药学学报

UHPLC-QTOF-MS法分析鉴定吴茱萸水提物在大鼠血浆、尿液和粪便中的原形成分及其代谢产物

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程宇欣 ¹^,² , 陈两绵 ² , 王智民 ² , 张启伟 ² , 闫利华 ²^,^* , 赵正保 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2017,52(7): 1157-1164

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药学学报 | 研究论文 2017, 52(7): 1157-1164

UHPLC-QTOF-MS法分析鉴定吴茱萸水提物在大鼠血浆、尿液和粪便中的原形成分及其代谢产物

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程宇欣¹^,², 陈两绵², 王智民², 张启伟², 闫利华²^,^*, 赵正保¹^,^*

作者信息

1.山西医科大学, 山西太原 030001

2.中国中医科学院中药研究所, 中药质量控制技术国家工程实验室/国家中医药管理局中药过程控制技术重点研究室, 北京 100700

通讯作者:

* 闫利华, E-mail:yanlihua2829@163.com;

赵正保, E-mail:zhengbao_z@163.com

Analysis of major bioactive components and their metabolites in rats' plasma, urine and feces after oral administration of the aqueous extract of Euodiae Fructus by UHPLC-QTOF-MS

Yu-xin CHENG¹^,², Liang-mian CHEN², Zhi-min WANG², Qi-wei ZHANG², Li-hua YAN²^,^*, Zheng-bao ZHAO¹^,^*

Affiliations

1. Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences; National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines; Key Laboratory of SATCM for Process Analysis Technology of Chinese Herbal Medicines, Beijing 100700, China

出版时间: 2017-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0038

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摘要

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采用UHPLC-QTOF-MS技术，对吴茱萸水提物的主要成分及给药后大鼠体内的原形成分及其代谢产物进行定性分析。通过分析各成分的保留时间、精确分子质量、一级、二级质谱信息并与相应的对照品比对，从吴茱萸水提物中鉴定了27个成分，其中25个成分经对照品确证；从灌胃给予吴茱萸水提物的大鼠血浆、尿液和粪便中鉴定、推测出16个原形成分和35个代谢产物，16个原形成分均经对照品确证。吴茱萸水提物的主要成分有酚酸、黄酮苷、柠檬苦素和生物碱。生物碱、黄酮和酚酸存在于血浆、尿液和粪便中，柠檬苦素主要存在于尿液和粪便中。这些成分在大鼠体内代谢的主要途径有羟基化、氢化、甲基化、硫酸化、葡糖醛酸化等。该研究基本明确了吴茱萸水提物中各类成分在大鼠体内的主要存在形式，为吴茱萸体内药效物质的阐明提供了参考。

关键词

吴茱萸 / 水提物 / 原形成分 / 代谢产物 / 超高效液相色谱-飞行时间质谱联用

Abstract

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An ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UHPLC-Q-TOF/MS)method has been established to analyze the bioactive components of the aqueous extract of Euodiae Fructusand detect the metabolites in rats after oral administration of the aqueous extract. Compounds were detected by analyzing their retention times, high resolution mass data, mass spectra and comparing with the reference substances. As a result, 27 compounds were characterized from the aqueous extract of Euodiae Fructus, and 25 compounds were identified on the basis of the reference substances. 16 parent compounds and 35 metabolites were detected in rats' plasma, urine and feces samples, and all of the parent compounds were determined unambiguously through comparison with the reference substances. Four classes of compounds were identified from the aqueous extract of Euodiae Fructus, including phenolic acids, limonins, flavonoid glycosides and alkaloids. Phenolic acids, flavonoid glycosides and alkaloids were detected in rats' plasma, urine and feces, while limonins were detected in the urine and feces. The main metabolism pathways of these compounds in rats might include hydroxyl, hydrogenation, methylation, sulfating, glucuronidation, and so on. The results of this study provide references in the material basis of Euodiae Fructus in vivo.

Key words

Euodiae Fructus / aqueous extract / parent compound / metabolite / UHPLC-QTOF-MS

引用本文

程宇欣, 陈两绵, 王智民, 张启伟, 闫利华, 赵正保. UHPLC-QTOF-MS法分析鉴定吴茱萸水提物在大鼠血浆、尿液和粪便中的原形成分及其代谢产物. 药学学报, 2017 , 52 (7) : 1157 -1164 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0038

Yu-xin CHENG, Liang-mian CHEN, Zhi-min WANG, Qi-wei ZHANG, Li-hua YAN, Zheng-bao ZHAO. Analysis of major bioactive components and their metabolites in rats' plasma, urine and feces after oral administration of the aqueous extract of Euodiae Fructus by UHPLC-QTOF-MS[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017 , 52 (7) : 1157 -1164 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0038

正文

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吴茱萸为传统中药, 来源于芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth、石虎E. rutaecarpa (Juss.) Benth. var. officinalis (Dode) Huang或疏毛吴茱萸E. rutaecarpa (Juss.) Benth. var. bodinieri (Dode) Huang的干燥近成熟果实^[1]。其性味辛、苦, 性热, 具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泄等功效^[2]。含吴茱萸的中医方剂及成方制剂很多, 如吴茱萸汤、温经汤、荜铃胃痛颗粒、泻痢消胶囊、胃立康片、肠康片、调经活血片、左金丸、戊己丸等^[1]。可见, 汤剂(水提物)为吴茱萸中医临床中最常用的剂型。大量文献也证实吴茱萸水提物具有镇痛、抗炎、抗溃疡、止呕、止泻等药理作用^{[3, 4]}。虽然国内外学者对吴茱萸的化学成分及其生物活性进行了广泛深入的研究, 从中分离得到生物碱(吲哚类和喹诺酮类)^{[5, 6]}、柠檬苦素^[7]、黄酮^[8]、酚酸^[9]等多种类型的化合物, 但吴茱萸体内发挥药效的化学成分及其体内过程仍不清楚。

研究中药在体内的代谢产物对阐明中药体内药效物质基础和作用机制发挥着重要作用。2015版《中国药典》以吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素作为吴茱萸药材及饮片质量控制的指标成分。目前, 对吴茱萸代谢产物的研究大多局限于吴茱萸碱、吴茱萸次碱及柠檬苦素等单体成分, 包括经肝微粒体体外代谢^{[10, 11]}和实验动物灌胃或静脉注射后^[12-15]体内代谢产物的分析。关于提取物给药后体内的代谢研究较少, 仅有少量关于醇提物^[16-18]的报道, 且表征的成分仅局限于生物碱。本课题组研究表明吴茱萸水提物中存在大量的酚酸类和黄酮苷类成分^[19], 提示酚酸和黄酮类成分也对吴茱萸药效作用有贡献, 但是至今尚无关于吴茱萸中该两类成分体内代谢的报道。

本实验采用UHPLC-QTOF-MS法, 首先对吴茱萸水提物中的主要化学成分进行鉴定, 在此基础上对吴茱萸水提物经大鼠灌胃后的体内成分进行全面分析。从吴茱萸水提物中共鉴定了27个化合物, 其中25个成分经对照品指认; 在灌胃给予吴茱萸水提物的大鼠血浆、尿液和粪便中共鉴定、推测出16个原形成分和35个代谢产物。研究结果为阐明吴茱萸体内药效物质基础、完善吴茱萸及其制剂的质量标准、提高其临床疗效提供了科学依据。

材料与方法

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仪器美国Waters Acquity UPLC/Xevo G2-S QTOF系统, 包括Xevo G2-S QTOF质谱和Acquity超高效液相系统; BSA124S-CW型万分之一电子分析天平(北京塞多利斯科学仪器有限公司); 高速离心机(Sigma Laborzentrifugen GmbH); 旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司); 手动移液器(德国艾本德股份公司)。

药品与试剂 吴茱萸药材于2015年8月采自江西樟树吴城乡, 经中国中医科学院中药研究所闫利华副研究员鉴定为芸香科植物石虎[Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var. officinalis (Dode) Huang]的干燥近成熟果实。样品标本(凭证号WZY-JXZS-2015) 保存于中国中医科学院中药研究所。对照品异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷(2)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(3)、去氢吴茱萸碱(4)、¹⁴N-甲酰二氢吴茱萸次碱(5)、7β-羟基吴茱萸次碱(6)、吴茱萸碱(8)、吴茱萸次碱(9)、1-甲基-2-正壬基-4(1H)-喹诺酮(10)、1-甲基-2-[(Z)-6-十一烯基]-4(1H)-喹诺酮(11)、1-甲基-2-正十一烷基-4(1H)-喹诺酮(12)、吴茱萸卡品碱(13)、1-甲基-2-[(6Z, 9Z)-6, 9-十五二烯]-4(1H)-喹诺酮(14)、二氢吴茱萸卡品碱(15)、1-甲基-2-[(Z)-10-十五烯基]-4(1H)-喹诺酮(16)、松柏苷(21)、异鼠李素-3-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷(23)、柠檬黄素-3-O-β-D-芸香糖苷(24)和异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷(25)均为实验室自制, 纯度均大于95%。金丝桃苷(1) (批号111521-201004)、柠檬苦素(7) (批号110800-200404)、绿原酸(18) (批号110753-200413)、咖啡酸(19) (批号110885-200102) 购自中国食品药品检定研究院。新绿原酸(17) (批号X-014-140801) 和隐绿原酸(20) (批号Y-067-14080) 购自成都瑞芬思生物科技有限公司; 芦丁(22) (批号Y22S653719) 购自上海源叶生物科技有限公司, 纯度均大于98%。化学纯羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、肝素钠、水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司; 色谱纯乙腈、质谱纯甲酸(Fisher公司); 娃哈哈纯净水(娃哈哈宏振有限公司)。

实验动物 SPF级雄性SD大鼠, 体重180~200 g, 由中国食品药品检定研究院提供, 合格证号: SCXK (京) 2014-0013。大鼠适应性喂养5天后开始实验, 给药前禁食12 h, 自由饮水。

吴茱萸水提物及供试品溶液的制备 吴茱萸药材50 g, 粉碎, 依次用15倍量、10倍量和10倍量的去离子水回流提取3次, 每次2 h, 过滤, 合并滤液, 45 ℃减压浓缩至约200 mL, 再冷冻干燥, 得水提物粉末22.04 g (提取率44.08%)。

取上述水提物粉末0.25 g, 精密称定, 置25 mL量瓶, 50%甲醇溶解定容, 即得供试品溶液。进样前10 000 r·min^-1离心10 min, 进样体积1 μL。

对照品溶液制备 分别精密称取对照品适量, 加甲醇溶解定容, 制成适宜浓度的混合对照品溶液。进样前10 000 r·min^-1离心10 min, 进样体积1 μL。

色谱条件 色谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm); 流动相为乙腈(A) -0.1%甲酸/水(B), 梯度洗脱: 0~3 min, 6% A; 3~4 min, 6%~10% A; 4~7 min, 10%~12% A; 7~8 min, 12%~14% A; 8~13 min, 14%~15% A; 13~15 min, 15%~20% A; 15~18 min, 20%~30% A; 18~21 min, 30%~49% A; 21~25 min, 49%~51% A; 25~27 min, 51%~73% A; 27~30 min, 73%~80% A; 30~31 min, 80%~100% A; 31~32 min, 100% A。流速0.4 mL·min^-1, 柱温35 ℃。

质谱条件 电喷雾离子源(ESI); 正负离子扫描模式测定; 离子源温度120 ℃; 毛细管电压1.8 kV; 锥孔电压40 V, 去溶剂温度500 ℃; 去溶剂氮气流量700 L·h^-1; 锥孔气流量50 L·h^-1; 质量扫描范围m/z 100~1 200。

实验动物分组 6只SD雄性大鼠, 体重(200~210) g, 随机分为2组, 每组3只。给药组给予吴茱萸水提物粉末2.2 g·kg^-1 (相当于生药量5 g·kg^-1, 溶于提前制备好的CMC-Na溶液中, 每只灌胃量3 mL)灌胃3天, 每天1次。空白组灌胃给予等量的CMC-Na溶液。

尿液和粪便样品的采集 大鼠给药后置于代谢笼中, 自由饮水, 6 h后给予食物, 分别收集0~24 h时间段的尿液和粪便。尿液收集后随即加入1倍量甲醇, 10 000 r·min^-1离心15 min后取上清液, -20 ℃暂时保存。粪样低于50 ℃烘干。

血浆样品的采集 末次给药后0.5、1、1.5、2.5和4 h分别由眼眶静脉丛取血, 每次约1 mL, 将血样收集于肝素化的EP管中, 10 000 r·min^-1离心10 min, 取上层血浆转移至另一EP管中, 置于-20 ℃暂时保存。

生物样品处理

尿液处理将大鼠各时间段的尿液合并, 共计约48 mL (含等体积甲醇), 40 ℃减压浓缩, 称重3.96 g, 加入甲醇20 mL超声提取30 min, 提取液10 000 r·min^-1离心15 min后取上清液, 40 ℃减压浓缩, 加甲醇6 mL复溶, 10 000 r·min^-1离心10 min, 取1 μL进行UHPLC-MS分析。

粪便处理将干燥的粪样研碎混匀, 取8 g加入甲醇40 mL超声提取3次, 每次30 min, 合并提取液, 40 ℃减压浓缩至干, 加甲醇5 mL复溶, 10 000 r ·min^-1离心10 min, 取1 μL进行UHPLC-MS分析。

血浆处理将大鼠各时间点的血浆混合, 约7 mL, 加入5倍量甲醇, 涡旋混匀, 超声30 min, 10 000 r·min^-1离心15 min后取上清液, 40 ℃减压浓缩至干, 加甲醇1.5 mL复溶, 10 000 r·min^-1离心10 min, 取3 μL进行UHPLC-MS分析。

数据处理 应用MassLynx V4.1软件, 根据测得的精确相对分子质量, 在规定误差范围内(± 3.0 ppm)计算可能的元素组成, 并结合对照品及各个成分的二级质谱碎片信息和文献报道的数据, 对各色谱峰进行定性分析。

结果

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1 吴茱萸水提物中主要成分的定性及定量分析

应用UHPLC-QTOF-MS技术在上述色谱和质谱条件下对供试品溶液和对照品溶液进行分析, 根据各主要色谱峰的一级、二级质谱信息及保留时间, 结合25个对照品的质谱、色谱行为, 表征了吴茱萸水提物中的27个化合物, 结果见表 1, 包括生物碱12个、黄酮7个、酚酸5个、柠檬苦素3个。

吴茱萸水提物的UHPLC色谱图(254 nm)见图 1。峰7 (λ_max为190 nm)、峰10、11 (λ_max为320 nm)在254 nm下检测不到, 峰14、16、21、22、23则由于含量太低检测不出, 采用外标法^[20]分别在254、320和215 nm下对吴茱萸水提物中的20个成分进行定量, 含量分别是0.550 (1)、0.550 (2)、1.198 (3)、2.620 (4)、0.147 (5)、0.052 (6)、13.007 (7)、0.212 (8)、0.064 (9)、0.054 (10)、0.040 (11)、0.058 (12)、0.101 (13)、0.062 (15)、7.356 (17)、6.103 (18)、5.637 (19)、8.347 (20)、0.055 (24)和0.055 mg·g^-1 (25)。

2 给药血浆、尿液、粪便的UHPLC-QTOF-MS分析

采用MassLynx V4.1分别对空白血浆、尿液、粪便和给药血浆、尿液、粪便样品的UHPLC-QTOF-MS数据进行分析, 通过与已知对照品比对保留时间、准确分子质量、碎片离子来确定原形成分。利用高分辨质谱数据及其误差值、保留时间、原形成分的裂解规律及文献数据进行代谢产物推测。最终从大鼠血浆、尿液和粪便样品中分析鉴定出16个原形成分和35个可能的代谢产物(表 1)。

2.1 原形成分的鉴定

从给药血浆、尿液和粪便样本中检测到16个原形成分(表 1中1 ~16), 包括12个生物碱(4 ~6, 8 ~16), 3个黄酮苷(1 ~3)和1个柠檬苦素(7)。其中, 血浆中检测到2个喹诺酮类生物碱; 尿液中检测到2个黄酮苷; 粪便中检测到12个生物碱, 1个黄酮苷和1个柠檬苦素。16个原形成分都经过对照品确证。

2.1.1 生物碱类成分质谱裂解规律分析

生物样本中共检测到12个生物碱原形, 分为吲哚和喹诺酮两类, 在质谱中均表现为[M+H]⁺。吴茱萸碱发生RDA裂解产生特征碎片离子m/z 171和m/z 134, 另外, 会出现特征碎片离子m/z 144和m/z l61。吴茱萸次碱的主要碎片离子为m/z 169、m/z 273和m/z 244^{[21, 22]}。去氢吴茱萸碱脱去一个CH₃和一个H后, 形成稳定的共轭体系, 产生特征碎片离子m/z 286^[22]。喹诺酮类生物碱的母核结构相同, 差异仅在侧链的碳数及双键位置, m/z 186和m/z 173是其特征碎片离子^[7]。代表性生物碱裂解规律如图 2 a~d所示。

2.1.2 酚酸类成分质谱裂解规律分析以绿原酸(18)为例,

负离子模式一级质谱中显示准分子离子峰m/z 353 ([M-H]^-), 在二级质谱(MS²)中显示主要的碎片离子有经酯键水解后的奎宁酸负离子m/z 191和咖啡酸(19)负离子m/z 179, 咖啡酸继续失CO₂后形成碎片离子m/z 135^[23]。裂解规律如图 2e所示。

2.1.3 黄酮苷类成分质谱裂解规律分析

生物样本中共检测到3个黄酮苷原形, 此类化合物在负离子模式下响应较好, 有相同的裂解规律。以异鼠李素-3-O-芸香糖苷(3)为例, 在质谱中表现为糖苷键断裂, 形成m/z 315 ([M-H-Rha-Glu]^-)的异鼠李素苷元碎片离子。在异鼠李素苷元中, 其甲氧基容易发生断裂, 形成失去30 Da的碎片离子m/z 285。裂解规律如图 2f所示。

2.1.4 柠檬苦素类成分质谱裂解规律分析

生物样本中检测到1个柠檬苦素原形, 以柠檬苦素(7)为例, 其正离子模式一级质谱中显示[M+H]⁺准分子离子峰m/z 471, 在MS²中显示m/z 425 ([C₂₅H₂₉O₆]⁺)的基峰特征碎片离子, 裂解规律如图 2g所示。在负离子模式一级质谱中显示[M-H]^-的准分子离子峰m/z 469, 在MS²中显示特征碎片m/z 229^{[7, 21, 22, 24]}。

2.2 代谢产物的分析

从给药血浆、尿液和粪便中共检测到35个代谢产物(表 1中M1~M35), 包括28个生物碱, 4个酚酸和3个柠檬苦素。其中, 血浆中检测到7个生物碱, 和1个酚酸; 尿液中检测到13个生物碱、2个酚酸和1个柠檬苦素; 粪便中检测到16个生物碱、1个酚酸和2个柠檬苦素。

2.2.1 生物碱类代谢产物分析

M18的准分子离子峰为m/z 318.123 5 ([M+H]⁺, C₁₉H₁₆N₃O₂), 比去氢吴茱萸碱[M+H]⁺多16 Da, 其特征碎片离子为m/z 286.096 8、258.101 1、272.081 9, 与去氢吴茱萸碱的碎片离子一致, 因此推测M18为去氢吴茱萸碱羟基化产物。M9的准分子离子峰为m/z 336.134 2 ([M+H]⁺, C₁₉H₁₈N₃O₃), 比吴茱萸碱[M+H]⁺多32 Da, 其失去1个羟基形成碎片离子m/z 320.102 1, 此外, 特征碎片离子m/z 171.115 2和161.058 8与吴茱萸碱一致, 因此推测M9为吴茱萸碱双羟基化产物。同理, M15为羟基去氢吴茱萸碱, 和M18互为同分异构体; M10和M11为双羟基去氢吴茱萸碱, 二者互为同分异构体; M29为双羟基吴茱萸次碱; M30为羟基吴茱萸碱; M32为羟基吴茱萸次碱。

M17的准分子离子峰为m/z 320.138 9 ([M+H]⁺, C₁₉H₁₈N₃O₂), 比去氢吴茱萸碱多2个H原子和1个O原子, 特征离子碎片为m/z 302.092 1、286.097 2和272.081 4, 与去氢吴茱萸碱一致, 因此推测M17为去氢吴茱萸碱氢化并羟基化产物。M7和M13的准分子离子峰分别为m/z 336.134 1 ([M+H]⁺, C₁₉H₁₈N₃O₃)和m/z 322.119 0 ([M+H]⁺, C₁₈H₁₆N₃O₃), 分别比去氢吴茱萸碱和吴茱萸次碱多2个H和2个O, 其余二级碎片和对应生物碱一致, 因此M7和M13分别为去氢吴茱萸碱和吴茱萸次碱的氢化并双羟基化产物。M14的准分子离子峰为m/z 316.108 2 ([M+H]⁺, C₁₉H₁₄N₃O₃), 比¹⁴N-甲酰二氢吴茱萸次碱少2个H, 其余二级碎片和¹⁴N-甲酰二氢吴茱萸次碱一致, 因此推测M14为去氢¹⁴N-甲酰二氢吴茱萸次碱。M16的准分子离子峰为m/z 398.065 4 ([M+H]⁺, C₁₉H₁₄N₃O₅S), 比去氢吴茱萸碱多1个O和1个SO₃基团, 因此M16为羟基并硫酸化去氢吴茱萸碱。M24的准分子离子峰为m/z 320.103 1 ([M+H]⁺, C₁₈H₁₄N₃O₃), 比去氢吴茱萸碱多2个O并少1个CH₂基团, 因此M24为双羟基去甲去氢吴茱萸碱。

M33的准分子离子峰为m/z 372.253 1 ([M+H]⁺, C₂₃H₃₄NO₃), 比吴茱萸卡品碱多2个O, 因此M33为双羟基吴茱萸卡品碱。同理, M31、M34和M35分别为双羟基1-甲基-2-正十一烷基-4(1H)-喹诺酮、双羟基去氢1-甲基-2-[(6Z, 9Z)-6, 9-十五二烯基]-4(1H)-喹诺酮和羟基吴茱萸卡品碱。M26的准分子离子峰为m/z 302.175 1 ([M+H]⁺, C₁₈H₂₄NO₃), 比1-甲基-2-正壬基-4(1H)-喹诺酮多2个O、2个H和1个CH₂基团, 且二级碎片和1-甲基-2-正壬基-4(1H)-喹诺酮一致, 因此M26为双羟基氢化甲基化1-甲基-2-正壬基-4(1H)-喹诺酮。M19的准分子离子峰为m/z 288.159 7 ([M+H]⁺, C₁₇H₂₂NO₃), 比吴茱萸卡品碱少1个CH₂和1个C₅H₁₀基团并多2个O, 推测吴茱萸卡品碱失去N上的甲基, 同时侧链的烯键断裂, 失去C₅H₁₀的烷基碎片, 进而双羟基化所得, 因此M19为去甲基去正戊烷基吴茱萸卡品碱的双羟基化产物。

M2和M5的准分子离子峰分别为m/z 512.167 4 ([M+H]⁺, C₂₅H₂₆N₃O₉)和m/z 512.165 9 ([M+H]⁺, C₂₅H₂₆N₃O₉), 在质谱中表现为连接的葡糖醛酸的信号不稳定, 易断裂, 丢失176 Da, 从而得到双羟基吴茱萸碱的特征碎片m/z336.134 2, 因此推测M2和M5为双羟基吴茱萸碱的葡糖醛酸化产物, 二者为同分异构体。同理, M12为¹⁴N-甲酰二氢吴茱萸次碱的葡糖醛酸化产物; M20、M22和M27均为羟基吴茱萸次碱的葡糖醛酸化产物, 三者互为同分异构体; M4和M21分别为双羟基去氢吴茱萸碱和羟基吴茱萸碱的葡糖醛酸化产物。

2.2.2 酚酸类代谢产物分析

M6的准分子离子峰为m/z 367.103 1 ([M-H]^-, C₁₇H₁₉O₉), 比绿原酸多一个CH₂基团, 因此M6为甲基绿原酸^[24]。M1的准分子离子峰为m/z 273.006 8 ([M-H]^-, C₁₀H₉O₇S), 比咖啡酸多1个CH₂和1个SO₃基团, 其余二级碎片与咖啡酸一致, 因此M1为甲基硫酸化咖啡酸; M3的准分子离子峰为m/z 207.065 1 ([M-H]^-, C₁₁H₁₁O₄), 比咖啡酸多2个CH₂基团, 其余二级碎片与咖啡酸一致, 因此M3为双甲基咖啡酸。M8的准分子离子峰为m/z 343.139 4 ([M-H]^-, C₁₆H₂₃O₈), 比松柏苷多2个H, 因此M8为氢化松柏苷。

2.2.3 柠檬苦素类代谢产物分析

M23和M28的准分子离子峰分别为m/z 485.181 9 ([M-H]^-, C₂₆H₂₉O₉)和m/z 485.180 9 ([M-H]^-, C₂₆H₂₉O₉), 比柠檬苦素多1个O, 其余二级碎片与柠檬苦素一致, 因此M23和M28为羟基柠檬苦素, 二者互为同分异构体; M25的准分子离子峰为m/z 489.213 3 ([M-H]^-, C₂₆H₃₃O₉), 比柠檬苦素多4个H和1个O, 推测柠檬苦素中的2个羰基被还原, 同时发生羟基化, 其余二级碎片与柠檬苦素一致, 因此M25为双氢化羟基柠檬苦素。

讨论

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本研究在血浆中共检测到吴茱萸卡品碱和二氢吴茱萸卡品碱2个生物碱类原形成分。文献^[18]报道大鼠口服吴茱萸醇提物后, 血浆中除以上2个成分外, 还检测到吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和¹⁴N-甲酰二氢吴茱萸次碱4个生物碱原形, 分析是由于醇提物中生物碱类成分的含量远高于水提物。同时, 本实验在血浆中还检测到7个生物碱羟基化或葡糖醛酸化的代谢产物。在尿液中生物碱类成分代谢产物共检测到13个, 均发生Ⅰ相羟基化或Ⅱ相葡糖醛酸化, 转化为极性较大的代谢产物而排泄, 与文献^[25]报道的单体代谢结果一致。但是, 文献^[25]中羟基去氢吴茱萸碱与硫酸结合的Ⅱ相代谢产物在本实验中未检测到。在粪便中检测到12个生物碱类原形成分, 代谢类型除了文献报道的Ⅰ相羟基化和Ⅱ相葡糖醛酸化^[15]外, 还有氢化和甲基化的Ⅰ相代谢。

酚酸类成分以绿原酸和咖啡酸为主, 在血浆中只检测到咖啡酸的代谢产物, 推测绿原酸是通过水解为咖啡酸后, 再以代谢产物的形式吸收入血。与文献报道绿原酸口服不易吸收, 但是可以在肠道菌群的作用下水解为咖啡酸后被吸收的结果一致^[26]。酚酸类成分在大鼠体内代谢形式主要是甲基化和硫酸化。

在尿液中检测到异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷和异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷2个黄酮苷的原形, 在粪便中检测到金丝桃苷的原形。在水提物中存在的另外3个黄酮苷类成分[异鼠李素-3-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、柠檬黄素-3-O-β-D-芸香糖苷和异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷]在水提物中含量较低, 未在血浆、尿液和粪便样品中检测到其相关代谢产物。

柠檬苦素经尿液或粪便以原形及代谢产物的形式排出体外, 主要发生Ⅰ相代谢, 包括羟基化及氢化。

此外, 在复杂的机体环境下, 吴茱萸碱、吴茱萸次碱和去氢吴茱萸碱之间由于结构相似, 可能存在相互转化。因此, M7和M17、M24和M29也可能分别是吴茱萸碱和吴茱萸次碱的代谢产物。同时, 由于现有技术的局限性, 使得诸如M2和M5、M15和M18等同分异构体的结构无法被确证。但是本研究对吴茱萸水提物中各类成分的体内代谢有了初步的认识, 为进一步阐明吴茱萸体内药效物质奠定了基础。

基金

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国家自然科学基金资助项目(31200244)
中医药行业科研专项资助项目(201507002-3)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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2017年第52卷第7期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0038

接收时间：2017-01-09
首发时间：2026-01-14
出版时间：2017-07-12

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作者

出版历史

收稿日期：2017-01-09
修回日期：2017-03-14

基金

国家自然科学基金资助项目(31200244)

中医药行业科研专项资助项目(201507002-3)

作者信息

1.山西医科大学, 山西太原 030001

2.中国中医科学院中药研究所, 中药质量控制技术国家工程实验室/国家中医药管理局中药过程控制技术重点研究室, 北京 100700

通讯作者:

* 闫利华, E-mail:yanlihua2829@163.com;

赵正保, E-mail:zhengbao_z@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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