药学学报

C	δ_C	δ_H (mult, J in Hz)
1	39.8	0.90 (1H, s); 1.43 (1H, m)
2	27.3	1.50 (1H, m); 1.56 (1H, m)
3	90.7	3.10 (1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz)
4	40.9
5	62.4	1.06 (1H, m)
6	68.8	3.62 (1H, dd, J = 11.5, 5.5 Hz)
7	47.3	1.67 (1H, m); 1.85 (1H, m)
8	41.9
9	52.4	1.38 (1H, m)
10	40.0
11	32.0	1.83 (1H, s); 1.97 (1H, m)
12	71.7	3.81 (1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz)
13	50.7	1.72 (1H, m)
14	55.1
15	31.2	1.02 (1H, m); 1.29 (1H, s)
16	26.5	1.20 (1H, m); 1.52 (1H, m)
17	58.8	2.00 (1H, m)
18	17.7	0.94 (3H, s)
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20	74.4
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24	126.2	5.11 (1H, t, J = 7.0 Hz)
25	132.0
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27	17.8	1.34 (3H, s)
28	31.9	1.65 (3H, s)
29	16.8	1.12 (3H, s)
30	17.1	0.92 (3H, s)
3-O-Glc-1'	107.0	4.28 (1H, d, J = 8.0 Hz)
2'	75.7	3.30 (1H, m)
3'	78.3	3.35 (1H, m)
4'	72.0	3.24 (1H, m)
5'	77.7	3.17 (1H, m)
6'	62.8	4.00 (1H, td, J = 10.5, 3.5 Hz); 3.52 (1H, m)

δ_C

δ_H (mult, J in Hz)

39.8

0.90 (1H, s); 1.43 (1H, m)

27.3

1.50 (1H, m); 1.56 (1H, m)

90.7

3.10 (1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz)

40.9

62.4

1.06 (1H, m)

68.8

3.62 (1H, dd, J = 11.5, 5.5 Hz)

47.3

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41.9

52.4

1.38 (1H, m)

40.0

32.0

1.83 (1H, s); 1.97 (1H, m)

71.7

3.81 (1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz)

50.7

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55.1

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132.0

25.9

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31.9

1.65 (3H, s)

16.8

1.12 (3H, s)

17.1

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3-O-Glc-1'

107.0

4.28 (1H, d, J = 8.0 Hz)

75.7

3.30 (1H, m)

78.3

3.35 (1H, m)

72.0

3.24 (1H, m)

77.7

3.17 (1H, m)

62.8

4.00 (1H, td, J = 10.5, 3.5 Hz); 3.52 (1H, m)

C	δ_C	δ_H (mult, J in Hz)
1	39.8	0.90 (1H, s); 1.43 (1H, m)
2	27.3	1.50 (1H, m); 1.56 (1H, m)
3	90.7	3.10 (1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz)
4	40.9
5	62.4	1.06 (1H, m)
6	68.8	3.62 (1H, dd, J = 11.5, 5.5 Hz)
7	47.3	1.67 (1H, m); 1.85 (1H, m)
8	41.9
9	52.4	1.38 (1H, m)
10	40.0
11	32.0	1.83 (1H, s); 1.97 (1H, m)
12	71.7	3.81 (1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz)
13	50.7	1.72 (1H, m)
14	55.1
15	31.2	1.02 (1H, m); 1.29 (1H, s)
16	26.5	1.20 (1H, m); 1.52 (1H, m)
17	58.8	2.00 (1H, m)
18	17.7	0.94 (3H, s)
19	17.6	1.01 (3H, s)
20	74.4
21	26.9	1.04 (3H, s)
22	36.2	1.46 (1H, m); 1.69 (1H, s)
23	23.3	1.99 (1H, m); 2.12 (1H, m)
24	126.2	5.11 (1H, t, J = 7.0 Hz)
25	132.0
26	25.9	1.59 (3H, s)
27	17.8	1.34 (3H, s)
28	31.9	1.65 (3H, s)
29	16.8	1.12 (3H, s)
30	17.1	0.92 (3H, s)
3-O-Glc-1'	107.0	4.28 (1H, d, J = 8.0 Hz)
2'	75.7	3.30 (1H, m)
3'	78.3	3.35 (1H, m)
4'	72.0	3.24 (1H, m)
5'	77.7	3.17 (1H, m)
6'	62.8	4.00 (1H, td, J = 10.5, 3.5 Hz); 3.52 (1H, m)

δ_C

δ_H (mult, J in Hz)

39.8

0.90 (1H, s); 1.43 (1H, m)

27.3

1.50 (1H, m); 1.56 (1H, m)

90.7

3.10 (1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz)

40.9

62.4

1.06 (1H, m)

68.8

3.62 (1H, dd, J = 11.5, 5.5 Hz)

47.3

1.67 (1H, m); 1.85 (1H, m)

41.9

52.4

1.38 (1H, m)

40.0

32.0

1.83 (1H, s); 1.97 (1H, m)

71.7

3.81 (1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz)

50.7

1.72 (1H, m)

55.1

31.2

1.02 (1H, m); 1.29 (1H, s)

26.5

1.20 (1H, m); 1.52 (1H, m)

58.8

2.00 (1H, m)

17.7

0.94 (3H, s)

17.6

1.01 (3H, s)

74.4

26.9

1.04 (3H, s)

36.2

1.46 (1H, m); 1.69 (1H, s)

23.3

1.99 (1H, m); 2.12 (1H, m)

126.2

5.11 (1H, t, J = 7.0 Hz)

132.0

25.9

1.59 (3H, s)

17.8

1.34 (3H, s)

31.9

1.65 (3H, s)

16.8

1.12 (3H, s)

17.1

0.92 (3H, s)

3-O-Glc-1'

107.0

4.28 (1H, d, J = 8.0 Hz)

75.7

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78.3

3.35 (1H, m)

72.0

3.24 (1H, m)

77.7

3.17 (1H, m)

62.8

4.00 (1H, td, J = 10.5, 3.5 Hz); 3.52 (1H, m)

人参糖基转移酶PgUGT74AE2催化生成新型人参三醇皂苷研究

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张婷婷 , 梁会超 , 巩婷 , 胡宗风 , 顾安頔 , 杨金玲 ^* , 朱平 ^*

药学学报 | 研究论文 2018,53(9): 1565-1570

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药学学报 | 研究论文 2018, 53(9): 1565-1570

人参糖基转移酶PgUGT74AE2催化生成新型人参三醇皂苷研究

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张婷婷, 梁会超, 巩婷, 胡宗风, 顾安頔, 杨金玲^*, 朱平^*

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室&国家卫生健康委员会天然药物生物合成重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

* 杨金玲, Tel:86-10-63165199, Fax:86-10-63165197, E-mail:yangjl@imm.ac.cn;

朱平, E-mail:zhuping@imm.ac.cn

Studies on the enzymatic synthesis of a new PPT-type ginsenoside via UDP-glycosyltransferase PgUGT74AE2 from Panax ginseng

Ting-ting ZHANG, Hui-chao LIANG, Ting GONG, Zong-feng HU, An-di GU, Jin-ling YANG^*, Ping ZHU^*

Affiliations

State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines and Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of National Health Commission of PRC, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2018-09-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2018-0300

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摘要

收起

人参（Panax ginseng）来源的糖基转移酶PgUGT74AE2能够催化原人参二醇（protopanaxadiol，PPD）的C-3位羟基发生糖基化反应，生成人参皂苷Rh2，但其催化原人参三醇（protopanaxatriol，PPT）的C-3位羟基发生糖基化反应的研究至今未见报道。本研究构建重组表达质粒pET-32a-PgUGT74AE2，转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞，获得重组菌株Transetta-PgUGT74AE2。通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达，获得重组PgUGT74AE2。建立重组PgUGT74AE2催化PPT的酶促反应体系，结果表明，PgUGT74AE2能够催化PPT的C-3位羟基发生糖基化反应，生成产物3-O-β-D-glucopyranosyl-dammar-24-ene-3β，6α，12β，20S-tetraol。本研究通过酶促反应获得C-3位糖基化的新型人参三醇皂苷，可为创新药物研究提供原料。

关键词

人参 / 糖基转移酶 / 糖基化 / 原人参三醇 / 人参三醇皂苷

Abstract

收起

UDP-glycosyltransferase PgUGT74AE2 from Panax ginseng can transfer a glucose moiety to the free C-3 hydroxyl of protopanaxadiol (PPD) to produce ginsenoside Rh2. However, no report demonstrates that PgUGT74AE2 can transfer a glucose moiety to the free C-3 hydroxyl of protopanaxatriol (PPT) to produce a PPT-type ginsenoside. In this study, the expression plasmid pET-32a-PgUGT74AE2 was constructed for expression of the recombinant protein and transferred into Escherichia coli Transetta (DE3) to generate the recombinant strain Transetta-PgUGT74AE2. The recombinant enzyme PgUGT74AE2 was expressed by induction of isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG). An in vitro enzymatic reaction system was established with the recombinant enzyme PgUGT74AE2 and the substrate PPT. PgUGT74AE2 catalyzed the glycosylation of the free C-3 hydroxyl of PPT to produce 3-O-β-D-glucopyranosyl-dammar-24-ene-3β, 6α, 12β, 20S-tetraol, a new PPT-type ginsenoside. This study provides an efficient approach for the biosynthesis of a new PPT-type ginsenoside through in vitro enzymatic reaction, which may pave a way to produce promising lead in drug discovery.

Key words

Panax ginseng / glycosyltransferase / glycosylation / protopanaxatriol / protopanaxatriol-type ginsenoside

引用本文

张婷婷, 梁会超, 巩婷, 胡宗风, 顾安頔, 杨金玲, 朱平. 人参糖基转移酶PgUGT74AE2催化生成新型人参三醇皂苷研究. 药学学报, 2018 , 53 (9) : 1565 -1570 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2018-0300

Ting-ting ZHANG, Hui-chao LIANG, Ting GONG, Zong-feng HU, An-di GU, Jin-ling YANG, Ping ZHU. Studies on the enzymatic synthesis of a new PPT-type ginsenoside via UDP-glycosyltransferase PgUGT74AE2 from Panax ginseng[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2018 , 53 (9) : 1565 -1570 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2018-0300

正文

收起

人参(Panax ginseng C. A. Meyer)是一种传统的名贵中药材, 其主要活性成分是人参皂苷^[1]。药理学研究表明, 人参皂苷具有广泛的药理活性, 如抗肿瘤、抗炎、降低血糖、抗氧化及延缓衰老等^[2-6]。人参皂苷可分为两种类型:一类是达玛烷型四环三萜类皂苷; 一类是齐墩果烷型五环三萜类皂苷。达玛烷型皂苷在人参皂苷中占大多数, 是其中的主要活性成分。达玛烷型皂苷又包括二醇皂苷和三醇皂苷。大多数人参皂苷是在糖基转移酶的作用下, 由四环三萜类皂苷苷元原人参二醇(protopanaxadiol, PPD)和原人参三醇(protopanaxatriol, PPT) (图 1)糖基化而生成的。在糖基转移酶的作用下, PPD的C-3和/或C-20位羟基引入一个或几个糖基生成人参二醇皂苷; PPT的C-6和/或C-20位羟基引入一个或几个糖基生成人参三醇皂苷。糖基化修饰是人参皂苷生物合成的最后一步, 在人参皂苷的生物合成过程中起着至关重要的作用。糖基的数目、位置以及供体种类的不同造成了人参皂苷结构的多样性, 从而使人参皂苷具有多种生物活性^[7-9]。

近年来, 人参皂苷生物合成相关糖基转移酶的研究取得了较大进展。人参糖基转移酶UGTPg1能够催化PPD和PPT的C-20位羟基糖基化, 分别生成人参皂苷Compound K和F1^{[10, 11]}。糖基转移酶UGTPg45能够催化PPD的C-3位羟基发生糖基化, 生成人参皂苷Rh2;而在UGTPg29的催化作用下, Rh2的C-3位糖基的2'位羟基发生糖基化, 从而生成人参皂苷Rg3^[12]。UGTPg100能够催化PPT和人参皂苷F1的C-6位羟基发生糖基化, 分别生成人参皂苷Rh1和Rg1; UGTPg101能够催化PPT的C-20位羟基发生糖基化, 生成人参皂苷F1, 在此基础上, 能够继续催化人参皂苷F1的C-6位羟基发生糖基化, 生成人参皂苷Rg1^[11]。Jung等^[13]对糖基转移酶PgUGT74AE2进行了研究, 发现PgUGT74AE2可以催化PPD和Compound K的C-3位羟基发生糖基化, 分别生成人参皂苷Rh2和F2, 但不能催化PPT的C-3位羟基发生糖基化。

本研究构建PgUGT74AE2重组表达质粒, 将其转入大肠杆菌获得重组菌株, 经过诱导表达, 获得重组PgUGT74AE2;以PPT为底物, 建立体外酶促反应体系, 确证了重组PgUGT74AE2能够催化PPT的C-3位羟基发生糖基化, 生成一种新型三醇皂苷。

材料与方法

收起

菌株与质粒 大肠杆菌(Escherichia coli) Trans1-T1和Transetta (DE3)感受态细胞购自Transgene公司; 质粒pET-32a购自Novagen公司; 质粒pUC57-PgUGT74AE2由本实验室保存, 其中PgUGT74AE2基因序列与文献^[13]一致。

试剂与仪器 T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自New England Biolabs公司; DNA Marker和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Transgene公司; 质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司; 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)和氨苄青霉素购自INALCO公司; PPT购自南京春秋生物工程有限公司; UDP-glucose (UDPG)购自Sigma公司; 其他试剂均为国产分析纯。

3K18型低温高速离心机(Sigma公司); HZQ-Q型振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司); PCR仪(德国Eppendorf公司); 高效液相色谱仪(Agilent 1200, 安捷伦公司); DNA电泳仪(Bio-Rad公司); 凝胶成像仪(UVP公司); 恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司); 旋转蒸发仪(Re-2000, 上海亚荣生化仪器厂); 超声破碎仪(Sonic VCX130, 美国Sonics公司); 高压细胞破碎仪(APV-2000型, 德国SPX公司); HPLC-LTQ/FTICRMS (Thermo公司); INOVA-500核磁共振波谱仪(Varian公司)。

PgUGT74AE2原核表达载体的构建及异源表达 质粒pUC57-PgUGT74AE2含有目的基因PgUGT74AE2, 且两端分别含有BamH I和Sal I酶切位点, 利用BamH I和Sal I对质粒pUC57-PgUGT74AE2和载体pET-32a进行双酶切, 电泳检测, 并用凝胶回收试剂盒对目的基因PgUGT74AE2和载体pET-32a进行回收。利用T4 DNA连接酶将PgUGT74AE2连接到质粒pET-32a上, 转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞。随机挑取转化子, 以引物T7-F和T7-R进行菌落PCR筛选, 测序确证, 将重组质粒命名为pET-32a-PgUGT74AE2。将pET-32a-PgUGT74AE2和pET-32a分别转化大肠杆菌Transetta (DE3)感受态细胞, 获得重组菌株Transetta-PgUGT74AE2和对照菌株Transetta-32a。菌株在含100 μg·mL^-1氨苄青霉素的LB平板上进行培养, 37 ℃过夜。从抗性平板上挑取单菌落, 接种于10 mL LB培养基(含氨苄青霉素100 μg·mL^-1), 在37 ℃、220 r·min^-1的摇床中培养过夜, 然后按照1%接种量转接于150 mL LB培养基(含氨苄青霉素100 μg·mL^-1)培养, 在37 ℃、220 r·min^-1条件下培养至OD₆₀₀为0.6~1.0, 加入IPTG至终浓度为1 mmol·L^-1, 在16 ℃、180 r·min^-1的条件下, 诱导表达18 h。菌液以8 000 r·min^-1离心2 min, 收集菌体。用适量缓冲液(25 mmol·L^-1 Tris-HCl, pH 8.0)将菌体重悬浮, 利用超声破碎仪(超声5 s, 间隔5 s, 共40 min)将菌体进行破碎。超声后的菌液在10 000 r·min^-1、4 ℃条件下离心40 min, 收集上清液, 取20 μL进行SDS-PAGE电泳检测。

重组PgUGT74AE2的纯化 利用Ni-NTA亲和色谱对重组PgUGT74AE2进行纯化。先用10倍体积含20 mmol·L^-1咪唑的缓冲液(25 mmol·L^-1 Tris-HCl, pH 8.0)对镍柱进行平衡。将含重组蛋白的上清液用0.22 μm的滤膜过滤, 缓慢加入到镍柱中, 流速控制在0.5~1.0 mL·min^-1。依次用含20、30、40、50及200 mmol·L^-1咪唑的缓冲液(25 mmol·L^-1 Tris-HCl, pH 8.0)进行洗脱, 并对不同浓度咪唑洗脱下来的样品进行SDS-PAGE电泳检测。将重组蛋白用30 kDa超滤管进行浓缩。采用Bradford法(美国Bio-Rad公司)测定蛋白浓度。

重组PgUGT74AE2的活性检测 以UDPG为糖基供体, PPT作为糖基受体, 加入纯化的重组PgUGT74AE2, 建立酶促反应体系。100 μL反应体系如下: 0.05 mg·mL^-1 PgUGT74AE2, 10 μL; 50 mmol·L^-1底物PPT, 2 μL; 50 mmol·L^-1 UDPG, 10 μL; 缓冲液(25 mmol·L^-1 Tris-HCl, pH 8.0), 补加至体系为100 μL。将反应体系混匀, 在37 ℃条件下, 静置反应12 h, 加入200 μL甲醇终止反应。12 000 r·min^-1离心10 min, 上清液经0.22 μm滤膜过滤。利用C₁₈反相柱(4.6 mm × 150 mm, 5 μm, 日本CAPCELL PAK公司)检测反应产物。紫外检测波长为203 nm, 以水(A)和乙腈(B)为流动相。HPLC检测条件如下: 0 min, 10% B; 20 min, 55% B; 30 min, 70% B; 31 min, 100% B; 40 min, 100% B; 41 min, 10% B; 50 min, 10% B。

PgUGT74AE2催化产物的制备及结构鉴定 将通过发酵培养收集的Transetta-PgUGT74AE2菌体用适量缓冲液(25 mmol·L^-1 Tris-HCl, pH 8.0)重悬浮, 利用高压破碎仪将菌体进行破碎。破碎后的菌液在10 000 r·min^-1、4 ℃条件下离心40 min, 收集上清液作为PgUGT74AE2粗酶液。酶促反应体系如下: PgUGT74AE2粗酶液, 22 mL; 50 mmol·L^-1底物PPT, 0.5 mL; 50 mmol·L^-1 UDPG, 2.5 mL; 缓冲液(25 mmol·L^-1 Tris-HCl, pH 8.0), 25 mL。将催化体系混匀后, 在37 ℃、180 r·min^-1条件下, 震荡反应24 h, 加入100 mL甲醇终止反应。10 000 r·min^-1离心30 min, 取出上清液, 将离心沉淀用适量甲醇洗涤3次, 然后将上清液与甲醇洗涤液合并, 利用旋转蒸发仪蒸干, 用适量甲醇将化合物溶解后, 经0.22 μm滤膜过滤。利用C₁₈反相柱(10 mm × 250 mm, 5 μm, 日本CAPCELL PAK公司)对产物进行制备。紫外检测波长为203 nm, 流动相为42%乙腈。将制备的产物进行ESI-MS、¹H NMR、¹³C NMR和HMBC测定, 确定其结构。

2 结果与分析

收起

1 重组表达质粒的构建及重组蛋白的表达与纯化

将质粒pUC57-PgUGT74AE2利用BamH I和Sal I进行双酶切, 并用凝胶回收试剂盒回收长度为1 356 bp的PgUGT74AE2基因片段。利用T4 DNA连接酶将PgUGT74AE2基因连接到用BamH I和Sal I双酶切过的载体pET-32a上, 转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞。通过菌落PCR筛选阳性转化子并测序, 确证PgUGT74AE2基因正确插入。重组质粒命名为pET-32a-PgUGT74AE2。

将重组表达质粒pET-32a-PgUGT74AE2转入大肠杆菌Transetta (DE3)获得重组菌株Transetta-PgUGT74AE2。通过1 mmol·L^-1 IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测, 发现重组菌超声破碎后的上清液在55~70 kDa之间出现一条预期大小的蛋白条带, 而转入空载体pET-32a的对照菌株Transetta-32a在相应位置没有出现蛋白条带, 表明经IPTG诱导后PgUGT74AE2获得了可溶性表达(图 2A)。

通过Ni-NTA亲和色谱对重组蛋白进行纯化时, 依次用含20、30、40、50及200 mmol·L^-1咪唑的缓冲液(25 mmol·L^-1 Tris-HCl, pH 8.0)洗脱, 结果显示, 大部分PgUGT74AE2被40 mmol·L^-1咪唑洗脱下来。因此, 最终采用20 mmol·L^-1咪唑洗脱除去杂蛋白、40 mmol·L^-1咪唑洗脱目的蛋白的方法对重组PgUGT74AE2进行纯化(图 2B)。

2 重组PgUGT74AE2催化活性的检测

以PPT为底物, UDPG为糖基供体, 利用重组PgUGT74AE2进行催化反应, HPLC检测反应产物。在不含重组PgUGT74AE2的对照反应体系中, 仅检测到保留时间为23.72 min的PPT底物峰, 而在含重组PgUGT74AE2的反应体系中, 在19.48 min有明显的产物峰出现, 即化合物1, 其紫外吸收与底物PPT一致(图 3)。PPT转化率约为28%。

3 PgUGT74AE2催化产物的制备及结构鉴定

通过HPLC对PgUGT74AE2催化PPT得到的化合物1进行制备, 并利用ESI-MS、¹H NMR、¹³C NMR和HMBC进行检测。

ESI-MS检测结果显示, 化合物1的分子离子峰为661 [M+Na]⁺, 可以确定化合物1的相对分子质量为638, 比底物PPT的分子量476增加了162, 推测化合物1是在重组PgUGT74AE2催化作用下, 由PPT与一分子葡萄糖发生糖基化反应生成的产物(图 4)。

化合物1的¹H NMR和¹³C NMR数据与底物PPT非常相似, 差异在于多出一组葡萄糖基信号。¹H NMR (500 MHz, methanol-d₄) δ: 4.28 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1'), 3.30 (1H, m, H-2'), 3.35 (1H, m, H-3'), 3.24 (1H, m, H-4'), 3.17 (1H, m, H-5'), 4.00 (1H, td, J = 10.5, 3.5 Hz, H-6'), 3.52 (1H, m, H-6'); ¹³C NMR (100 MHz, methanol-d₄) δ: 107.0 (C-1'), 75.7 (C-2'), 78.3 (C-3'), 72.0 (C-4'), 77.7 (C-5'), 62.8 (C-6')。同时, 在¹³C NMR (100 MHz, methanol-d₄)谱中, C-3的化学位移向低场位移12.3 ppm, 说明化合物1的C-3位羟基发生了糖基化。通过对HMBC谱的分析: δ_H 3.10 (1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz, H-3)与δ_C 107.0 (C-1')相关, δ_H 4.28 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1')与δ_C 90.7 (C-3)相关, 进一步证明了推测的正确性。葡萄糖基的端基质子具有较大的偶合常数J = 8.0 Hz, 说明该分子葡萄糖基的构型为β型。通过以上综合分析并与文献报道数据比对^[14], 确定化合物1的结构为3-O-β-D-glucopyranosyl-dammar-24-ene-3β, 6α, 12β, 20S-tetraol (图 5)。¹H NMR (500 MHz, methanol-d₄)和¹³C NMR (100 MHz, methanol-d₄)具体数据见表 1。

讨论

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糖基化是一种在植物中广泛存在的由糖基转移酶催化的修饰反应, 通常是天然产物合成的最后一步^[15]。人参中存在多种糖基转移酶, 人参皂苷苷元的糖基化作为人参皂苷合成的最后一步, 就是由这些糖基转移酶催化完成。糖基化修饰不仅使人参皂苷的种类更加丰富, 而且糖基的种类、数目以及连接的位置等都会对人参皂苷的生物活性产生影响。例如, 在结构方面, 人参皂苷Rh2在C-3位羟基上连有一个葡萄糖基, Rb1在C-3和C-20位羟基上均连有由两个葡萄糖基组成的二糖链; 在药理活性方面, Rh2主要表现为抗肿瘤活性, 而Rb1主要对神经细胞的增长起到促进作用^[16]。Rb1和Rg1都能作用于中枢神经系统, 但是由于糖基化修饰的不同, 两者在药理活性以及作用机制上也略有不同。Rb1通过激活cAMP依赖的蛋白激酶通路刺激神经递质释放^[17], Rg1则通过蛋白激酶-Ⅱ依赖的信号通路来刺激神经递质释放^[18], 而且Rb1的作用比Rg1弱, 甚至在一些情况下会对中枢神经系统起到抑制作用^[19]。因此, 许多人参皂苷仅仅是糖基化修饰的微小差异, 就产生了不同的药理作用。

在达玛烷型皂苷中, 二醇皂苷主要在C-3和/或C-20位羟基发生糖基化, 而三醇皂苷主要在C-6和/或C-20位羟基发生糖基化。通过大肠杆菌表达的重组PgUGT74AE2能够催化PPT的C-3位羟基发生糖基化反应, 获得一种新型三醇皂苷3-O-β-D-glucopyranosyl-dammar-24-ene-3β, 6α, 12β, 20S-tetraol。Jung等^[13]研究发现PgUGT74AE2可以催化PPD和Compound K的C-3位羟基发生糖基化, 但不能催化PPT的C-3位羟基发生糖基化。上述研究结果不一致可能是反应体系的不同造成的。本研究通过重组PgUGT74AE2催化的酶促反应获得新型人参三醇皂苷, 下一步将对该皂苷进行药理活性研究, 为新药研究奠定基础。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81673341)
北京市自然科学基金资助项目(7122115)
中国医学科学院医学与健康科技创新工程经费(2016-I2M-3-012)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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2018年第53卷第9期

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文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2018-0300

接收时间：2018-04-04
首发时间：2026-01-15
出版时间：2018-09-12

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出版历史

收稿日期：2018-04-04
修回日期：2018-04-27

基金

国家自然科学基金资助项目(81673341)

北京市自然科学基金资助项目(7122115)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程经费(2016-I2M-3-012)

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室&国家卫生健康委员会天然药物生物合成重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

* 杨金玲, Tel:86-10-63165199, Fax:86-10-63165197, E-mail:yangjl@imm.ac.cn;

朱平, E-mail:zhuping@imm.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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