.8	17.7 ± 2.4	14.8 ± 2.28	64.26 ± 18.66	-
TMZ	30	6/6	19.2 ± 0.7	22.6 ± 0.6	0.5 ± 0.8	0.05 ± 0.10^***	99.9
FL18	22.5	6/6	19.9 ± 0.7	21.6 ± 1.3	9.8 ± 1.9	28.69 ± 15.98^**	55.4
FL18	45	6/6	20.1 ± 0.9	22.4 ± 1.7	5.8 ± 2.5^***	6.54 ± 3.60^***	89.8

Group

Dose/mg·kg^-1

No. of animals (n)

Body weight/g

Tumor section

Tumor volume/mm³

IR/%

Begin/End

Begin

End

Control

6/6

19.3 ± 0.8

17.7 ± 2.4

14.8 ± 2.28

64.26 ± 18.66

TMZ

6/6

19.2 ± 0.7

22.6 ± 0.6

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0.05 ± 0.10^***

99.9

FL18

22.5

6/6

19.9 ± 0.7

21.6 ± 1.3

9.8 ± 1.9

28.69 ± 15.98^**

55.4

FL18

6/6

20.1 ± 0.9

22.4 ± 1.7

5.8 ± 2.5^***

6.54 ± 3.60^***

89.8

Group	Dose/mg·kg^-1	No. of animals (n)		Body weight/g	Tumor section	Tumor volume/mm³	IR/%
Control	-	6/6		19.3 ± 0.8	17.7 ± 2.4	14.8 ± 2.28	64.26 ± 18.66	-
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FL18	45	6/6	20.1 ± 0.9	22.4 ± 1.7	5.8 ± 2.5^***	6.54 ± 3.60^***	89.8

Group

Dose/mg·kg^-1

No. of animals (n)

Body weight/g

Tumor section

Tumor volume/mm³

IR/%

Begin/End

Begin

End

Control

6/6

19.3 ± 0.8

17.7 ± 2.4

14.8 ± 2.28

64.26 ± 18.66

TMZ

6/6

19.2 ± 0.7

22.6 ± 0.6

0.5 ± 0.8

0.05 ± 0.10^***

99.9

FL18

22.5

6/6

19.9 ± 0.7

21.6 ± 1.3

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55.4

FL18

6/6

20.1 ± 0.9

22.4 ± 1.7

5.8 ± 2.5^***

6.54 ± 3.60^***

89.8

GLI1抑制剂FL18对胶质母细胞瘤的抑制作用及其机制

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刘春霞 ¹ , 黄璐璐 ¹ , 闫辰 ¹ , 杜倩倩 ¹ , 李铁钢 ¹ , 冯志强 ¹ , 李燕 ¹^,^* , 李学记 ²^,^*

药学学报 | 研究论文·药理学 2018,53(7): 1113-1121

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药学学报 | 研究论文·药理学 2018, 53(7): 1113-1121

GLI1抑制剂FL18对胶质母细胞瘤的抑制作用及其机制

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刘春霞¹, 黄璐璐¹, 闫辰¹, 杜倩倩¹, 李铁钢¹, 冯志强¹, 李燕¹^,^*, 李学记²^,^*

作者信息

1.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

2.中国医学科学院、北京协和医学院肿瘤医院, 国家癌症中心, 北京 100021

通讯作者:

* 李燕, Tel:86-10-63169181, E-mail:liyanxiao@imm.ac.cn;

李学记, Tel:86-10-87787350, E-mail:li-x-ji@126.com

The anti-tumor activity and mechanisms of a GLI1 inhibitor FL18 in suppression of glioblastoma growth

Chun-xia LIU¹, Lu-lu HUANG¹, Chen YAN¹, Qian-qian DU¹, Tie-gang LI¹, Zhi-qiang FENG¹, Yan LI¹^,^*, Xue-ji LI²^,^*

Affiliations

1. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

2. National Cancer Center/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China

出版时间: 2018-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2018-0219

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摘要

收起

Hedgehog（HH）信号通路的异常激活在胶质母细胞瘤的发生发展中起着重要作用。胶质瘤相关的致癌基因同族体-1（glioma-associated oncogene homoglog-1，GLI1）蛋白作为HH通路末端的转录因子，是该通路最终的功能执行者，被认为是胶质母细胞瘤的重要治疗靶点。本研究旨在探究新型GLI1抑制剂FL18的抗胶质母细胞瘤活性及其作用机制。MTT实验和集落形成实验研究FL18对脑瘤细胞的生长抑制作用；运用流式细胞术分析FL18对细胞凋亡的影响；Transwell实验探究FL18对细胞侵袭能力的抑制作用；通过体内移植瘤实验研究FL18对胶质母细胞瘤的生长抑制作用；建立及优化双荧光素酶报告基因的检测体系，并检测FL18对GLI1转录活性的影响；采用Western blot方法对FL18的作用机制进行初步探讨。FL18对体外培养的胶质母细胞瘤的半数抑制浓度（IC₅₀）在纳摩尔水平。体内实验结果显示，22.5和45 mg·kg^-1 FL18对裸鼠原位移植瘤的抑制率分别为55.4%和89.8%。FL18能够抑制GLI1的转录活性，IC₅₀为3.32×10^-11 mol·L^-1。Western blot实验显示，在FL18作用后的胶质母细胞瘤细胞和肿瘤组织中，其GLI1表达明显降低，而SMO表达无明显变化，调控GLI1上游的ERK和AKT等蛋白的磷酸化水平变化均不显著；FL18还可升高凋亡相关蛋白切割型的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（c-caspase 3）和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（c-PARP）以及Bax的表达，降低Bcl-2的表达；降低侵袭相关蛋白金属基质蛋白酶（MMP2和MMP9）的水平。以上研究结果表明，FL18通过抑制GLI1而对胶质母细胞瘤的生长起到一定的抑制作用，其抗肿瘤活性可能与抑制GLI1的表达水平有关。

关键词

胶质瘤相关的致癌基因同族体-1 / 胶质母细胞瘤 / 抗肿瘤 / 侵袭

Abstract

收起

The abnormal activation of hedgehog (HH) signaling pathway plays an important role in the development and progression of glioblastoma (GBM). As a transcription factor at the end of the HH pathway, the final effector of glioma-associated oncogene homoglog-1 (GLI1) is an important target in the treatment of GBM. The study was designed to evaluate the anti-tumor activities and mechanisms of a novel GLI1 inhibitor FL18 in GBM. MTT and colony formation assay were performed to determine anti-proliferation activity of FL18 in vitro. The effect of FL18 on cell apoptosis was measured by flow cytometry (FCM) analysis. Transwell experiment was used to explore the inhibitory activity of FL18 in cell invasion. In vivo experiments, the subcutaneously transplanted and orthotopic U-87 MG GBM xenograft model were used to study the activity of FL18 on tumor growth. The optimized dual report gene screening model was used to detect the effect of FL18 on the transcriptional activity of GLI1. Western blot assay was used to study the mechanisms of action of FL18. The results showed that the IC₅₀ of FL18 in glioblastoma was in the nanomole level in vitro. It was observed that 22.5 and 45 mg·kg^-1 FL18 reduced the tumor volume with the rate of 55.4% and 89.8% in xenograft model in mice in situ. The IC₅₀ of FL18 on the inhibition of GLI1 transcriptional activity was 3.32×10^-11 mol·L^-1 analyzed by the optimized dual report gene screening model. By the Western blot experiments, it was proved that FL18 inhibited expression of GLI1 without influencing the upstream canonical HH/SMO signaling and cross-talk oncogenic pathway, such as ERK and AKT signaling. The results also demonstrated that FL18 significantly downregulated GLI1 target genes such as Bcl-2, MMP2 and MMP9 and increased the expression of c-caspase3, c-PARP and Bax. These data suggest that FL18 may generate the anti-glioma activity by inhibition of GLI1.

Key words

glioma-associated oncogene homoglog-1 / glioblastoma / anti-tumor / invasion

引用本文

刘春霞, 黄璐璐, 闫辰, 杜倩倩, 李铁钢, 冯志强, 李燕, 李学记. GLI1抑制剂FL18对胶质母细胞瘤的抑制作用及其机制. 药学学报, 2018 , 53 (7) : 1113 -1121 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2018-0219

Chun-xia LIU, Lu-lu HUANG, Chen YAN, Qian-qian DU, Tie-gang LI, Zhi-qiang FENG, Yan LI, Xue-ji LI. The anti-tumor activity and mechanisms of a GLI1 inhibitor FL18 in suppression of glioblastoma growth[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2018 , 53 (7) : 1113 -1121 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2018-0219

正文

收起

胶质母细胞瘤是最常见也是恶性程度最高的一种原发性恶性脑肿瘤, 15%颅内肿瘤和60%~75%星形细胞瘤都属于胶质母细胞瘤^[1]。胶质母细胞瘤具有发病率高、复发率高、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特点。目前胶质母细胞瘤的治疗方法包括手术切除、化疗、放疗以及化疗和放疗的联合应用; 其中化疗常使用的药物为替莫唑胺(temozolomide, TMZ)。胶质母细胞瘤患者的预后较差, 多数患者生存期仅有1年, 只有5%的患者生存期在5年以上, 化疗联合放疗的中位生存期只有14.6个月^[2-4], 因此研究新型抗胶质母细胞瘤的药物迫在眉睫。

近年来研究发现, Hedgehog (HH)信号通路的异常激活在胶质母细胞瘤的发生发展中起着重要作用^[5-9]。HH信号通路主要由分泌型糖蛋白SHH配体、跨膜蛋白受体Patched (PTCH)和Smoothened (SMO), 以及下游转录因子胶质瘤相关的致癌基因同族体(glioma-associated oncogene homoglog, GLI)组成。GLI功能状态的改变将直接导致HH信号通路下游目的基因转录水平的改变, 在致瘤过程中起着重要作用。GLI1作为HH通路末端的一种直接调控靶基因的转录激活因子, 其激活调控发生在转录水平, 是该通路不同水平激活的最后共同通道, 在胶质母细胞瘤的发生发展中起着重要的作用^{[5, 8]}。由于HH/GLI1通路相关蛋白的表达水平与胶质母细胞瘤的恶性程度密切相关, 抑制GLI1转录因子的活化不仅能够有效抑制肿瘤的发生发展, 而且能够遏制肿瘤的转移和耐药, 因此该通路有可能作为抗胶质母细胞瘤药物的研发靶点^[10]。

中国医学科学院药物研究所药物化学实验室冯志强研究员课题组通过分子设计定向合成了一系列GLI1抑制剂, 旨在提供一种含有抗肿瘤结构通式、含丙炔酰胺基的2-苯基咪唑类衍生物及其可药用盐等。前期运用多株肿瘤细胞对多种化合物进行抗肿瘤活性筛选, 结果显示FL18具有一定的抗胶质母细胞瘤活性^[11]。本实验进一步研究FL18的体内外抗肿瘤活性并对其作用机制进行初步探讨。

材料与方法

收起

药品及试剂 FL18由中国医学科学院药物研究所药物化学实验室冯志强研究员课题组合成并提供(纯度为99.5%)。DMEM培养基和MEM培养基购自Gibco公司; 胰蛋白酶购自北京莱博生物实验材料研究所; 胎牛血清(FBS)购自元亨圣马公司; 青霉素钠盐及硫酸链霉素购自华北制药股份有限公司。溴化四氮唑蓝(MTT)、RIPA组织/细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。Transwell细胞培养小室购自美国Corning公司。姬姆萨染色液购自北京赛驰生物科技有限公司, HE染色液购自北京益利精细化学品有限公司。Triton X-100购自Farco公司。pGMGLI-Lu报告基因和内参pGMR-TK购自吉满生物科技有限公司; pGPU6/GFP/ Neo-GLI1-shRNA和pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA均购自苏州吉玛基因股份有限公司; 转染试剂Lipofectamine^TM2000为Invitrogen公司产品, 双荧光素酶检测试剂盒为Promega公司产品。牛血清白蛋白第五组分(BSA)购自ICN Immuno Biologicals公司。Western blot超敏发光液购自北京普利莱基因技术有限公司。一抗抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司; 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自中杉金桥生物技术有限公司。过硫酸铵、聚丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自北京康为世纪公司。戊巴比妥钠购自MYM生物科技有限公司。二甲基亚砜(DMSO)、无水甲醇、30%过氧化氢等其他试剂均为国产市售分析纯。体外实验药物均用DMSO配制, 并用DMSO作为溶剂对照, DMSO终浓度均不超过0.1%。体内实验药物用20% PEG400溶解。

仪器 ELx800酶标仪(美国BioTek公司), Olympus倒置显微镜(日本Olympus公司), GE Image Quant LAS4000超灵敏化学发光成像分析仪(美国通用电气公司)。

细胞培养 人胶质母细胞瘤细胞株U-87 MG、人髓母细胞瘤细胞株Daoy和人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心; 人胶质母细胞瘤细胞株T98G购自上海复祥生物科技有限公司; 稳定转染SHH的人肾上皮细胞株SHH-HEK293由本实验室构建并保种。SHH-HEK293、Daoy、T98G和SH-SY5Y用DMEM培养基培养, U-87 MG用MEM培养基培养。两种培养基中均加入10% FBS及100 u·mL^-1青霉素、100 μg·mL^-1链霉素。将细胞置于含5% CO₂的37 ℃培养箱中培养。用0.25%胰酶消化传代, 每周传代2次。

MTT法检测肿瘤细胞存活率 将对数生长期的细胞用胰酶消化后, 配制成细胞悬液, 按3 000个/孔接种于96孔板中, 每孔100 µL。次日加入不同浓度样品及相应溶剂对照的新鲜培养基, 每孔加100 µL (DMSO终浓度 < 0.1%), 受试化合物设3~5个剂量组, 每组设3个平行孔。于37 ℃培养箱继续培养12、24、48、72和96 h后, 弃上清, 每孔加入新鲜配制的含0.5 mg·mL^-1 MTT的无血清培养基200 µL。继续培养4 h, 弃上清, 每孔加入DMSO 200 µL溶解MTT甲臜沉淀, 微型振荡器振荡混匀后, 酶标仪在检测波长570 nm条件下测定吸光度值(A₅₇₀), 以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组, 按下列公式计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率, 并按中效方程计算IC₅₀:抑制率(%) = (A_{570溶剂对照组}-A_570给药组)/A_{570溶剂对照组}×100%, 以上实验重复3次。

集落形成实验 将对数生长期的细胞用胰酶消化后, 配制成单细胞悬液, 显微镜下计数后调整细胞数为每毫升150个, 将其接种于6孔板中, 每孔2 mL。培养24 h后, 加不同浓度的FL18, 溶剂对照组和化合物各剂量组均设3个复孔, FL18持续作用14天后, 弃去培养基, 每孔用预冷的PBS洗2次, 无水甲醇固定15 min, 弃去后静置干燥; 每孔加入姬姆萨染色液1 mL染色10 min后, 洗净多余的染料, 室温干燥后计数。

流式细胞术分析细胞凋亡情况 FL18处理胶质母细胞瘤细胞72 h后, 将细胞用预冷的PBS洗2次。用胰酶消化, 以含10% FBS的MEM培养基终止消化。4 ℃、800 r·min^-1条件下离心5 min, 收集细胞。弃去上清液, 预冷的PBS洗2次后置于预冷的70%乙醇中, 于-20 ℃固定24 h以上(3周以内), 800 r·min^-1离心5 min, 彻底去除乙醇。预冷的PBS清洗2次, 将细胞重悬, 加入PI染液(0.1 mg·mL^-1 PI、0.02 mg·mL^-1 RNase A、1 mg·mL^-1柠檬酸钠和0.3% Triton X-100) 0.5 h, 过300目筛, 在流式细胞仪上计数10 000个细胞, 分析细胞凋亡情况。

重组基质膜侵袭运动实验 将Matrigel稀释成0.5 mg·mL^-1, 在Transwell细胞培养小室的膜内表面涂Matrigel 10 µL (0.5 µg·µL^-1), 超净台内吹干。将膜外表面涂上fibronectin (5 μg/10 μL), 超净台内吹干备用。在24孔培养板内加入10% FBS-MEM, 每孔600 μL。用1 mmol·L^-1 EDTA收集对数生长期的肿瘤细胞, 悬浮于含0.1% BSA-MEM培养基中, 细胞数为每毫升5.0×10⁶个。将细胞悬液加到Transwell细胞培养小室中, 每小室200 μL。将小室浸于24孔板的条件中, 37 ℃、5% CO₂培养箱内孵育18 h。将Transwell取出, 滤膜用甲醇固定10 min, HE染色, 水洗, 用棉签擦掉未穿过膜的细胞, 用二甲苯透明后将膜封于载玻片上, 于400倍显微镜下计数侵袭细胞数, 每膜计数上下左右4个不同视野的透过细胞数, 每组平行设3孔, 计算平均值。以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。抑制率(%) = (对照组侵袭细胞数-给药组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数× 100%。

人胶质母细胞瘤异体移植瘤实验 BALB/c裸鼠, 体重19.0~23.0 g, 雌性, 购自北京华阜康生物科技股份有限公司, 许可证号: SCXK (京) 2014-0004。剥离传代于裸鼠腋下的U-87 MG胶质母细胞瘤组织, 去除筋膜, 剪碎瘤组织后分成大小均一的2~3 mm³瘤块, 接种于BALB/c裸鼠腋背部。待肿瘤平均体积达到200 mm³时, 将动物随机分为两组, 溶剂对照组和FL18 30 mg·kg^-1剂量组。接种当天计为第0天, FL18组从接种后第7天开始给药(每日1次, 灌胃), 给药至接种后第31天。每周2次使用游标卡尺测量瘤体积(肿瘤体积=长×宽²/ 2), 计算相对肿瘤体积[relative tumor volume, RTV = T (给药组肿瘤体积)/C (对照组肿瘤体积)]。实验结束将动物脱臼处死, 剥离肿瘤并称重, 计算肿瘤生长抑制率。部分肿瘤组织于-80 ℃冰箱保存用于后续机制研究。

人胶质母细胞瘤的原位移植瘤实验^[12] 将BALB/c裸鼠(体重18.5~21.0 g)用50 mg·kg^-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后, 固定于小鼠脑立体定位仪上。酒精棉球消毒裸鼠头皮后, 用手术刀片将头皮矢状切开约5 mm。用3% H₂O₂清洁切口至颅骨前囟点暴露, 精确定位(前囟后2 mm, 旁开右侧1.5 mm)后用牙科钻打孔。用26号微量进样器手动注射5 μL含2×10⁶个U-87 MG细胞的细胞悬液, 进针深度3 mm, 退针0.5 mm, 注射时间5 min, 滞针10 min, 将针缓慢抬出, 将切口缝合。接种当天计为第0天, TMZ组从接种后第5天开始给药(每日1次, 灌胃), 共给药5天。FL18组从接种后第5天开始给药(每日1次, 灌胃), 给药至接种后第14天。采用核磁共振成像仪(MRI)检测颅内肿瘤体积(扫描截面间距为0.5 mm), 并计算肿瘤生长抑制率。

建立及优化双荧光素酶报告基因的检测体系^[13] 取对数生长期的Daoy细胞用胰酶消化后, 配制成细胞悬液, 按每孔4 000个细胞接种于96孔板中, 每孔100 µL, 用含10% FBS、无双抗的MEM培养基在37 ℃、5% CO₂的条件下进行培养。24 h后按照Lipofectamine^TM 2000说明书方法进行转染, pGMGLI- Lu报告基因质粒的浓度为每孔0.1 μg, 内参pGMR- TK质粒的浓度为每孔0.01 μg, 每组设4个复孔, 置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养。次日, 加入不同浓度的化合物FL18, 化合物配制用SHH-HEK293细胞培养分泌的上清(经过筛选24、48和72 h时间点下, 不同细胞浓度下SHH-HEK293细胞分泌的上清进行瞬时转染, 比较得出最优筛选条件), 同时设置空白对照组。于37 ℃、5% CO₂培养箱培养48 h后, 按照双荧光素酶试剂盒说明书的方法进行检测。取细胞裂解液25 μL加入96孔白板中, 使用荧光素酶检测试剂Ⅱ和Stop & Glo^®试剂进行目的报告基因荧火虫荧光素酶及内参海肾素荧光素酶的检测, 计算GLI1与Renilla的比值。

Western blot检测分析蛋白表达^[14]

细胞蛋白的提取 FL18处理胶质母细胞瘤U-87 MG细胞72 h后, 提取总蛋白, 于-80 ℃储存备用。采用BCA法, 以一定浓度梯度的BSA溶液为标准, 于570 nm处测定吸光度值, 绘制标准曲线, 同时测定样品的吸光度值并计算蛋白含量, 之后用细胞裂解液将各样品稀释至相同浓度。

组织蛋白提取用裂解液匀浆FL18作用后的裸鼠肿瘤组织(对照组和给药组各随机选取2只动物肿瘤组织), 冰上裂解1 h, 12 000 r·min^-1离心取上清, 得到组织蛋白, 于-80 ℃储存备用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白电转移取提取的蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白电转移。将PVDF膜以含有5%脱脂奶粉的TTBS (0.1% Tween-20, 10 mmol·L^-1 Tris-HCl, 150 mmol·L^-1 NaCl, pH 7.5)室温封闭非特异结合位点1 h。将膜与稀释后的指定一抗4 ℃孵育过夜, 用TTBS液洗膜3次。将膜转入稀释后的二抗工作液(用TTBS液按1:5 000稀释辣根过氧化酶标记的二抗), 室温反应1 h。TTBS液洗膜3次, 加入Western blot超敏发光液ECL于照相系统照相。

数据统计与处理 实验结果数据用均值±标准差(x ± s)表示, 数据分析采用Student’s-test检验, P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

收起

1 FL18对脑瘤细胞的生长抑制作用

采用MTT法检测FL18对U-87 MG、T98G、Daoy和SH-SY5Y 4株细胞的生长抑制作用(96 h)。结果显示, FL18可以抑制脑瘤细胞的增殖, 且抑制作用与GLI1的表达相关(图 1A)。FL18对GLI1表达较高的细胞株U-87 MG、T98G和Daoy敏感性较强, 半数抑制浓度(IC₅₀)在纳摩尔水平; 而对GLI1表达较低的细胞株SH-SY5Y敏感性较差, IC₅₀仅为(372.01 ± 28.23) nmol·L^-1 (表 1)。FL18作用于U-87 MG (图 1B)和T98G (图 1C) 12、24、48、72和96 h后, 其抑制作用呈现良好的时效关系和量效关系。在考察剂量范围内, 随着FL18剂量的增加, 抑制作用逐渐加强。在12~96 h内, 随着时间延长, 其抑制作用趋于明显。药物作用72~96 h时, 其抑制作用趋于稳定。

2 FL18对脑瘤集落形成的抑制作用

集落形成实验进一步表明, FL18对脑瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。4株脑瘤细胞中, U-87 MG和SH-SY5Y的集落形成率较低外, 其他2株脑瘤细胞的溶剂对照组(control)的集落形成率在90%以上。FL18处理组的集落形成数目明显减少, 且随剂量升高, 抑制集落形成的作用增强。FL18对U-87 MG (图 1D)、T98G (图 1E)、Daoy (图 1F)和SH-SY5Y (图 1G) 4株细胞集落形成的半数有效浓度(EC₅₀)分别为0.33 ± 0.05、6.37 ± 0.62、6.11 ± 0.86和206.04 ± 8.96 nmol·L^-1, 其对集落形成的抑制作用与GLI1的表达水平也具有一定的相关性, 即对GLI1表达较高的细胞株(U-87 MG、T98G和Daoy)的集落形成抑制浓度明显低于GLI1表达较低的细胞株(SH-SY5Y)。

3 FL18对胶质母细胞瘤细胞凋亡的诱导作用

采用流式细胞术分析化合物FL18对胶质母细胞瘤U-87 MG细胞和T98G细胞凋亡的影响。在所检测的剂量下, FL18剂量依赖地增加U-87 MG和T98G细胞凋亡比例(Sub G1)。在U-87 MG细胞中, 与对照组相比, 2.5 nmol·L^-1 FL18作用72 h后, 凋亡比例可显著升高2倍以上(图 1H); 在T98G细胞中, 0.6~15.0 nmol·L^-1内, 随着剂量的增加, FL18诱导凋亡的作用增强, 72 h后的T98G细胞凋亡比例较对照组升高约8倍(图 1I)。

4 FL18对胶质母细胞瘤细胞侵袭能力的抑制作用

采用Transwell实验检测FL18对胶质母细胞瘤U-87 MG细胞、T98G细胞侵袭能力的影响。FL18处理18 h后的细胞, 随着剂量增加, 穿过重组基底膜的细胞数目逐渐减少(图 2A、C)。0.2 nmol·L^-1浓度下, FL18对U-87 MG细胞侵袭的抑制率为(66.3 ± 3.1)% (图 2B), 相同剂量下FL18对U-87 MG细胞增殖的抑制率小于5%; 1.5 nmol·L^-1浓度下, FL18对T98G细胞侵袭的抑制率为(59.0 ± 1.6)% (图 2D), 相同剂量下对该细胞增殖的抑制率小于20%。

5 FL18对裸鼠异位移植瘤的生长抑制作用

体内研究结果显示, FL18可以有效抑制裸鼠移植瘤U-87 MG的生长(图 3A、B)。30 mg·kg^-1 FL18对U-87 MG异位移植瘤的抑制率为88.52% (按肿瘤重量计算), T/C为14.53% (表 2)。

6 FL18对裸鼠原位胶质母细胞瘤的生长抑制作用

由于FL18需要通过血脑屏障才能起到治疗胶质母细胞瘤的作用, 因此异位移植瘤模型不足以充分反映药物的特性和疗效。随着影像技术的发展, 脑瘤原位移植瘤模型已经成为脑肿瘤研究必不可少的工具^[12]。采用裸鼠脑部原位接种U-87 MG的方法, 建立裸鼠原位胶质母细胞瘤模型。分为溶剂对照组、TMZ 30 mg·kg^-1组、FL18 22.5和45 mg·kg^-1组。给药10天后(接种后第14天), 进行核磁共振(MRI)检测。核磁图像(图 3D~F)显示, FL18处理组的动物肿瘤截面数明显减少, 每个截面的肿瘤面积减小。运用DICOM Image Viewer软件进行分析, 计算得到的FL18处理组肿瘤体积明显小于溶剂对照组(图 3C), FL18在22.5和45 mg·kg^-1剂量下, 对U-87 MG原位肿瘤的抑制率(按肿瘤体积计算)分别为55.4%和89.8% (表 3), 且对动物体重无明显影响。据此推断FL18对胶质母细胞瘤具有较强的抑制作用, 且动物的耐受性较好。

7 FL18对GLI1转录活性的抑制作用

为了检测FL18对GLI1转录活性的作用, 建立双荧光素酶报告基因的检测体系。经过优化, 最优的检测条件是: SHH-HEK293细胞浓度为每毫升5×10⁵个, 培养时间为48 h时, 其分泌的上清对Daoy细胞HH通路的刺激作用最强, 在此条件下研究FL18对GLI1转录活性的抑制作用。FL18作用细胞48 h后, 其抑制GLI1转录活性的IC₅₀为(3.32 ± 0.03)×10^-11 mol·L^-1 (图 4A)。

鉴于FL18对GLI1的转录活性具有较强的抑制作用, 采用Western blot的方法进一步检测FL18对GLI1相关蛋白表达的影响。FL18处理72 h后的U-87 MG细胞, 其GLI1表达明显降低, 且具有明显的剂量依赖关系; 给药30 mg·kg^-1的肿瘤组织(异位移植瘤)中, GLI1表达也显著降低。SMO是GLI1的调控蛋白之一, 在胶质母细胞瘤中也常出现SMO蛋白表达的升高, 但在FL18作用72 h的U-87 MG细胞以及给药30 mg·kg^-1的肿瘤组织(异位移植瘤)中并没有观察到SMO蛋白的明显变化(图 4B、C), 推测FL18对GLI1的抑制作用不是由SMO介导的。

8 Western blot检测分析蛋白表达

上述结果表明, FL18可较强地抑制胶质母细胞瘤的增殖及侵袭能力, 诱导细胞凋亡, 抑制GLI1的转录活性。为进一步探究其作用机制, 采用Western blot的方法检测FL18对GLI1相关蛋白表达的影响。

据报道, ERK/AKT通路可通过调节GLI1的转录活性, 从而调控肿瘤细胞增殖、侵袭及细胞凋亡^[15], 因此对FL18作用后的细胞及肿瘤组织中ERK/AKT的表达情况进行考察。结果表明, p-ERK、ERK、p-AKT和AKT蛋白的表达没有明显变化(图 5A、B)。上述结果初步提示, FL18对GLI1转录活性的抑制不是ERK/AKT介导的。

由于GLI1对凋亡相关蛋白Bcl-2的表达具有调节作用^{[16, 17]}, 本研究对凋亡相关蛋白的表达情况进行检测。结果表明, 0.5 nmol·L^-1 FL18作用U-87 MG细胞72 h后, 其切割型的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (c-caspase 3)和c-PARP以及Bax的表达水平均明显升高, Bcl-2和caspase 3表达降低, 且随着剂量增加(0.1~2.5 nmol·L^-1), 具有明显的剂量依赖性。在给药30 mg·kg^-1的肿瘤组织(异位移植瘤)中也得到了相似的结果(图 5C、D)。

另外, 由于金属基质蛋白酶(MMP2和MMP9)的表达受GLI1的调控作用, 且其表达水平与胶质母细胞瘤的侵袭能力具有密切的关系^[18], 本研究检测了FL18对MMP2和MMP9蛋白表达的影响。结果表明, 在考察剂量范围内, FL18可以抑制胶质母细胞瘤U-87 MG细胞中MMP2和MMP9蛋白的表达; 在FL18作用的肿瘤组织(异位移植瘤)中, MMP2和MMP9也观察到明显的降低(图 5E、F)。

上述结果表明: FL18作用于胶质母细胞瘤后, 在较低浓度即可对GLL1产生较强的抑制作用, 但对调控其表达的相关上游通路作用较弱。

讨论

收起

胶质母细胞瘤是恶性程度高、死亡率高的脑肿瘤, 目前针对此肿瘤上市的口服药物只有替莫唑胺, 因此研究治疗胶质母细胞瘤的药物具有重要意义。研究表明, HH通路与胶质母细胞瘤的发生发展密切相关^[5]。已上市的HH通路抑制剂主要是以SMO为靶点, 但在治疗过程中, 常会出现耐药现象^[19-25]。一方面可能由于SMO的突变, 另一方面可能由于PI3K等通路的上调^{[19, 23]}。因此通过直接抑制HH/GLI1通路下游末端关键因子GLI1的转录激活, 阻断HH信号通路, 从而有效地对抗胶质母细胞瘤的转移、耐药及复发^{[5, 8]}, 有可能是治疗胶质母细胞瘤的更佳选择。其一, 直接抑制GLI1可减少因抑制通路上游分子所产生的不良反应; 其二, 直接抑制GLI1可避免由于抑制通路上游分子导致其他通路对GLI1活化的补偿, 避免耐药的产生。所以基于HH-GLI1通路的药物研发, 特别是直接抑制GLI1的药物必将成为抗肿瘤药物研究的热点和重点^{[8, 20-22]}。

FL18是通过分子设计合成的GLI1的直接抑制剂。体外研究表明, FL18对胶质母细胞瘤U-87 MG和T98G的增殖都具有较强的抑制作用, 其IC₅₀在纳摩尔水平。且FL18对GLI1表达较高的肿瘤细胞敏感性较强, 对GLI1表达较低的肿瘤细胞敏感性较弱, 提示其对肿瘤细胞的抑制作用与GLI1表达水平具有相关性。此外, FL18在体内对裸鼠异位移植瘤模型和裸鼠原位移植瘤模型均具有较强的抑制作用。

报告基因的结果亦表明, FL18可以通过抑制GLI1的转录活性, 从而下调GLI1蛋白水平的变化, 进而抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖。同时, FL18对调控GLI1表达的SMO及ERK/AKT的磷酸化水平均无明显影响。因此推测FL18的作用是通过GLI1介导的, 且FL18有可能避免SMO抑制剂引起的耐药。

已有研究表明, GLI1可通过抑制Bcl-2的表达从而诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡^{[16, 17]}。Western blot结果表明, FL18可以抑制Bcl-2的表达, 升高c-caspase 3、c-PARP和Bax的表达。文献报道, 胶质母细胞瘤较强的侵袭能力与其恶性程度具有重要关系, GLI1是细胞侵袭能力相关蛋白MMP2和MMP9的调控因子, 可通过直接下调MMP2和MMP9的表达水平, 从而抑制细胞的侵袭能力^{[18, 26-28]}。本研究中, FL18可以抑制MMP2和MMP9的表达。因此推测, FL18可能通过抑制GLI1的作用, 进而影响细胞凋亡和侵袭相关蛋白的表达, 从而通过诱导细胞凋亡, 抑制细胞侵袭, 发挥抗胶质母细胞瘤的活性。

FL18为GLI1转录抑制剂研究提供了新的结构类型^[11], 国内外未见报道; FL18既可产生针对胶质母细胞瘤细胞的治疗效果, 又可以避免SMO抑制剂所产生的耐药问题和不良反应, 因此无论是该化合物本身还是其衍生物, 都具有进一步开发的价值。

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中国医学科学院医学与健康科技创新工程-重大协同创新项目(2016-I2M-1-008)

参考文献

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2018年第53卷第7期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2018-0219

接收时间：2018-03-14
首发时间：2026-01-15
出版时间：2018-07-12

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收稿日期：2018-03-14
修回日期：2018-04-07

基金

中国医学科学院医学与健康科技创新工程-重大协同创新项目(2016-I2M-1-008)

作者信息

1.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

2.中国医学科学院、北京协和医学院肿瘤医院, 国家癌症中心, 北京 100021

通讯作者:

* 李燕, Tel:86-10-63169181, E-mail:liyanxiao@imm.ac.cn;

李学记, Tel:86-10-87787350, E-mail:li-x-ji@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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Compound	IC₅₀/nmol·L^-1
FL18	3.31 ± 0.12	12.47 ± 1.23	7.09 ± 0.88	372.01 ± 28.23

Compound

IC₅₀/nmol·L^-1

U-87 MG

T98G

Daoy

SH-SY5Y

FL18

3.31 ± 0.12

12.47 ± 1.23

7.09 ± 0.88

372.01 ± 28.23

Compound	Dose /mg·kg^-1	No. of animals (n)		Body weight/g		Tumor volume/mm³	RTV	T/C /%	Tumor weight/g	IR/%
Control	-	6/6		20.9 ± 0.7	22.6 ± 0.9		123.3 ± 14.1	2 513.6 ± 1 233.4	-	20.86 ± 11.31	-	2.33 ± 1.04	-
FL18	30	6/6	21.2 ± 1.8	19.3 ± 1.5	121.4 ± 7.3	368.1 ± 121.4^**	85.36	3.03 ± 0.98^**	14.53	0.27 ± 0.14^***	88.52

Compound

Dose
/mg·kg^-1

No. of animals (n)

Body weight/g

Tumor volume/mm³

RTV

T/C
/%

Tumor weight/g

IR/%

Begin/End

Begin

End

Begin

End

IR/%

Control

6/6

20.9 ± 0.7

22.6 ± 0.9

123.3 ± 14.1

2 513.6 ± 1 233.4

20.86 ± 11.31

2.33 ± 1.04

FL18

6/6

21.2 ± 1.8

19.3 ± 1.5

121.4 ± 7.3

368.1 ± 121.4^**

85.36

3.03 ± 0.98^**

14.53

0.27 ± 0.14^***

88.52

Group	Dose/mg·kg^-1	No. of animals (n)		Body weight/g	Tumor section	Tumor volume/mm³	IR/%
Control	-	6/6		19.3 ± 0.8	17.7 ± 2.4	14.8 ± 2.28	64.26 ± 18.66	-
TMZ	30	6/6	19.2 ± 0.7	22.6 ± 0.6	0.5 ± 0.8	0.05 ± 0.10^***	99.9
FL18	22.5	6/6	19.9 ± 0.7	21.6 ± 1.3	9.8 ± 1.9	28.69 ± 15.98^**	55.4
FL18	45	6/6	20.1 ± 0.9	22.4 ± 1.7	5.8 ± 2.5^***	6.54 ± 3.60^***	89.8

Group

Dose/mg·kg^-1

No. of animals (n)

Body weight/g

Tumor section

Tumor volume/mm³

IR/%

Begin/End

Begin

End

Control

6/6

19.3 ± 0.8

17.7 ± 2.4

14.8 ± 2.28

64.26 ± 18.66

TMZ

6/6

19.2 ± 0.7

22.6 ± 0.6

0.5 ± 0.8

0.05 ± 0.10^***

99.9

FL18

22.5

6/6

19.9 ± 0.7

21.6 ± 1.3

9.8 ± 1.9

28.69 ± 15.98^**

55.4

FL18

6/6

20.1 ± 0.9

22.4 ± 1.7

5.8 ± 2.5^***

6.54 ± 3.60^***

89.8