药学学报

化合物	R₁	R₂	K_i/nmol·L^-1	IC₅₀/nmol·L^-1
15		NH₂	1.6	15
16	OCH₃	1.5	12
17	OCH₃	2.5	47
18	OCH₃	1.2	19
19	OCH₃	1.4	18
20	NH₂	1.5	40
21	NH₂	2.1	4.5
22	OCH₃	1.1	1.4
23	CH₃	1.2	3.5
24	OCH₃	2.2	4.5

化合物

R₁

R₂

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

NH₂

1.6

OCH₃

1.5

OCH₃

2.5

OCH₃

1.2

OCH₃

1.4

NH₂

1.5

NH₂

2.1

4.5

OCH₃

1.1

1.4

CH₃

1.2

3.5

OCH₃

2.2

4.5

化合物	R₁	R₂	K_i/nmol·L^-1	IC₅₀/nmol·L^-1
15		NH₂	1.6	15
16	OCH₃	1.5	12
17	OCH₃	2.5	47
18	OCH₃	1.2	19
19	OCH₃	1.4	18
20	NH₂	1.5	40
21	NH₂	2.1	4.5
22	OCH₃	1.1	1.4
23	CH₃	1.2	3.5
24	OCH₃	2.2	4.5

化合物

R₁

R₂

K_i/nmol·L^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

NH₂

1.6

OCH₃

1.5

OCH₃

2.5

OCH₃

1.2

OCH₃

1.4

NH₂

1.5

NH₂

2.1

4.5

OCH₃

1.1

1.4

CH₃

1.2

3.5

OCH₃

2.2

4.5

药物	相对分子质量	K_i/nmol·L^-1	ΔG/kJ·mol^-1	配体效率	ΔH/kJ·mol^-1	-TΔS/kJ·mol^-1
沙奎那韦	669.84	2.0	-53.5	0.26	13.0	-66.5
安普那韦	505.63	0.39	-55.2	0.38	-28.8	-26.4
地瑞那韦	547.66	0.004 5	-62.7	0.39	-53.1	-9.6

药物

相对分子质量

K_i/nmol·L^-1

ΔG/kJ·mol^-1

配体效率

ΔH/kJ·mol^-1

-TΔS/kJ·mol^-1

沙奎那韦

669.84

2.0

-53.5

0.26

13.0

-66.5

安普那韦

505.63

0.39

-55.2

0.38

-28.8

-26.4

地瑞那韦

547.66

0.004 5

-62.7

0.39

-53.1

-9.6

药物	相对分子质量	K_i/nmol·L^-1	ΔG/kJ·mol^-1	配体效率	ΔH/kJ·mol^-1	-TΔS/kJ·mol^-1
沙奎那韦	669.84	2.0	-53.5	0.26	13.0	-66.5
安普那韦	505.63	0.39	-55.2	0.38	-28.8	-26.4
地瑞那韦	547.66	0.004 5	-62.7	0.39	-53.1	-9.6

药物

相对分子质量

K_i/nmol·L^-1

ΔG/kJ·mol^-1

配体效率

ΔH/kJ·mol^-1

-TΔS/kJ·mol^-1

沙奎那韦

669.84

2.0

-53.5

0.26

13.0

-66.5

安普那韦

505.63

0.39

-55.2

0.38

-28.8

-26.4

地瑞那韦

547.66

0.004 5

-62.7

0.39

-53.1

-9.6

基于结构设计的蛋白酶抑制剂沙奎那韦、安普那韦和地瑞那韦

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郭宗儒

药学学报 | 新药发现与研究实例简析 2017,52(5): 832-836

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药学学报 | 新药发现与研究实例简析 2017, 52(5): 832-836

基于结构设计的蛋白酶抑制剂沙奎那韦、安普那韦和地瑞那韦

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郭宗儒

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

Affiliations

出版时间: 2017-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2015-0365

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引用本文

郭宗儒. 基于结构设计的蛋白酶抑制剂沙奎那韦、安普那韦和地瑞那韦. 药学学报, 2017 , 52 (5) : 832 -836 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0365

. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017 , 52 (5) : 832 -836 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0365

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新药发现与研究实例简析

新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。

20世纪90年代在基于靶标结构设计药物(SBDD)的研究中, 沙奎那韦是为数不多成功的一个。由于解析了HIV蛋白酶的作用机制和酶的三维结构, 研究者得以从最简单的基本单元入手, 在成药性理念的指导下, “生长”成与活性中心的形状、尺寸和电性呈互补结合的拟肽链, 同时“注入”过渡态的类似结构, 完成了首创的高活性的口服抗艾滋病药物沙奎那韦。进而研发者针对该首创药物的不足, 继续在结构生物学的指引下, 研制成活性更强、药代完善和克服耐药的两个更新产品。安普那韦和地瑞那韦在同一理念下研制成功, 但无论在宏观生物学和化学性质上, 还是微观的结合特征和热力学的焓-熵转化方面, 都更胜一筹。

(编者按)

1 作用靶标—HIV蛋白酶

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人免疫缺陷病毒(HIV)携有的HIV蛋白酶属天冬氨酸蛋白酶家族成员, 在HIV复制周期中有十分重要的功能, 即负责裂解gag和gag-pol的前体多蛋白分子, 生成构成性蛋白(例如p17、p24、p7、p6、p2、p1) 和功能性蛋白(例如蛋白酶p11、逆转录酶p66/p51、整合酶p32等), 从而促使新生病毒颗粒成熟并具传染性。抑制HIV蛋白酶可干扰病毒复制的后期环节, 因而成为治疗艾滋病药物的一个主要作用环节。

HIV蛋白酶是由两个相同的含99个氨基酸亚基构成的同二聚体, 对称组合具有二重旋转对称轴(C2), 每个单体的活性部位底部有Asp25、Thr26和Gly27, 顶部有Ile50封盖(另一亚基为Asp25'、Thr26'、Gly2和Ile50')。每个亚基含有4个结合腔穴S1~S4 (另一组表示为S1'~S4'), 被水解的底物肽的结构部位P1~P4和P1'~P4'分别结合到相对应的腔内。

当HIV病毒RNA转译HIV前体多肽长链蛋白生成后, HIV蛋白酶水解其中特定的Phe-Pro (或Tyr-Pro)肽键。人体的天冬氨酸蛋白酶如胃蛋白酶、肾素等的剪切位点是Leu-Val或Leu-Ala, 而不水解Phe-Pro, 所以针对Phe-Pro的底物结构设计抑制剂可提高选择性作用。图 1是底物蛋白与HIV蛋白酶结合模式和水解位点的示意图。

2 过渡态类似物原理

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过渡态类似物是一类稳定的化合物, 它模拟酶催化反应中底物转变成产物时的过渡态结构。若化合物类似于过渡态结构, 则与酶的结合力很强。过渡态类似物是以稳定的化合物模拟反应过程的过渡态或活化中间体结构, 利用静态化合物与动态中间体的结构相似性设计出的抑制剂, 从而与酶的亲和力非常强。HIV蛋白酶对天然底物Phe-Pro特定肽键水解时要经过一个过渡态。模拟肽键水解的过渡态结构, 在结构中插入一个“CH₂”, 模拟肽键的酰基C=O由sp²杂化碳原子转变成sp³杂化态, 羟乙胺-CH (OH)-CH₂-NH-作为肽键-CO-NH-水解的过渡态的替换结构, 是众多HIV蛋白酶抑制剂的共有片段。例如本文讨论的HIV蛋白酶抑制剂以及降压药肾素抑制剂等。

3 从二肽Phe-Pro到先导化合物

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Ghosh等基于上述理念, 以Phe-Pro (1, 没有活性)为起始物, 将氨基和羧基分别用苄氧羰和叔丁基保护, 同时用羟乙基替换酰基, 合成了含有过渡态结构的拟二肽(2), 2对HIV蛋白酶呈现弱抑制活性, IC₅₀ = 6 500 nmol·L^-1。为了模拟底物序列, 在化合物2的氨基端连接天冬酰胺得到化合物3, 活性提高40倍, IC₅₀ = 140 nmol·L^-1。然而3的氨基端再延长一个亮氨酸或羧基端增加异亮氨酸或两边同时增加都没有提高活性。

化合物3的中央羟基的构型对活性有影响, R异构体强于S构型(IC₅₀ = 300 nmol·L^-1)。该R构型的作用在以后的优化中作用更加显著。将3中的天冬酰胺的末端酰胺换成其他基团, 活性显著降低, 提示该酰胺基参与了重要的结合作用。苄氧羰基、天冬氨酸的酰胺基和苯丙氨酸的苄基分别结合于S3、S2和S1腔中, 脯氨酸的四氢吡咯环进入S1'腔, C-端的叔丁基进入S2'中。由于3具备了呈现较强活性的最小尺寸的骨架, 因而作为先导化合物进行了系统的优化。

4 先导物的优化

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对上述进入结合腔的各个基团进行变换, 包括体积大小和电性强弱的变换, 设计合成了100多个含有类似过渡态的化合物, 优化的历程和构效关系概括如下。

4.1 C-末端的变换

化合物3疏水性的C-端的叔丁基是必要的疏水基团, 将叔丁氧基换成叔丁胺基, 化合物4仍有活性(略低), IC₅₀ = 210 nmol·L^-1。

4.2 N-末端的变换

化合物3的N-末端也是疏水性基团, 将苄基换成2-萘基, 以增加疏水性, 化合物5活性提高到IC₅₀ = 53 nmol·L^-1; 2-萘基换成2-喹啉片段, 化合物6的IC₅₀ = 23 nmol·L^-1, 提示增加疏水性和基团体积有利于活性, 环上的氮原子参与了结合。

4.3 四氢吡咯的变换

化合物4的四氢吡咯扩环成哌啶环, 化合物7的活性提高到IC₅₀ = 18 nmol·L^-1, 进而将哌啶换成十氢异喹啉化合物8, 活性更加提高, IC₅₀ ≤ 2.7 nmol·L^-1, 提示增大体积和疏水性有利于同S1'腔的结合。

4.4 天冬氨酸片段的变换

化合物7的天冬氨酸片段变换为β-氰基丙氨酸(9)或S-甲基半胱氨酸(10)仍有较高的活性, IC₅₀分别为23和12 nmol·L^-1, 但变化不大。

4.5 综合各优化因素—候选化合物的确定

综合上述有代表性的化合物的构效关系, 设计合成了化合物11 (IC₅₀ = 2 nmol·L^-1), 结构中羟乙胺的手性碳为R构型, 而S-差向异构体IC₅₀ = 470 nmol·L^-1, 提示与催化中心结合的基团取向的重要性。将哌啶改换成十氢异喹啉环, 12成为活性最强的化合物(IC₅₀ = 0.4 nmol·L^-1)。

评价高活性的化合物11和12对感染HIV细胞的抑制活性, 显示12活性最高, 对感染细胞的活性IC₅₀ = 2 nmol·L^-1, 对正常细胞毒性很低, TD₅₀ > 10 000 nmol·L^-1。在高浓度下(近万倍的有效抑制浓度)对人体胃蛋白酶, 组织蛋白酶D、E和人白细胞弹性硬蛋白酶等都未见抑制作用。化合物12定名为沙奎那韦(saquinavir), 以甲磺酸盐形式进入临床研究, 表明可抑制HIV1和HIV2病毒在患者体内的繁殖。FDA于1997年以HIV蛋白酶为靶标批准为第一个上市的抗艾滋病药物。

5 沙奎那韦与HIV蛋白酶的结合方式

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沙奎那韦与HIV1蛋白酶复合物单晶衍射图(图 2)表明, 羟乙胺的羟基处于催化中心的Asp25和Asp25'之间, 形成氢键结合网络; 在S1和S1'中的两个羰基与结构水分子形成氢键结合, 水分子又与顶盖上Ile50和Ile50'的-NH-形成氢键; 与十氢异喹啉相连的酰胺-CO-NH-分别与Asp28和Gly48形成氢键。天冬酰胺的骨架-CO-NH-与酶的Asp30骨架上的NH和末端COOH形成氢键; 叔丁基与S2'腔、苄基与S1腔、十氢异喹啉环与S3'腔发生疏水-疏水相互作用。这些基团的配置恰好适于R构型的羟基发生有利的结合, 从而揭示了比S构型活性高的结构基础(Krohn A, Redshaw S, Ritchie JC, et al. Novel binding mode of highly potent HIV proteinase inhibitors incurporating the (R)-hydroxyethylamine isostere. J Med Chem, 1991, 34: 3340-3342)。

6 由沙奎那韦演化的后续药物

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6.1 安普那韦

沙奎那韦是以蛋白酶为靶标的首创性口服抗艾滋病药物, 应用中有两个重要缺点:生物利用度低和代谢稳定性差, 这是因为分子量大(游离碱669.84) 和肽类结构的缘故。因而后续的研究是以沙奎那韦为起始物, 研制消除肽结构和降低分子量的抑制剂。

首先, 根据平行的研究, 发现用四氢呋喃置换结合于S2腔的酰胺片段仍呈现活性, 因而合成了化合物13, 活性显著提高, 抑酶活性IC₅₀ = 0.054 nmol·L^-1, 对感染细胞的IC₉₅ = 8 nmol·L^-1。四氢呋喃的结合模式是环中氧原子与Asp29的NH形成氢键。13虽然活性高, 但分子仍然很大, 相对分子质量682.88, 去除喹啉甲酰胺片段, 用胺甲酰片段连接3S-羟基四氢呋喃环, 化合物14尺寸减小, 相对分子质量为514.69, 但因失去了与S3腔结合, 活性降低为K_i = 87 nmol·L^-1 (Thompson WJ, Ghosh AK, Holloway MK, et al. Tetrahydrofuranylglycine as a novel, unnatural amino acid surrogate for asparagine in the design of inhibitors of the HIV protease. J Am Chem Soc, 1993, 115: 801-803)。

根据平行研究所获得的构效关系信息, 可以对化合物12的十氢异喹啉和叔丁胺甲酰片段加以变换:将模拟过渡态羟乙胺片段中的胺基用苯磺酰连接, 以替换十氢异喹啉, 也仍然结合于S2', 叔丁胺片段用N-异丁基替换, 结合于S1', 这样就消除了3个手性碳原子, 简化了分子结构(MW = 505.63)。通过制备并评价各手性中心的构型对活性的影响, 揭示化合物15活性最强, 对酶的抑制活性K_i = 0.6 nmol·L^-1 (HIV1) 和19 nmol·L^-1 (HIV2), 抑制HIV感染细胞的活性IC₅₀ = 40 nmol·L^-1。15的水溶性显著提高, S = 190 μg·mL^-1 (Ghosh AK, Kincaid JF, Cho W, et al. Potent HIV protease inhibitors incorporating high-affinity P2-ligands and (R)-(hydroxethylamino) sulfonamide isostere. Bioorg Med Chem Lett, 1998, 8: 687-690)。由于有良好的药效学和药动学性质, GSK公司将其进入开发阶段, 命名为安普那韦(amprenavir), 经临床研究于1999年FDA批准上市。

安普那韦与HIV1蛋白酶复合物晶体结构表明, 4个疏水性片段分别结合于4个疏水腔中:四氢呋喃进入S1, 苄基进入S2, N-异丁基进入S1', p-氨苯基进入S2'中, 如图 3a所示。杂原子与活性中心形成氢键的状态是:呋喃环中的O¹与Asp29和Asp30形成弱结合氢键; O²未见氢键形成; O³与磺酰的一个氧原子O⁵经结构水的介导, 与Ile50和Ile50'的-NH-形成氢键, 中央的4-OH与Asp25、Asp25'发生氢键结合; 磺酰苯基的p-氨基与Asp30'形成氢键, 这些对提高分子的水溶性有重要贡献。图 3b是安普那韦与蛋白酶的晶体结构的氢键结合图(Kim EE, Baker CT, Dwyer MD, et al. Crystal structure of HIV-1 protease in complex with VX-478, a potent and orally bioavailable inhibitor of the enzyme. J Am Chem Soc, 1995, 117: 1181-1182)。

6.2 地瑞那韦

安普那韦(15)的成功激励Ghosh等进一步研发抗耐药的HIV抑制剂, 优化的目标是对耐药株HIV蛋白酶有抑制活性, 结构优化的部位是变换四氢呋喃环, 例如用四氢噻吩或氧化成环丁砜替换四氢呋喃(同时也变换P2'的苯环取代基为甲氧基), 得到17和18, 结果表明仍保持高抑酶活性。因环丁砜活性高于硫醚, 进而在环上做烷基取代。此外, 分析砜基的两个氧原子可能与S2腔的Asp29和Asp30形成两个氢键, 并参照曾经探索过的并合双四氢呋喃片段的有效性, 合成了有代表性的化合物21~24, 表 1列出了化合物结构、抑酶活性和抑制HIV感染细胞的活性数据(Ghosh AK, Kincaid JF, Walters DE, et al. Nonpeptidal P2 ligands for HIV protease inhibitors: structure-based design, synthesis, and biological evaluation. J Med Chem, 1996, 39: 3278-3290)。

化合物21~24对酶和细胞都显示高抑制活性, 其中21对耐受多种药物的HIV病毒蛋白酶和细胞仍有高活性, 而且21与蛋白酶结合生成的复合物离解速率很低, 低于其他“那韦”类抑制剂2~3个数量级, 预示有较长持续性作用(King NM, Prabu-Jeyabalan M, Nalivaika EA, et al. Structural and thermodynamic basis for the binding of TMC114, a next-generation human immunodeficiency virus Type 1 protease inhibitor. J Virol, 2004, 78: 12012-12021)。

化合物21定名为地瑞那韦(darunavir), 相对分子质量为547.66, 水溶性0.15 mg·mL^-1, 分配系数logP 1.8。与利托那韦(CYP3A4抑制剂)合用的口服生物利用度F = 82%, 半衰期t_1/2 = 15 h, 经临床研究, FDA于2006年批准上市。

地瑞那韦与HIV1蛋白酶的复合物晶体结构提示, 双四氢呋喃环、苄基、N-异丁基和氨苯基分别结合于S2、S1、S1'、和S2'腔内, 各极性基团或原子与活性中心形成的氢键与安普那韦相似(图 3), 唯一的不同是由于并合了一个四氢呋喃环, 新的氧原子形成了更多的氢键, 图 4是地瑞那韦与HIV1蛋白酶的复合物晶体结构, 虚线表示氢键的结合(Tie YPI, Boross YF. Wang L, et al. High resolution crystal structures of HIV-1 protease with a potent non-peptide inhibitor (UIC-94017) active against multidrug-resistant clinical strains. J Mol Biol, 2004, 338: 341-352)。

7 沙奎那韦、安普那韦和地瑞那韦与蛋白酶结合的热力学分析

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沙奎那韦、安普那韦和地瑞那韦都是由Ghosh研究组设计合成并成功研发的, 而且每个药物都是在前面的基础上优化得到的, 因而与酶的结合作用逐渐增强, 地瑞那韦的结合自由能最大。比较三者的配体效率, 也是随着结构的优化, 配体效率增高, 表明后续研发药物的原子有助于结合效率的提高。另一个重要参数是焓和熵对结合能的贡献。沙奎那韦的结合能全部是熵的贡献, 提示疏水和范德华作用是与酶结合的驱动力, 焓对结合的作用是负贡献(不利的焓变ΔH为正值):安普那韦的焓(ΔH)与熵(-TΔS)的贡献大约各半, 提示氢键和电性作用与范德华作用的贡献相近; 地瑞那韦对结合能的贡献主要是焓贡献, 是由于多个氢键结合, 提高了结合的特异性, 因此地瑞那韦的配体效率最高。表 2列出了这三个药物的热力学参数(Mittal S, Bandaranayake RM, King NM, et al. Structural and thermodynamic basis of amprenavir/darunavir and atazanavir resistance in HIV-1 protease with mutations at residue 50. J Virology, 2013, 87: 4176-4184)。

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2017年第52卷第5期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2015-0365

首发时间：2026-01-14
出版时间：2017-05-12

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中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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