药学学报

SR1078激活RORα诱导卵巢癌细胞凋亡的机制研究

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程琳 ¹^,² , 侯宇 ¹^,² , 王伟章 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2018,53(1): 62-67

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药学学报 | 研究论文 2018, 53(1): 62-67

SR1078激活RORα诱导卵巢癌细胞凋亡的机制研究

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程琳¹^,², 侯宇¹^,², 王伟章¹^,²^,^*

作者信息

1.广东药科大学基础学院, 广东广州 510006

2.广东药科大学广东省生物活性药物研究重点实验室, 广东广州 510006

通讯作者:

* 王伟章, Tel/Fax: 86-20-39352617, E-mail:wwzss@163.com

Mechanism of apoptosis induced by SR1078 activating RORα in ovarian cancer cells

Lin CHENG¹^,², Yu HOU¹^,², Wei-zhang WANG¹^,²^,^*

Affiliations

1. School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China

2. Guangdong Province Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China

出版时间: 2018-01-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0814

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摘要

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本文主要探讨RORα激动剂SR1078对卵巢癌细胞的作用及其分子机制。采用MTS法检测N-[4-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-（三氟甲基）乙基]苯基]-4-（三氟甲基）苯甲酰胺（SR1078）对卵巢癌细胞HeyA8和Hey细胞活性的影响。通过流式细胞术检测SR1078对卵巢癌细胞HeyA8和Hey细胞周期和凋亡的影响。利用p53 siRNA或p53抑制剂PFT-α和PFT-β处理HeyA8和Hey细胞，流式细胞术检测干扰p53后对SR1078诱导卵巢癌细胞凋亡的影响。Western blot检测SR1078和p53 siRNA对p53蛋白表达的影响，以及p53抑制剂单独或联合SR1078对p53、p-p53及其调控的下游促凋亡蛋白Noxa表达的影响。实验结果显示，SR1078明显降低了HeyA8和Hey的细胞活性，且显著诱导HeyA8和Hey细胞凋亡；此外，SR1078能够上调p53和Noxa表达，而干扰p53能够显著抑制SR1078诱导卵巢癌细胞凋亡和Noxa的表达；综上所述，RORα激活剂SR1078通过活化p53信号通路诱导卵巢癌细胞凋亡。

关键词

维甲酸相关孤儿核受体α / N-[4-[2, 2, 2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-4-(三氟甲基)苯甲酰胺 / 卵巢癌细胞 / p53 / 细胞凋亡

Abstract

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This study was to investigate the effect of RORα activator SR1078 on ovarian cancer cells and its molecular mechanism in vitro. The survival rate of HeyA8 and Hey cells was detected by MTS assay; the apoptosis and cells cycle distribution after SR1078 treatment and the effect of p53 siRNA or PFT-α and PFT-β of p53 inhibitors on SR1078-induced apoptosis of HeyA8 or Hey cells were analyzed by flow cytometry. Western blot was used to detect the effect of SR1078 and p53 siRNA on the expression of p53 protein and the effect of p53 inhibitors alone or in combination with SR1078 on the expression of p53, p-p53 and its downstream pro-apoptotic protein Noxa. The results showed that SR1078 significantly reduced the cell viability and induced apoptosis in HeyA8 and Hey cells. In addition, SR1078 up-regulated the protein expression of p53 and Noxa, and p53 suppression led to significant inhibition of SR1078-induced apoptosis and the expression of Noxa in ovarian cancer cells. In summary, SR1078 induced apoptosis of ovarian cancer cells by activation of p53 signaling pathway.

Key words

retinoid acid receptor related orphan receptor α / N-[4-(1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoro-2-hydroxypro-pan-2-yl)phenyl]-4-(trifluoromethyl)benzamide / ovarian neoplasms / p53 / apoptosis

引用本文

程琳, 侯宇, 王伟章. SR1078激活RORα诱导卵巢癌细胞凋亡的机制研究. 药学学报, 2018 , 53 (1) : 62 -67 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0814

Lin CHENG, Yu HOU, Wei-zhang WANG. Mechanism of apoptosis induced by SR1078 activating RORα in ovarian cancer cells[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2018 , 53 (1) : 62 -67 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0814

正文

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卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一, 其发病率高, 预后差, 五年存活率不足30%, 对患者生命造成极大威胁^[1]。由于缺乏明确有效的治疗靶点及相应药物, 当前的治疗手段仍以细胞毒性药物进行化疗为主。因此, 急需探索全新的分子靶标及进行相应的药物开发。维甲酸相关孤儿核受体α (retinoid acid receptor related orphan receptor α, RORα)是一类广泛分布于机体各组织的核受体超家族成员之一, 参与调节昼夜节律、炎症与免疫反应及糖脂代谢等多种生理活动^[2-7]。由于RORα基因定位于常见的脆性区域而经常发生丢失, 因此, 普遍认为其具有抑制肿瘤的功能^[8]。尽管研究发现RORα在卵巢癌细胞系中的表达明显下调, 但其在卵巢癌中的作用迄今尚无研究报道。

N-[4-[2, 2, 2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(SR1078) (图 1)是第一个合成的RORα激动剂, 能够提高RORα的活性, 促使RORα与目的基因启动子上的ROR调控元件(ROR response element, RORE)结合, 刺激RORα目的基因的表达。因此, 本文以卵巢癌为研究对象, 通过利用SR1078处理卵巢癌细胞系实验探讨RORα在卵巢癌细胞中的作用及其调控机制, 为寻求治疗卵巢癌的临床有效药物靶点提供实验依据。

材料与方法

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试剂 SR1078 (溶于DMSO, 母液10 mmol·L^-1)购自美国MCE公司; Pifithrin-α/β(PFT-α/β)粉剂购自美国Selleck公司, 溶于DMSO; MTS购自美国Promega公司; 凋亡试剂盒购自北京四正柏公司; 二甲基亚砜(DMSO)和碘化丙啶(propidiun iodide, PI)购自美国Sigma公司; 总RNA提取试剂盒购自OMEGA公司; Takara逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司; RORα抗体购自美国GeneTex公司; GAPDH和Noxa抗体购自美国Abcom公司; p-p53、p53和β-actin抗体购自武汉博士德公司; ECL购自美国Pierce公司。

细胞培养 上皮性卵巢癌细胞HeyA8和Hey购自中国科学院上海分院细胞库^[9]。细胞培养在含有10%胎牛血清、100 μmol·L^-1青霉素和链霉素的DMEM培养基(美国Gibco公司)中, 培养条件为含5% CO₂的37 ℃培养箱。

药物处理 当HeyA8和Hey细胞贴壁长至培养瓶底部80%即处于对数生长期时, 将细胞消化后按一定浓度接种到孔板中, 待帖壁长至70%~80%时去除旧培养基, 予以分组加入不同浓度的SR1078进行处理。

实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测

细胞总RNA提取用1×PBS溶液洗涤细胞2次后, 将RNAiso plus液1 mL加入6孔板中, 充分吹打混匀, 收集。加入氯仿200 μL, 涡旋混匀, 冰上孵育10 min。12 000 r·min^-1, 4 ℃下离心15 min, 取上清液, 加入1/3体积的乙醇, 涡旋混匀, 将上清液转至2 mL RNeasy Mini spin column, 吸附柱置于2 mL column中, 室温, 1 000×g离心1 min。依次加入300 μL和400 μL wash buffer 1以及500 μL wash buffer 2至column, 清洗RNA沉淀, 室温, 1 000 ×g离心1 min。加入30 μL无菌DEPC水于吸附柱的薄膜上, 放置2 min, 室温, 最高转速离心1 min, 将RNA洗脱下来。核酸蛋白分析仪检测RNA浓度及纯度, OD260/280 = 1.8~2.1, 表明提取的RNA纯度较高。1%琼脂糖凝胶电泳图显示两个条带且条带亮度28S: 18S = 2: 1, 无弥散, 表明提取的RNA纯度高且无降解。

RNA逆转录成cDNA 按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。引物设计引物由Invitrogen公司设计合成, h-RORαF:5'-AAGCAATGCCACCTACTCCT-3'; R:5'-CAGCATCTCGAGACATCCCT-3'。

Q-PCR反应反应体系20 μL, SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL, 去离子水6.4 μL, 上下游引物各0.8 μL, 模板cDNA 2 μL。两步法反应过程如下: 95 ℃预变性30 s, 进入循环, 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火和延伸50 s, 循环次数40次。以GAPDH作为内参, 将所得Ct值按照2^-ΔΔCt的方法进行处理。

Western blot检测 SR1078 (终浓度为5.0和10 μmol·L^-1)处理HeyA8和Hey细胞48 h后, 收集细胞并提取蛋白。样品经SDS-PAGE电泳分离, 湿电转移至硝酸纤维素膜, 膜在室温下用封闭液封闭2 h, 加入5% BSA稀释的GAPDH抗体(1: 8 000)、RORα (1: 1 000)、p-p53和Noxa抗体(1: 2 000)、p53和β-actin抗体(1: 400), 4 ℃过夜, 洗膜3次, 加入封闭液稀释的二抗稀释液(1: 2 000), 室温1 h。用ECL solution显色, 最后进行显影, 定影。用Bankscan软件进行灰度分析, 分析目标基因的表达水平时用GAPDH和β-actin为内源对照。

MTS检测 用0.25%胰酶消化处于对数生长期的HeyA8和Hey细胞并接种于96孔培养板, 每孔加入2×10³个细胞, 培养液100 μL, 每组设3个复孔。共分4组, 分别以终浓度为1.25、2.5、5.0和10 μmol·L^-1 SR1078处理为实验组, 加入等体积的DMSO作为阴性对照, 36和72 h后, 每孔加入MTS 20 μL, 37 ℃孵育1~2 h。490 nm测定吸收度(A)值的变化并计算细胞存活率。细胞存活率(%) = (A_实验组–A_空白组/A_对照组–A_空白组) × 100%。

细胞周期和凋亡检测

流式细胞仪检测细胞周期 SR1078 (终浓度5.0和10 μmol·L^-1)处理HeyA8和Hey细胞, 以DMSO处理组为阴性对照组, 72 h后收集细胞。加入预冷的70%乙醇进行固定, -20 ℃过夜。离心去上清, 用PBS润洗2次。PBS 100 μL重悬细胞并加入RNA酶2 μL, 于37 ℃孵育15 min, 再以PBS润洗并以100 μL重悬, 加入PI 5 μL混匀, 避光, 室温孵育5 min, 上机检测前加入PBS调整细胞数为每毫升1×10⁶个, 混匀。

流式细胞仪检测细胞凋亡凋亡检测的实验分组同检测周期, 72 h后收集细胞, PBS润洗2次, 离心去上清, 加入1×binding buffer 100 μL重悬, 再加入Alexa Flour 647 Annexin-Ⅴ试剂4 μL, 混匀, 室温避光孵育10 min。再加入PI 7 μL, 最后加入1×binding buffer 200 μL调整细胞数为每毫升1×10⁶, 上机检测。

p53 RNAi实验 p53 siRNA由广州锐博生物科技有限公司合成, 序列如下: si-h-TP53-001, GACTC CAGTGGTAATCTAC; si-h-TP53-002, GTAATCTA CTGGGACGGAA。取HeyA8和Hey细胞以每毫升1×10⁵个接种于12孔板, 加入含10% FBS的DMEM培养基至800 μL体积。将siRNA (siRNA 1+2, 终浓度100 nmol·L^-1, 100 μL)稀释于opti-MEM 100 μL中, 轻轻混匀; 另外, 将lipofectamine RNAi MAX 2 μL稀释于opti-MEM 100 μL中, 室温放置5 min后将两种稀释液混合, 轻轻混匀室温孵育20 min后, 将lipofectamine RNAi MAX/siRNA混合液加入培养孔中, 混合后培养箱中培养48 h, 补加10% FBS的DMEM培养基至1 mL, 加入终浓度为10 μmol·L^-1 SR1078处理细胞72 h后, 检测细胞凋亡。

PFT-α和PFT-β抑制实验 将PFT-α和PFT-β溶于DMSO, 配制为50 mmol·L^-1工作液。取HeyA8和Hey细胞以每毫升2×10⁵个接种于6孔板, 加入含10% FBS DMEM培养基2 mL。将PFT-α和PFT-β工作液分别稀释到10和25 mmol·L^-1, 加入培养孔中, 至终浓度分别为10和25 μmol·L^-1, 处理细胞5 h后, 加入终浓度为10 μmol·L^-1 SR1078, 混匀后培养箱中培养72 h。

统计学分析 使用Graphpad Prism 5软件进行数据分析, 数据用$\overline{x}±s$表示。组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行t检验。

结果

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1 MTS比色法检测SR1078对HeyA8和Hey细胞活性的影响

Q-PCR和Western blot检测结果显示, HeyA8和Hey细胞中均表达RORα mRNA和蛋白(图 2A, B), 且Hey细胞的RORα蛋白表达水平高于HeyA8细胞。

细胞增殖实验结果显示, SR1078呈时间及剂量依赖性抑制Hey (图 3A)和HeyA8 (图 3B)的细胞活性。5.0和10 μmol·L^-1 SR1078分别处理细胞36和72 h后, 细胞活性显著下降(P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001)。这些结果提示, RORα激活剂SR1078能有效抑制卵巢癌细胞HeyA8和Hey的细胞活性。

2 SR1078对HeyA8和Hey细胞周期和凋亡及p53蛋白表达的影响

流式细胞术检测结果显示, 5.0 μmol·L^-1 SR1078对HeyA8和Hey细胞凋亡有一定的促进作用, 而处理浓度为10 μmol·L^-1时能够诱导细胞发生显著的凋亡(图 4A, P < 0.01)。细胞周期检测结果显示(图 4B), 10 μmol·L^-1 SR1078明显引起HeyA8细胞发生G₀/G₁周期阻滞, 而对Hey细胞的周期分布并无明显影响。

Western blot结果显示, 不同浓度SR1078处理HeyA8和Hey细胞48 h后, p53的表达上调(图 4C)。

3 p53在SR1078诱导卵巢癌细胞HeyA8和Hey凋亡中的作用

为验证p53在SR1078诱导卵巢癌细胞凋亡中的作用, 采用p53抑制剂PFT-α和PFT-β抑制p53活性后观察对SR1078诱导HeyA8和Hey细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测结果显示, 10 μmol·L^-1SR1078诱导细胞发生显著的凋亡(P < 0.001), 而抑制p53后SR1078诱导的细胞凋亡明显减少, 尤其PFT-β (25 μmol·L^-1)的作用更为显著(图 5A, P < 0.001)。

另外, 为进一步验证p53的作用, 采用RNAi的方法抑制p53表达, 观察对SR1078诱导细胞凋亡的影响。Western blot结果显示(图 5B), 针对p53的siRNA可以明显降低Hey细胞中p53蛋白的表达。流式细胞术检测结果显示(图 5C), 10 μmol·L^-1SR1078能够明显诱导Hey细胞凋亡(P < 0.001), 抑制p53表达后SR1078诱导的细胞凋亡显著降低(P < 0.01)。

同时, 为了研究p53介导SR1078诱导细胞凋亡的分子机制, Western blot检测SR1078、PFT-α和PFT-β单独或联合作用对p53及其调控的促凋亡蛋白表达的影响。结果显示, SR1078处理Hey细胞后p53、p-p53及Noxa蛋白的表达水平明显上调, 而抑制p53后明显地抑制SR1078对这些蛋白的促进作用(图 6)。

讨论

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肿瘤的发生和发展往往与抑癌基因突变或失活密切相关, 靶向肿瘤形成与恶化过程中发生变化的基因治疗肿瘤成为一种可能。研究已经发现, RORα在多种肿瘤中表达下调或失活, 过表达RORα能够抑制乳腺癌细胞的生长和侵袭, 并促进胃癌细胞凋亡^{[8, 10-12]}。同样, RORα激活剂激活RORα也能够抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭, 并且通过调节糖代谢阻止肝癌细胞的生长及诱导肝癌细胞凋亡^[13-15]。这些结果说明, 恢复RORα基因的表达或激活其蛋白活性可以起到抗癌的作用。在本研究中, RORα激动剂SR1078通过激活RORα显著降低卵巢癌HeyA8和Hey细胞活性和诱导其发生细胞凋亡, 提示RORα具有成为卵巢癌治疗药物靶点的潜能。

早期文献^{[2, 16]}报道, RORα作为一种转录调节因子, 通常以经典方式与靶基因启动子上的RORE结合, 调节目的基因及其下游基因的表达而发挥作用。在乳腺癌中, RORα可以直接转录调节SEMA3F (transcription regulator of semaphorin 3F)基因的表达抑制乳腺癌细胞的增殖与侵袭^[11]。另一方面, RORα也能够通过非转录激活作用发挥功能。如RORα在结肠癌中通过与β-catenin蛋白的相互结合而抑制Wnt/β-catenin信号通路, 调节细胞增殖和肿瘤进展^[17]。此外, p53通路是机体应对DNA损伤的天然防护屏障, 研究发现, DNA损伤可诱导RORα活化, 进而抑制p53蛋白的泛素化而增强p53稳定性, 最终激活p53的转录活性, 促进肿瘤细胞凋亡^{[18, 19]}。有意思的是, RORα的人工合成配体SR1078同样能够通过活化RORα增强p53蛋白稳定性而诱导肝癌细胞发生凋亡^{[13, 20]}。在本研究中, RORα激活剂SR1078处理卵巢癌细胞后, p53及其下游调控的促进凋亡蛋白Noxa同样明显增多, 而p53抑制剂和p53 siRNA均能显著削弱其作用, 表明p53是介导SR1078诱导卵巢癌细胞凋亡的关键分子。由于p53在抑制肿瘤形成过程中发挥着至关重要的作用, SR0178能够增强p53蛋白稳定性的结果提示RORα小分子激动剂将是一种潜在肿瘤治疗策略^[21]。需要指出的是, 虽然p53 siRNA同样能够显著抑制SR1078的作用, 但是其抑制效果却明显低于p53抑制剂PFT-β (图 5C), 这与p53 siRNA并不能完全抑制p53蛋白的表达所造成的(图 5B)。

综上, RORα激活剂SR1078通过激活p53信号通路诱导细胞凋亡发挥抗卵巢癌的作用。由于晚期卵巢癌易发生转移及产生耐药, 因此, 深入研究SR1078对卵巢癌细胞转移和药物敏感性方面的影响及相关机制, 必将有助于进一步将RORα开发成为卵巢癌治疗药物新靶点。

基金

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广东省自然科学基金资助项目(2014A030313580)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2018年第53卷第1期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0814

接收时间：2017-08-20
首发时间：2026-01-15
出版时间：2018-01-12

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收稿日期：2017-08-20
修回日期：2017-09-18

基金

广东省自然科学基金资助项目(2014A030313580)

作者信息

1.广东药科大学基础学院, 广东广州 510006

2.广东药科大学广东省生物活性药物研究重点实验室, 广东广州 510006

通讯作者:

* 王伟章, Tel/Fax: 86-20-39352617, E-mail:wwzss@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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