药学学报

Antigen	Fluorochrome	Clone	Isotype	Source
HLA-DR	APC-eFlour 780	LN3	Mouse IgG2b, κ	eBioscience
CD123	PerCP-Cy5.5	6H6	Mouse IgG1, κ	eBioscience
CD86	PE	IT2.2	Mouse IgG2b, κ	eBioscience
Lineage	FITC	-	Mouse	eBioscience

Antigen	Fluorochrome	Clone	Isotype	Source
HLA-DR	APC-eFlour 780	LN3	Mouse IgG2b, κ	eBioscience
CD123	PerCP-Cy5.5	6H6	Mouse IgG1, κ	eBioscience
CD86	PE	IT2.2	Mouse IgG2b, κ	eBioscience
Lineage	FITC	-	Mouse	eBioscience

Name	GenBank	Primer sequence (5'-3')
GAPDH	M33197	5'-GCTTCGCTCTCTGCTCCTCCTGTT-3' (F)
		5'-ACGACCAAATCCGTTGACTCCGACC-3' (R)
IFN-α	NM_000605	5'-GATACTCCTGGCACAAATGGG-3' (F)
		5'-GCTTGAGCCTTCTGGAACTGG-3' (R)
IFN-β	M25460	5'-CCAACAAGTGTCTCCTCCAAAT-3' (F)
		5'-AATCTCCTCAGGGATGTCAAAG-3' (R)

Name	GenBank	Primer sequence (5'-3')
GAPDH	M33197	5'-GCTTCGCTCTCTGCTCCTCCTGTT-3' (F)
		5'-ACGACCAAATCCGTTGACTCCGACC-3' (R)
IFN-α	NM_000605	5'-GATACTCCTGGCACAAATGGG-3' (F)
		5'-GCTTGAGCCTTCTGGAACTGG-3' (R)
IFN-β	M25460	5'-CCAACAAGTGTCTCCTCCAAAT-3' (F)
		5'-AATCTCCTCAGGGATGTCAAAG-3' (R)

氯喹联合用药体外抗HIV-1作用研究

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向思颖 ¹^,² , 陈敏 ²^,³ , 陈欢 ²^,³ , 罗荣华 ² , 杨柳萌 ² , 卿晨 ¹ , 郑永唐 ²^,^*

药学学报 | 研究论文·药理学 2018,53(2): 227-235

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药学学报 | 研究论文·药理学 2018, 53(2): 227-235

氯喹联合用药体外抗HIV-1作用研究

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向思颖¹^,², 陈敏²^,³, 陈欢²^,³, 罗荣华², 杨柳萌², 卿晨¹, 郑永唐²^,^*

作者信息

1.昆明医科大学药学院, 云南省天然药物药理重点实验室, 云南昆明 650500

2.中国科学院昆明动物研究所, 云南省活性多肽研究与利用重点实验室/中国科学院动物模型与人类疾病机理重点实验室, 云南昆明 650223

3.中国科学院大学, 北京 100039

通讯作者:

* 郑永唐, Tel/Fax:86-871-5195684, E-mail:zhengyt@mail.kiz.ac.cn

The combined anti-HIV-1 effect of chloroquine and antiretroviral drugs in vitro

Si-ying XIANG¹^,², Min CHEN²^,³, Huan CHEN²^,³, Rong-hua LUO², Liu-meng YANG², Chen QING¹, Yong-tang ZHENG²^,^*

Affiliations

1. School of Pharmaceutical Science and Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products, Kunming Medical University, Kunming 650500, China

2. Key Laboratory of Bioactive Peptides of Yunnan Province/Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms of Chinese Academy of Sciences, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China

3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China

出版时间: 2018-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0853

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摘要

收起

本文评价氯喹与已上市抗HIV药物联合使用的体外抗HIV-1作用和抑制TLR7激动剂引起的浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）活化及Ⅰ型干扰素分泌上调的作用。采用MTT法检测氯喹对C8166、TZM-bl、PBMC细胞的毒性。采用荧光素酶活性检测方法、ELISA检测p24抗原测定氯喹分别与雷特格韦（rategrivir，RAL）、恩夫韦肽（enfuvirtide，T-20）、茚地那韦（indinavir，IDV）和依法韦仑（efavirenz，EFV）联合用药抗HIV-1_ⅢB、HIV-1_KM018活性。流式细胞术检测氯喹分别与RAL、IDV联合使用对细胞pDC活化水平的影响。定量PCR检测氯喹分别与RAL、IDV联合使用对细胞内IFN-α、IFN-β mRNA水平上调的影响。结果表明，氯喹对C8166、TZM-bl和PBMC细胞表现出较低的细胞毒性，半数细胞毒浓度（median cytotoxic concentration，CC₅₀）分别为85.02 ±0.28、73.67 ±5.10和91.84 ±4.10 μmol·L^-1。氯喹分别与RAL、T-20、IDV、EFV联合用药呈中度协同、强协同、相加、中度拮抗效果。氯喹分别与RAL、IDV的联合使用相比于氯喹单药使用对pDC活化水平和IFN-α、IFN-β mRNA表达水平的下调作用无统计学差异。本研究发现氯喹与不同类型的已上市抗HIV药物联合使用呈现不同程度的协同、拮抗或相加抗HIV-1作用。氯喹分别与RAL、IDV联合使用不影响氯喹对TLR7激动剂引起的pDC活化和Ⅰ型干扰素分泌上调的抑制作用。本研究希望能够给氯喹应用于抗HIV治疗提供参考，促进氯喹更广泛地应用于临床研究和治疗中。

关键词

氯喹 / 人类免疫缺陷病毒-1 / 联合用药 / 浆细胞样树突状细胞活化

Abstract

收起

The study is aimed to evaluate the anti-HIV-1 effect of chloroquine in combination with antihuman immunodeficiency virus (HIV) drugs, and inhibition of plasmacytoid dendritic cells (pDC) activation and type Ⅰ interferon (IFN-I) production by Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist stimulation. We investigated the anti-HIV-1_ⅢB, HIV-1_KM018 activity of chloroquine and chloroquine combined with rategrivir (RAL), enfuvirtide (T-20), indinavir (IDV) and efavirenz (EFV) in vitro by luciferase activity assay system and ELISA method for p24 antigen. We measured the effect of chloroquine on the activation of pDC in combination with RAL and IDV, respectively. Quantitative PCR was used to evaluate the activity of chloroquine in combination with RAL and IDV in the upregulation of interferon (IFN)-α and IFN-β. Chloroquine showed less cytotoxicity to C8166, TZM-bl and PBMC cells, and the 50% cytotoxic concentration values were 85.02 ±0.28, 73.67 ±5.10 and 91.84 ±4.10 μmol·L^-1, respectively. The anti-HIV-1_ⅢB activity of chloroquine combination with RAL, T-20, IDV and EFV were moderate in synergy, strong in synergy, additive and moderate antagonism, respectively. The anti-HIV-1_KM018 activity of chloroquine in combination with RAL, IDV were moderate synergy, minor synergy. There was no significant difference between the chloroquine monotherapy and chloroquine combined with RAL, IDV in the down-regulation of pDC activation and IFN-α, IFN-β expression levels. We have found that chloroquine combined with different anti-HIV drugs represent different degrees of synergism, antagonism or additive anti-HIV-1 effect. Chloroquine in combination with RAL and IDV did not have influence on the inhibitory effect of chloroquine on pDC activation and type Ⅰ interferon secretion induced by TLR7 agonist. The results suggest that chloroquine may be used to enhance the therapeutic activities of anti-HIV medicines.

Key words

chloroquine / human immunodeficiency virus-1 / combination therapy / plasmacytoid dendritic cells activation

引用本文

向思颖, 陈敏, 陈欢, 罗荣华, 杨柳萌, 卿晨, 郑永唐. 氯喹联合用药体外抗HIV-1作用研究. 药学学报, 2018 , 53 (2) : 227 -235 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0853

Si-ying XIANG, Min CHEN, Huan CHEN, Rong-hua LUO, Liu-meng YANG, Chen QING, Yong-tang ZHENG. The combined anti-HIV-1 effect of chloroquine and antiretroviral drugs in vitro[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2018 , 53 (2) : 227 -235 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0853

正文

收起

艾滋病, 即获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS), 是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的感染引起患者自身免疫缺陷, 进而诱发机会性感染和多种癌症的严重疾病^[1]。30多年来, 艾滋病持续在全球范围内蔓延, 全球大约累计有3 670万HIV感染者。截至2017年4月底, 我国累计报告HIV感染者/AIDS患者916 198例, 其中报告死亡216 727例^[2], 艾滋病已经成为严重危害公共健康的重大问题。

联合抗逆转录病毒疗法(combined antiretroviral therapy, cART)即多种抗病毒药物联合用药治疗HIV/AIDS。cART的使用有效地降低了HIV/AIDS的发病率和死亡率, 提高了患者的生存质量和延长了寿命。由于耐药毒株的产生和无法清除病毒, HIV/AIDS依然无法完全治愈^[3], 寻找和现有药物作用机制不同的抗HIV药物应用于cART有重要临床意义。抗疟疾药物氯喹(chloroquine, CQ)被发现具有一定的抗HIV活性, 其抗病毒机制不同于目前上市的抗HIV药物^[4]。

HIV-1包膜糖蛋白gp120糖基化位点可藏匿病毒表位, 帮助病毒逃逸宿主免疫监视^{[5, 6]}, 氯喹通过改变gp120糖基化位点构象, 使得病毒糖基化异常, 降低新生病毒的感染能力, 抑制病毒复制^[7]。氯喹还具有抑制HIV-1通过Toll样受体7 (Toll-like receptor 7, TLR7)通路引起的浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells, pDC)活化及Ⅰ型干扰素分泌上调的作用, 可抑制免疫活化, 减缓AIDS疾病进程^[8-10]。本研究在体外对氯喹与各靶点抗HIV药物联合用药药效学进行了评价, 并进一步检测氯喹与HIV整合酶抑制剂雷特格韦(rategrivir, RAL)、蛋白酶抑制剂茚地那韦(indinavir, IDV)联合用药是否影响其对TLR7通路的抑制作用, 旨在寻求氯喹联合用药抗HIV治疗方案。

材料与方法

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试剂噻唑蓝[3, (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazoliumbromide, MTT]、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)、Triton X-100、青霉素(penicillin)、谷氨酰胺(glutamine)、胰蛋白酶、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、二甲基亚砜(DMSO)、PHA-P、抗IgG Fc抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司; N, N-二甲基甲酰胺(N, N'-dimethyl formamine, DMF)、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇购自四川西陇化工有限公司; 雷西莫特(resiquimod, R848)为大连美仑生物技术有限公司产品; 胎牛血清(FBS)、RPMI-1640、DMEM购自Gibco公司; 白细胞介素-2 (IL-2)为山东泉港生物科技有限公司产品; 抗HIV p24单克隆抗体和兔抗HIV-1 p24多克隆抗体由本实验室制备; 焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate, DEPC)、TRIzol^® reagent (Ambion, Life Technologies)、PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR^®Premix Ex Taq^TMⅡ (Ti RNaseH Plus) Kit购自宝生物工程(大连)有限公司。

药物 CQ、齐多夫定(zidovudine, AZT)购自Sigma公司; 恩夫韦肽(enfuvirtide, T-20)为Roche公司产品; RAL购自北京汇康博源医药科技有限公司; IDV购自GlaxoSmithKline公司; 依法韦仑(efavirenz, EFV)购自United States Pharmacopoeia公司。CQ、AZT和T-20溶解于完全培养基中, 0.22 μm滤膜过滤除菌, 分装后置于-20 ℃保存; RAL和IDV溶解于DMSO中, 4 ℃保存。

细胞与病毒 TZM-bl细胞、HIV-1实验株HIV-1_ⅢB由英国MRC AIDS Reagent Project惠赠; C8166细胞来自于美国国立卫生研究院; PBMC由健康献血者浓缩白细胞分离获得。HIV-1临床分离株HIV-1_KM018从云南省AIDS患者体内分离培养获得^[11]。所有细胞使用含10% FBS的RPMI-1640完全培养基, 37 ℃、5% CO₂培养。

氯喹对C8166、TZM-bl、PBMC细胞毒性实验 将细胞浓度为每毫升4×10⁵个C8166细胞悬液、2×10⁵个TZM-bl细胞悬液、5×10⁶个PHA-P刺激转化的PBMC细胞悬液100 μL分别与倍比稀释的氯喹溶液100 μL在96孔细胞培养板内混合, 每个浓度设3个重复孔, 同时设置不含化合物的阴性对照孔和只添加细胞培养液的空白对照孔; 37 ℃、5% CO₂培养箱培养。C8166细胞培养72 h, TZM-bl细胞培养48 h, PBMC培养4天后每孔补添含有IL-2 (终浓度50 U·mL^-1)的RPMI-1640完全细胞培养基100 μL继续培养3天, 加入MTT溶液20 μL (PBMC加入30 μL), 37 ℃、5% CO₂孵育4 h, 每孔弃100 μL上清, 加入SDS-DMF溶液100 μL, 37 ℃过夜。ELx800 ELISA酶标仪测定OD值, 测定波长为570 nm, 参考波长630 nm。计算得到CC₅₀值(50% cytotoxic concentration), 即对50%的细胞产生毒性时的化合物浓度。

氯喹联合用药对HIV-1_ⅢB急性感染C8166细胞中病毒复制的抑制实验 将氯喹、IDV分别进行2倍浓度递度稀释, 氯喹共7个浓度, IDV共6个浓度。起始浓度分别为48.24 μmol·L^-1、58.24 nmol·L^-1。按药物浓度从高到低分别吸取不同浓度的氯喹50 μL, 分别加入96孔细胞培养板的9-3列, 第2列加入RPMI-1640新鲜完全培养基50 μL。按浓度高到低分别吸取不同浓度的IDV分别加入96孔板第A~F行, 第G行加入RPMI-1640新鲜完全培养基50 μL。设置不加药物的病毒对照和只添加培养基的空白对照, 10 μmol·L^-1 AZT为阳性对照。

将细胞浓度为每毫升4×10⁵个C8166细胞与HIV-1_ⅢB (MOI = 0.04)在37 ℃下感染2 h, 用PBS离心洗涤3次后取100 μL细胞接种到含有100 μL药物的96孔板上, 37 ℃、5% CO₂培养72 h。培养上清离心后收集, 用终浓度0.5% Triton X-100裂解灭活, 采用捕捉p24抗原ELISA方法检测药物对HIV-1_ⅢB复制的抑制作用, 计算p24表达抑制率^{[12, 13]}。

氯喹联合用药对HIV-1_ⅢB在TZM-bl细胞中病毒复制的抑制实验 将氯喹、RAL、T-20和EFV分别进行2倍浓度递度稀释, 氯喹共7个浓度, RAL、T-20和EFV共6个浓度。起始浓度分别为34.612 μmol·L^-1、1.472 nmol·L^-1、13.928 nmol·L^-1和0.724 nmol·L^-1。按药物浓度从高到低分别吸取不同浓度的氯喹50 μL, 分别加入96孔细胞培养板的9-3列, 第2列加入DMEM新鲜培养基50 μL。按浓度高到低吸取不同浓度的RAL、T-20或EFV分别加入96孔板第A~F行, 第G行加入DMEM新鲜培养基50 μL。设置病毒阳性对照和空白对照, AZT为阳性对照。

TZM-bl细胞携带有荧光素酶报告基因, 该报告基因受HIV-1 Tat元件调控, 只有在HIV-1 Tat蛋白存在的情况下才能有效表达。利用HIV-1病毒感染该细胞后, 表达Tat蛋白, 从而上调荧光素酶基因表达, 继而通过检测荧光素酶的表达情况以判断HIV-1的感染与复制效率。使用HIV-1_ⅢB (MOI = 0.04)感染的TZM-bl细胞(细胞浓度为每毫升2×10⁵个), 并将其接种到含有药物的96孔培养板上, 37 ℃、5% CO₂培养48 h后PBS洗涤2次, 每孔加入细胞裂解液80 μL, 4 ℃裂解1 h。将配好的荧光素酶底物与细胞裂解液以1:1的比例在96孔白板中混合后, 在全功能连续波长扫描微孔板分析系统上检测相对荧光单位(RLU), 计算荧光素酶表达抑制率。

氯喹联合用药对临床分离株HIV-1_KM018在PBMC中复制的抑制实验 将氯喹、RAL、IDV分别进行2倍浓度递度稀释, 氯喹共6个浓度, RAL、IDV共5个浓度。起始浓度分别为27.4 μmol·L^-1、2.98 nmol·L^-1、36.36 nmol·L^-1。按药物浓度从高到低分别吸取不同浓度的氯喹50 μL, 分别加入96孔细胞培养板的8-3列, 第2列加入RPMI-1640新鲜完全培养基50 μL。按浓度高到低吸取不同浓度的IDV分别加入96孔板第A~E行, 第F行加入RPMI-1640新鲜完全培养基50 μL。设置病毒对照和空白对照, AZT为阳性对照。

收集PHA刺激72 h的PBMC, 用含有IL-2的1640完全培养基重悬细胞, 调细胞浓度为每毫升5×10⁶个, 加入HIV-1_KM018 (MOI = 0.06), 37 ℃感染4 h后, PBS离心洗涤3次。每孔滴加细胞悬液100 μL至含有100 μL不同浓度氯喹的96孔板中。37 ℃、5% CO₂培养箱培养96 h后, 每孔补加含有IL-2的细胞培养基100 μL, 继续培养72 h后, 收集培养上清, 用Triton X-100裂解灭活。采用捕捉p24抗原ELISA方法, 计算药物对HIV-1_KM018在PBMC中复制表达p24抗原的抑制率^{[11, 14]}。

联合用药实验数据分析 Bliss independence和Loewe additivity为目前主要使用的两种药物联合使用评价模型, 评价药物相互作用的方法都基于这两种模型。本研究采用MacSynergy Ⅱ程序对联合用药的实验数据进行分析, 评价两种药联合使用呈现的相互作用。MacSynergy Ⅱ程序计算是基于Bliss Independence模型定义的理论药物累积作用^[15]。MacSynergy Ⅱ程序通过各药物单独的剂量效应曲线计算得出药物的累积平面, 即理论药物累积作用, 然后从联合实验所得的剂量-效应累积平面中减去理论累计平面, 获得非累积效应活性区域, 实验剂量效应累积平面的95%可信区间用于统计学上的数据评价, 如果累积平面为水平面, 则为相加作用, 累积平面上出现峰为协同作用, 平面下出现谷为拮抗作用。协同/拮抗图中的峰/谷单位为浓度×浓度×百分比[(nmol·L^-1)²%], 峰/谷的大小是对协同/拮抗作用的定量检测。MacSynergy Ⅱ程序计算出每组联合用药的正值(协同作用)或负值(拮抗作用), 正值总和为协同作用大小, 负值总和为拮抗作用大小, 轻度协同作用定义为药物联合作用时产生的协同量25~50 [(nmol·L^-1)²%]。中度协同和高度协同活性分别定义为产生50~100 [(nmol·L^-1)²%]和 > 100 [(nmol·L^-1)²%]的协同量。药物相加作用定义为协同量在-25~25 [(nmol·L^-1)²%]之间, 轻度拮抗、中度拮抗和高度拮抗作用则被认为是协同量分别在-25~-50 [(nmol·L^-1)²%]、-50~-100 [(nmol·L^-1)²%]以及 < -100 [(nmol·L^-1)²%]^[16], 整合3次重复实验的抗病毒协同数据(95%置信区间), 计算联合用药的平均值。

氯喹联合用药对TLR7刺激剂活化pDC的影响 将浓度为每毫升2×10⁶个的PBMC接种于24孔板上, 设置对照组、TLR7刺激剂R848刺激组、R848+氯喹(110 μmol·L^-1)刺激组、R848+RAL (1.4 μmol·L^-1)刺激组、R848+氯喹联合RAL刺激组、R848+IDV (3.525 μmol·L^-1)刺激组和R848+氯喹联合IDV刺激组。37 ℃、5% CO₂培养20 h, 离心, DPBS-BSA重悬, 抗体混合液染色(所用抗体如表 1), 冰上孵育30 min, 染色缓冲液洗涤, 离心弃上清, 加入染色缓冲液重悬, 用流式细胞仪检测pDC活化情况。

氯喹联合用药对TLR7刺激剂引起的IFN-α、IFN-β表达的影响 将浓度为每毫升2×10⁶个PBMC接种于24孔板上, 设置对照组、TLR7刺激剂R848刺激组、R848+氯喹(10 μmol·L^-1)刺激组、R848+ RAL (0.7 μmol·L^-1)刺激组、R848+氯喹联合RAL刺激组、R848+IDV (1.762 5 μmol·L^-1)刺激组和R848+氯喹联合IDV刺激组。37 ℃、5% CO₂培养6 h。收集各组细胞, 提取细胞的总RNA, 然后使用实时荧光定量PCR检测不同处理组PBMC中IFN-α、IFN-β mRNA表达水平, 引物序列见表 2。由软件Primer Premier 5.0设计, 实验操作严格按照试剂盒说明书进行, 实验数据以GAPDH作为内参, 采用的2^-ΔΔCt计算方法^[17], 计算IFN-α、IFN-β的相对表达量。

统计学处理 使用非配对t检验统计各组数据差异, P < 0.05被认为具有统计学意义, 所用统计方法通过GraphPad Prism 5进行计算分析。

结果

收起

1 氯喹对细胞的毒性作用

本研究使用MTT比色法测定氯喹对C8166、TZM-bl和PBMC细胞的毒性作用。氯喹对C8166的CC₅₀值为85.02 ± 0.28 μmol·L^-1 (图 1A), 表明氯喹对C8166细胞具有一定的细胞毒性, 阳性药物AZT对C8166细胞毒性极小, 其CC₅₀值为5.3 ± 0.09 mmol·L^-1(图 1B); 氯喹对TZM-bl细胞的CC₅₀值为73.67 ± 5.1 μmol·L^-1 (图 1C), 表明其对TZM-bl细胞也表现出了一定的细胞毒性。AZT的CC₅₀值为2.62 ± 0.31 mmol·L^-1 (图 1D), 对TZM-bl细胞毒性很小; 图 1E是氯喹对PMBC的细胞毒性实验图, 其CC₅₀值为91.84 ± 4.1 μmol·L^-1, 表明氯喹对PBMC有一定的细胞毒性, AZT的CC₅₀值为1.09 ± 0.03 mmol·L^-1(图 1F), 对PBMC毒性很小。结果表明氯喹对不同的细胞表现出不同的细胞毒性, 且细胞存活率与药物浓度呈剂量依赖关系。

2 氯喹联合用药抗HIV-1作用

2.1 氯喹联合用药的抗HIV-1_ⅢB作用

氯喹与整合酶抑制剂RAL联合用药的协同/拮抗容积量为99.24 ± 19.33/0 ± 0 [(nmol·L^-1)²%], 表现出中度协同作用, 2.163 μmol·L^-1氯喹与0.046 nmol·L^-1 RAL联合使用时协同作用最强(图 2A)。氯喹与进入抑制剂T-20联合用药的协同/拮抗容积量为104.72 ± 17.83/-10.13 ± 7.55 [(nmol·L^-1)²%], 表现出强协同作用(图 2B), 1.082 μmol·L^-1氯喹与6.96 nmol·L^-1 T-20联合用药时呈现出最强的协同作用。氯喹与蛋白酶抑制剂联合用药的协同/拮抗容积量为24.74 ± 1.29/-6.115 ± 0.13 [(nmol·L^-1)²%], 呈现出相加作用, 当氯喹浓度为1.508 μmol·L^-1, IDV浓度为1.82 nmol·L^-1时, 联合用药效果最佳(图 2C)。氯喹与非核苷类逆转录酶抑制剂EFV联合用药的协同/拮抗容积量为0.495 ± 0.7/-63.4 ± 19.94 [(nmol·L^-1)²%], 显示出中度拮抗作用, 2.163 μmol·L^-1氯喹与0.090 5 nmol·L^-1 EFV联合用药时拮抗作用最强(图 2D)。

结果表明, 氯喹分别与RAL、T-20、IDV、EFV联合使用在体外具有中度协同、强协同、相加及中度拮抗抗HIV-1_ⅢB作用, 并且发现浓度较低的氯喹(0.541~8.653 μmol·L^-1)分别与RAL、T-20、IDV联合呈现较强协同作用。

2.2 氯喹联合用药的抗HIV-1_KM018作用

氯喹与整合酶抑制剂RAL联合抗临床分离株HIV-1_KM018实验的协同/拮抗容积量为63.46 ± 15.93/-44.83 ± 12.7 [(nmol·L^-1)²%], 表现出中度协同作用。1.7125 μmol·L^-1氯喹与0.3725 nmol·L^-1 RAL联合使用时协同作用最强; 氯喹与蛋白酶抑制剂IDV联合用药协同/拮抗容积量为27.01 ± 8.07/-7.33 ± 0.32 [(nmol·L^-1)²%], 呈现轻度协同作用(图 3A)。3.425 μmol·L^-1氯喹与2.2725 nmol·L^-1 IDV联合使用时协同作用最强(图 3B)。

结果表明, 氯喹分别与RAL、IDV联合在体外具有中度协同、轻度协同抗HIV-1_KM018作用。低浓度氯喹(0.856~3.425 μmol·L^-1)联合用药呈现协同作用, 浓度较高时多为相加或拮抗作用。

3 氯喹联合用药对TLR7激动剂引起的pDC活化的影响

HIV为单链RNA病毒, 通过pDC胞吞作用被吞噬进入细胞, 在pDC内体经过酸化之后, 暴露出病毒RNA链, 激活表达于内体上的TLR7, 经TLR7信号通路, 活化pDC并引起Ⅰ型干扰素分泌上调^[18]。氯喹为弱碱性药物, 可以通过渗透扩散进入内体, 阻断内体上TLR7下游的信号通路, 在体外实验中可有效地抑制TLR7激动剂引起的pDC活化及干扰素分泌水平^{[8, 10]}。为了检测氯喹联合用药对TLR7介导的pDC活化及Ⅰ型干扰素分泌水平是否有影响, 本研究使用TLR7刺激剂R848对pDC进行刺激培养, 检测单独使用氯喹、RAL、IDV及氯喹分别与RAL、IDV的联合使用对pDC活化及Ⅰ型干扰素分泌的作用。

在使用药物处理R848刺激的PBMC 24 h后, 对pDC表面共刺激因子CD86的表达情况进行了分析。CD86为pDC活化时的重要标志, CD86的表达情况可有效说明pDC的活化水平。如图 4A~C所示, 首先划出lineage^-的PBMC群体, 在此基础上划出HLA-DR⁺CD123⁺双阳性的细胞, 即pDC, pDC约占PBMC的0.2%~0.4%, 再进一步圈出CD86⁺的pDC, 利用柱状图分析不同用药情况下pDC表面CD86表达水平的高低。

随后通过定量PCR检测IFN-α、IFN-β的相对表达水平, 实验结果如图 4D~E和图 5所示, RAL、IDV对TLR7激动剂引起的pDC活化及IFN-α、IFN-β分泌上调没有影响。氯喹可有效地抑制pDC活化及IFN-α、IFN-β的分泌, 氯喹分别与RAL、IDV的联合使用相比于氯喹单药使用对pDC活化水平和IFN-α、IFN-β表达水平的下调作用在统计学上并无明显差异(P > 0.05)。结果表明, RAL、IDV与氯喹的联合使用均不会导致氯喹对R848引起的pDC活化和IFN-α、IFN-β分泌上调的抑制作用发生变化。

讨论

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本研究将HIV糖基化作为一个新靶点运用到cART中, 使用氯喹与其他靶点的抗病毒药物联合使用检测其体外抗HIV-1活性。根据MacSynergy Ⅱ程序分析方法定义的协同/拮抗标准, 氯喹与RAL联合用药具有中度协同作用, 实验中药物使用不同浓度联合用药呈现的作用并不相同。氯喹主要在浓度为0.541~2.163 μmol·L^-1时与RAL联合表现出不同程度的协同抗病毒作用, 此浓度与接受疟疾治疗的患者体内氯喹的血药浓度相近^[19]。氯喹具有逆转多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)的作用^[20], 因此猜测其协同作用可能与该浓度范围内的氯喹可逆转病毒对RAL产生的耐药性有关。氯喹与进入抑制剂T-20的联合具有强协同抗HIV-1_ⅢB作用, 氯喹浓度为1.082 μmol·L^-1时与T-20联合表现出较强的协同作用。T-20为进入抑制剂, 可特异地与HIV-1 gp41的HR1结合阻断病毒的融合过程, 从而抑制病毒的感染^[21], 因此推测氯喹与T-20联合使用呈现的协同作用, 可能与氯喹增强了T-20的融合阻断作用有关。氯喹与蛋白酶抑制剂IDV联合抗HIV-1_ⅢB和HIV-1_KM018作用呈轻度协同作用, 与Savarino等^[20]的研究结果一致。氯喹与非核苷类逆转录酶抑制剂EFV联合抗HIV-1_ⅢB呈现中度拮抗作用。

本研究发现与单药相比, 氯喹分别与整合酶抑制剂RAL、蛋白酶抑制剂IDV联合使用并不影响氯喹对TLR7激动剂引起的pDC活化和Ⅰ型干扰素分泌上调的抑制作用, 表明在体外联合使用氯喹能够抑制pDC活化。氯喹分别与RAL、IDV联用呈不同程度的协同抗HIV-1作用, 并且氯喹与RAL、IDV的联合使用并不会影响氯喹对pDC活化的抑制作用。本研究结果为临床上cART联合使用氯喹降低患者免疫活化、减缓AIDS疾病进程提供了一定实验依据, 将有利于促进氯喹更好、更广泛地应用于临床研究和治疗。

基金

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国家科技重大专项资助项目(2009ZX09501-029)
国家科技重大专项资助项目(2014ZX10005-002)
国家自然科学基金资助项目(81102483)
国家重点研发项目课题(2016YFC1201000)
云南省应用基础研究计划(2015FB182)

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2018年第53卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0853

接收时间：2017-08-30
首发时间：2026-01-15
出版时间：2018-02-12

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收稿日期：2017-08-30
修回日期：2017-10-10

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国家科技重大专项资助项目(2014ZX10005-002)

国家自然科学基金资助项目(81102483)

国家重点研发项目课题(2016YFC1201000)

云南省应用基础研究计划(2015FB182)

作者信息

1.昆明医科大学药学院, 云南省天然药物药理重点实验室, 云南昆明 650500

2.中国科学院昆明动物研究所, 云南省活性多肽研究与利用重点实验室/中国科学院动物模型与人类疾病机理重点实验室, 云南昆明 650223

3.中国科学院大学, 北京 100039

通讯作者:

* 郑永唐, Tel/Fax:86-871-5195684, E-mail:zhengyt@mail.kiz.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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