药学学报

No.	Gene Name	Sequence (5'-3')
Contig1	CaM1	F: TCGGTATCCTTCATCTTCC R: GAGGTCACTTGGACAGAA
Contig10	CaM3	F: TCGGAGTCTGTGTCTTTC R: AATGAAGGACACCGACTC
Contig6	CBL4	F: TCCATCCTGGTCAATGTC R: ACTTCTGTGTGAGTCTGAG
Contig11	CBL6	F: CTACGACTTGAGGCATACT R: CTACTACATCATCGGACAGA
Contig262	CDPK11	F: CCTCAACAACTCCTACAATG R: GGCTGGTCACAAGAATATAG
Contig363	CDPK20	F: TCTCGCAACCTACATCAG R: CAGCACTCCAAACATCAG
Contig47	CIPK2	F: GAAGATATTGGACGAGGGTA R: TGGTCTTGTGAGAGTAGTG
Contig351	CIPK10	F: GAAACCCTGAGACCTTGA R: GAGCGTAAGTCTTGATGATG
Contig455	CIPK20	F: CTTATCCTCGTGCTTGGA R: GTGTGGCGTTATTCTCTATG
Contig33	CML2	F: ACGGAGGATCAGTTGAAG R: CTGCCATCACCATCTGTA
Contig139	CML6	F: AATCTCCCTAACCGAACTC R: GTCTAACTCCGACATTATGC
Contig9	CRK3	F: CCTTCATCGCATCAGTTG R: TCCACAGTTAGCCTATCTTC

No.	Gene Name	Sequence (5'-3')
Contig1	CaM1	F: TCGGTATCCTTCATCTTCC R: GAGGTCACTTGGACAGAA
Contig10	CaM3	F: TCGGAGTCTGTGTCTTTC R: AATGAAGGACACCGACTC
Contig6	CBL4	F: TCCATCCTGGTCAATGTC R: ACTTCTGTGTGAGTCTGAG
Contig11	CBL6	F: CTACGACTTGAGGCATACT R: CTACTACATCATCGGACAGA
Contig262	CDPK11	F: CCTCAACAACTCCTACAATG R: GGCTGGTCACAAGAATATAG
Contig363	CDPK20	F: TCTCGCAACCTACATCAG R: CAGCACTCCAAACATCAG
Contig47	CIPK2	F: GAAGATATTGGACGAGGGTA R: TGGTCTTGTGAGAGTAGTG
Contig351	CIPK10	F: GAAACCCTGAGACCTTGA R: GAGCGTAAGTCTTGATGATG
Contig455	CIPK20	F: CTTATCCTCGTGCTTGGA R: GTGTGGCGTTATTCTCTATG
Contig33	CML2	F: ACGGAGGATCAGTTGAAG R: CTGCCATCACCATCTGTA
Contig139	CML6	F: AATCTCCCTAACCGAACTC R: GTCTAACTCCGACATTATGC
Contig9	CRK3	F: CCTTCATCGCATCAGTTG R: TCCACAGTTAGCCTATCTTC

Name	R. glutinosa Gene Name	Accession No.	Putative name of gene in Arabidopsis thaliana	Identity /%	Nucleotide length (ORF)	Protein length	Localization
a. CaM
1	CaM1	Contig1	AT5G21274.1	81	1 004 (450)	149	-
2	CaM2	Contig6	AT4G14640.1	85	698 (453)	150	-
3	CaM3	Contig10	AT3G56800.1	83	1 143 (450)	149	-
4	CaM4	Contig46	AT3G56800.1	85	1 287 (450)	149	-
5	CaM5	Contig92	AT5G21274.1	80	990 (450)	149	-
b. CBL
6	CBL1	Contig1	AT4G33000.3	78	1 303 (759)	252	S
7	CBL2	Contig3	AT4G26570.1	82	1 191 (684)	227	S
8	CBL3	Contig4	AT4G26570.1	83	1 219 (735)	224	S
9	CBL4	Contig6	AT4G17615.1	81	1 400 (642)	213	-
10	CBL5	Contig9	AT5G24270.2	79	1 370 (678)	225	M
11	CBL6	Contig11	AT5G24270.2	96	1 455 (648)	215	-
12	CBL7	Contig12	AT4G33000.3	78	1 077 (756)	251	-
13	CBL8	Contig17	AT4G26570.1	84	1 579 (675)	224	S
14	CBL9	Contig18	AT5G24270.2	84	754 (618)	205	M
15	CBL10	Contig19	AT4G26570.1	82	2 446 (681)	226	S
16	CBL11	Contig20	AT4G26570.1	82	2 220 (684)	227	S
17	CBL12	Contig21	AT4G17615.2	91	1 134 (660)	219	-
c. CDPK
18	CDPK1	Contig129	AT4G36070.2	80	2 416 (1 782)	593	C
19	CDPK2	Contig132	AT4G21940.2	79	2 298 (1 635)	544	-
20	CDPK3	Contig141	AT5G23580.1	79	2 344 (1 593)	530	C
21	CDPK4	Contig156	AT1G76040.1	79	1 855 (1 584)	527	C
22	CDPK5	Contig225	AT1G74740.1	78	2 263 (1 629)	542	C
23	CDPK6	Contig228	AT1G35670.1	79	1 687 (1 491)	496	M
24	CDPK7	Contig247	AT4G23650.1	76	2 017 (1 545)	514	C
25	CDPK8	Contig248	AT5G12480.1	79	2 142 (1 596)	531	-
26	CDPK9	Contig249	AT5G19450.2	79	2 505 (1 596)	531	-
27	CDPK10	Contig261	AT2G17290.1	82	2 559 (1 707)	568	-
28	CDPK11	Contig262	AT2G17290.1	82	2 623 (1 707)	568	-
29	CDPK12	Contig265	AT3G51850.1	77	2 067 (1 587)	528	-
30	CDPK13	Contig267	AT1G74740.1	81	1 951 (1 629)	542	-
31	CDPK14	Contig268	AT1G74740.1	78	2 466 (1 629)	542	-
32	CDPK15	Contig305	AT1G50700.1	77	2 504 (1 554)	517	-
33	CDPK16	Contig321	AT5G04870.1	77	2 720 (1 866)	621	-
34	CDPK17	Contig339	AT2G17290.1	82	2 525 (1 707)	568	-
35	CDPK18	Contig343	AT1G12580.1	80	2 900 (1 479)	492	M
36	CDPK19	Contig350	AT3G51850.1	78	2 309 (1 587)	528	-
37	CDPK20	Contig363	AT1G12580.1	80	2 915 (1 476)	491	M
38	CDPK21	Contig260	AT1G74740.1	81	2 262 (1 629)	542	C
d. CIPK
39	CIPK1	Contig44	AT4G14580.1	89	1 989 (1 335)	444	-
40	CIPK2	Contig47	AT5G21326.1	87	2 678 (1 443)	480	M
41	CIPK3	Contig48	AT2G26980.5	80	1 957 (1 320)	439	M
42	CIPK4	Contig79	AT1G01140.3	79	2 030 (1 332)	443	M
43	CIPK5	Contig92	AT4G24400.2	87	2 194 (1 341)	446	-
44	CIPK6	Contig138	AT5G58380.1	81	2 768 (1 359)	452	-
45	CIPK7	Contig165	AT1G30270.1	81	3 170 (1 122)	373	-
46	CIPK8	Contig196	AT2G30362.1	83	1 730 (1 263)	420	-
47	CIPK9	Contig337	AT2G30360.1	78	2 398 (1 314)	437	-
48	CIPK10	Contig341	AT1G01140.3	79	2 046 (1 323)	440	M
49	CIPK11	Contig351	AT5G58380.1	87	2 555 (1 359)	452	-
50	CIPK12	Contig362	AT2G26980.5	80	1 937 (1 320)	439	M
51	CIPK13	Contig373	AT4G18700.1	84	1 951 (1 401)	466	-
52	CIPK14	Contig395	AT1G30270.1	79	3 368 (1 401)	466	C
53	CIPK15	Contig402	AT5G01820.1	82	3 018 (1 311)	436	-
54	CIPK16	Contig409	AT4G24400.2	80	2 237 (1 341)	446	-
55	CIPK17	Contig430	AT4G30960.1	81	1 999 (1 287)	428	-
56	CIPK18	Contig431	AT5G45810.1	84	2 095 (1 359)	452	-
57	CIPK19	Contig437	AT5G45820.1	86	3 004 (1 383)	460	-
58	CIPK20	Contig455	AT4G30960.1	81	1 991 (1 296)	431	-
59	CIPK21	Contig488	AT4G18700.1	82	2 897 (1 431)	476	-
e. CML
60	CML1	Contig1	AT3G50770.1	88	1 229 (471)	156	-
61	CML2	Contig33	AT1G32250.1	81	996 (495)	164	-
62	CML3	Contig51	AT5G63960.2	100	1 243 (669)	222	C
63	CML4	Contig56	AT5G63960.2	100	1 118 (753)	250	C
64	CML5	Contig82	AT5G39670.1	81	856 (567)	188	S
65	CML6	Contig139	AT5G67360.1	95	1 423 (456)	151	-
66	CML7	Contig147	AT4G23260.2	100	1 204 (495)	164	-
67	CML8	Contig156	AT5G63960.2	80	1 078 (756)	251	C
68	CML9	Contig196	AT1G12310.1	79	836 (444)	147	-
69	CML10	Contig234	AT2G27480.1	91	1 146 (792)	263	-
70	CML11	Contig241	AT4G13730.3	100	1 541 (666)	221	C
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72	CML13	Contig281	AT1G24620.1	90	855 (582)	193	M
73	CML14	Contig286	AT5G39670.1	86	993 (573)	190	S
74	CML15	Contig292	AT1G32250.1	81	828 (495)	164	-
75	CML16	Contig308	AT1G12310.1	78	911 (444)	147	-
f. CRK
76	CRK1	Contig2	AT3G50530.1	81	2 519 (1 845)	614	-
77	CRK2	Contig5	AT2G46700.1	79	2 385 (1 821)	606	-
78	CRK3	Contig9	AT2G41140.1	79	2 327 (1 827)	608	-
79	CRK4	Contig15	AT2G41140.1	78	1 997 (1 731)	576	C
80	CRK5	Contig25	AT5G24430.1	85	2 538 (1 785)	594	-
81	CRK6	Contig48	AT3G50530.1	80	1 697 (1 251)	416	-
82	CRK7	Contig152	AT2G41140.1	79	2 764 (1 740)	579	-
83	CRK8	Contig155	AT2G41140.1	79	2 800 (1 740)	579	C
84	CRK9	Contig200	AT3G50530.1	80	2 563 (1 845)	614	-

Name	R. glutinosa Gene Name	Accession No.	Putative name of gene in Arabidopsis thaliana	Identity /%	Nucleotide length (ORF)	Protein length	Localization
a. CaM
1	CaM1	Contig1	AT5G21274.1	81	1 004 (450)	149	-
2	CaM2	Contig6	AT4G14640.1	85	698 (453)	150	-
3	CaM3	Contig10	AT3G56800.1	83	1 143 (450)	149	-
4	CaM4	Contig46	AT3G56800.1	85	1 287 (450)	149	-
5	CaM5	Contig92	AT5G21274.1	80	990 (450)	149	-
b. CBL
6	CBL1	Contig1	AT4G33000.3	78	1 303 (759)	252	S
7	CBL2	Contig3	AT4G26570.1	82	1 191 (684)	227	S
8	CBL3	Contig4	AT4G26570.1	83	1 219 (735)	224	S
9	CBL4	Contig6	AT4G17615.1	81	1 400 (642)	213	-
10	CBL5	Contig9	AT5G24270.2	79	1 370 (678)	225	M
11	CBL6	Contig11	AT5G24270.2	96	1 455 (648)	215	-
12	CBL7	Contig12	AT4G33000.3	78	1 077 (756)	251	-
13	CBL8	Contig17	AT4G26570.1	84	1 579 (675)	224	S
14	CBL9	Contig18	AT5G24270.2	84	754 (618)	205	M
15	CBL10	Contig19	AT4G26570.1	82	2 446 (681)	226	S
16	CBL11	Contig20	AT4G26570.1	82	2 220 (684)	227	S
17	CBL12	Contig21	AT4G17615.2	91	1 134 (660)	219	-
c. CDPK
18	CDPK1	Contig129	AT4G36070.2	80	2 416 (1 782)	593	C
19	CDPK2	Contig132	AT4G21940.2	79	2 298 (1 635)	544	-
20	CDPK3	Contig141	AT5G23580.1	79	2 344 (1 593)	530	C
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31	CDPK14	Contig268	AT1G74740.1	78	2 466 (1 629)	542	-
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d. CIPK
39	CIPK1	Contig44	AT4G14580.1	89	1 989 (1 335)	444	-
40	CIPK2	Contig47	AT5G21326.1	87	2 678 (1 443)	480	M
41	CIPK3	Contig48	AT2G26980.5	80	1 957 (1 320)	439	M
42	CIPK4	Contig79	AT1G01140.3	79	2 030 (1 332)	443	M
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47	CIPK9	Contig337	AT2G30360.1	78	2 398 (1 314)	437	-
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49	CIPK11	Contig351	AT5G58380.1	87	2 555 (1 359)	452	-
50	CIPK12	Contig362	AT2G26980.5	80	1 937 (1 320)	439	M
51	CIPK13	Contig373	AT4G18700.1	84	1 951 (1 401)	466	-
52	CIPK14	Contig395	AT1G30270.1	79	3 368 (1 401)	466	C
53	CIPK15	Contig402	AT5G01820.1	82	3 018 (1 311)	436	-
54	CIPK16	Contig409	AT4G24400.2	80	2 237 (1 341)	446	-
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56	CIPK18	Contig431	AT5G45810.1	84	2 095 (1 359)	452	-
57	CIPK19	Contig437	AT5G45820.1	86	3 004 (1 383)	460	-
58	CIPK20	Contig455	AT4G30960.1	81	1 991 (1 296)	431	-
59	CIPK21	Contig488	AT4G18700.1	82	2 897 (1 431)	476	-
e. CML
60	CML1	Contig1	AT3G50770.1	88	1 229 (471)	156	-
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62	CML3	Contig51	AT5G63960.2	100	1 243 (669)	222	C
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65	CML6	Contig139	AT5G67360.1	95	1 423 (456)	151	-
66	CML7	Contig147	AT4G23260.2	100	1 204 (495)	164	-
67	CML8	Contig156	AT5G63960.2	80	1 078 (756)	251	C
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69	CML10	Contig234	AT2G27480.1	91	1 146 (792)	263	-
70	CML11	Contig241	AT4G13730.3	100	1 541 (666)	221	C
71	CML12	Contig244	AT5G04170.1	79	1 301 (891)	296	C
72	CML13	Contig281	AT1G24620.1	90	855 (582)	193	M
73	CML14	Contig286	AT5G39670.1	86	993 (573)	190	S
74	CML15	Contig292	AT1G32250.1	81	828 (495)	164	-
75	CML16	Contig308	AT1G12310.1	78	911 (444)	147	-
f. CRK
76	CRK1	Contig2	AT3G50530.1	81	2 519 (1 845)	614	-
77	CRK2	Contig5	AT2G46700.1	79	2 385 (1 821)	606	-
78	CRK3	Contig9	AT2G41140.1	79	2 327 (1 827)	608	-
79	CRK4	Contig15	AT2G41140.1	78	1 997 (1 731)	576	C
80	CRK5	Contig25	AT5G24430.1	85	2 538 (1 785)	594	-
81	CRK6	Contig48	AT3G50530.1	80	1 697 (1 251)	416	-
82	CRK7	Contig152	AT2G41140.1	79	2 764 (1 740)	579	-
83	CRK8	Contig155	AT2G41140.1	79	2 800 (1 740)	579	C
84	CRK9	Contig200	AT3G50530.1	80	2 563 (1 845)	614	-

地黄钙信号体系相关基因的鉴定及其在连作条件下响应特征分析

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杨楚韵 ¹ , 李鑫宇 ³ , 李明杰 ¹^,² , 冯法节 ¹ , 古力 ¹ , 张宝 ¹ , 陈淑强 ¹ , 陈爱国 ¹ , 张重义 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2017,52(12): 1951-1961

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药学学报 | 研究论文 2017, 52(12): 1951-1961

地黄钙信号体系相关基因的鉴定及其在连作条件下响应特征分析

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杨楚韵¹, 李鑫宇³, 李明杰¹^,², 冯法节¹, 古力¹, 张宝¹, 陈淑强¹, 陈爱国¹, 张重义¹^,²^,^*

作者信息

1.福建农林大学作物科学学院, 福建福州 350002

2.福建农林大学福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室, 福建福州 350002

3.河南农业大学农学院, 河南郑州 450002

通讯作者:

* 张重义, Tel:86-591-83742793, E-mail:hauzzy@163.com

Identification and analysis of the calcium signaling system genes responding to continuous cropping injury in Rehmannia glutinosa L.

Chu-yun YANG¹, Xin-yu LI³, Ming-jie LI¹^,², Fa-jie FENG¹, Li GU¹, Bao ZHANG¹, Shu-qiang CHEN¹, Ai-guo CHEN¹, Zhong-yi ZHANG¹^,²^,^*

Affiliations

1. College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

2. Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

3. Agricultural College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

出版时间: 2017-12-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0488

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摘要

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钙信号是植物响应胁迫的重要系统之一，前期研究发现钙信号参与了连作地黄感知、传导和响应连作胁迫的进程。为了确证钙信号在地黄连作障碍形成过程中的作用方式，本研究在前期地黄大容量转录组基础上，利用生物信息学方法详细鉴定地黄钙信号转导体系相关蛋白的编码基因，并对其在连作和头茬地黄中的表达模式进行分析。同时，采用焦锑酸盐法和钙荧光染色法测定连作和头茬地黄根细胞中钙离子浓度差异。鉴定出5个CaMs、12个CBLs、21个CDPKs、21个CIPKs、16个CMLs和9个CRKs等84个钙信号体系相关基因。通过对连作和头茬地黄钙信号体系相关基因差异表达模式进行分析，发现连作效应增强了地黄钙信号体系中关键基因的表达。进一步利用qRT-PCR方法对12个关键的钙信号转导相关基因进行表达验证，确证了钙信号响应了连作胁迫进程。此外，2种钙离子浓度检测方法也均证实连作胁迫显著促进了地黄胞内钙离子的积累。本研究从分子和细胞水平上确证了钙信号在地黄连作障碍形成中扮演着重要角色，为进一步从分子水平上解读地黄连作障碍的形成机制奠定了基础。

关键词

地黄 / 连作障碍 / 自毒作用 / 钙信号体系 / 钙离子浓度

Abstract

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Calcium signaling plays a critical role in response to various abiotic and biotic stresses in plants. Preliminarily evidence showed that calcium signaling perceived and transduced the harmful signaling generated from continuous cropping stress in R. glutinosa. To investigate the roles of calcium signaling in continuous cropping injury formation, the key genes involved in calcium signaling transduction were identified in R. glutinosa transcriptome through bioinformatic methods. Furthermore, the calcium ion concentration in both normal and continuous cropping R. glutinosa root cells were measured by potassium pyroantimonate precipitation and calcium fluorescence method. As a result, a set of 84 calcium signaling-related genes, including 5 CaMs, 12 CBLs, 21 CDPKs, 21 CIPKs, 16 CMLs, and 9 CRKs were captured in R. glutinosa transcriptome. The analysis of expression profile in continuous cropping compared to normal growth R. glutinosa indicated that continuous cropping stress significantly increased the expression of calcium signaling-related genes in continuous cropping R. glutinosa. At the same time, the abundance levels of 12 calcium signaling-related genes quantified by qPCR further validated the high expression of calcium signaling-related genes presented in continous cropping R. glutinosa. In addition, the continuous cropping condition significantly promoted the accumulation of intracellular calcium ions in R. glutinosa based on two methods of potassium pyroantimonate precipitation and calcium fluorescence. This study verified the possible roles of calcium signaling in the formation of continuous cropping injury on molecular and cellular level, which lays a solid foundation for illuminating formation mechanism of continuous cropping injury on molecular level.

Key words

Rehmannia glutinosa L / continuous cropping injury / autotoxicity / calcium signaling system / calcium ion concentration

引用本文

杨楚韵, 李鑫宇, 李明杰, 冯法节, 古力, 张宝, 陈淑强, 陈爱国, 张重义. 地黄钙信号体系相关基因的鉴定及其在连作条件下响应特征分析. 药学学报, 2017 , 52 (12) : 1951 -1961 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0488

Chu-yun YANG, Xin-yu LI, Ming-jie LI, Fa-jie FENG, Li GU, Bao ZHANG, Shu-qiang CHEN, Ai-guo CHEN, Zhong-yi ZHANG. Identification and analysis of the calcium signaling system genes responding to continuous cropping injury in Rehmannia glutinosa L.[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017 , 52 (12) : 1951 -1961 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0488

正文

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地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)是玄参科地黄属多年生草本植物, 栽培历史悠久, 是我国常用大宗药材之一。然而, 在地黄的生产中连作障碍问题却十分严重, 连作地黄植株表现为生长不良、病虫害加重、块根不能正常膨大, 其产量和品质明显下降, 甚至绝收, 且每茬收获后须隔8~10年方可再种^[1], 严重制约了道地药材地黄资源的可持续利用和区域经济的发展。目前关于栽培植物连作障碍的研究虽有大量报道, 但其具体形成机制仍不明晰, 越来越多的证据表明:连作地黄根际化感物质的积累及其所诱导根际微生态群体失衡是连作障碍形成的根本原因^[2-7]。然而, 地黄的根际环境恶化仅伤害其自身, 对后茬其他作物并无伤害, 这表明地黄体内有独特的信号感知系统, 响应了连作地黄的化感自毒物质或失衡的微生态环境^{[8, 9]}。为了揭示连作植物对根际灾变环境的分子响应机制, 课题组前期通过连作和头茬地黄差异表达基因、差异表达蛋白和相关的实验均发现, 钙信号系统在地黄连作障碍形成过程中扮演着重要的角色^{[10, 11]}。同时, 在水稻、黄瓜、人参等作物的连作障碍的研究中同样发现钙信号可以被连作特异地诱导^[12-14]。因此, 钙信号体系与栽培植物连作障碍的形成可能具有密切的关系。

钙信号体系主要包括钙编码系统和钙信号感知与传递系统。钙信号编码系统是当植物遭受外界胁迫因子或其他刺激条件时, 细胞质内的钙离子在时间、空间及浓度上会产生特异性的变化, 形成特征性“钙峰”^[15-19], 这些特征信号往往蕴含着重要的“外界刺激”信息。植物为了将这些具有标志性的信息解码并传递给下游信号通路, 需要一套重要信号传递受体和蛋白。钙调素(CaM)、钙依赖蛋白激酶(CDPK)、钙磷脂酶(CBL)是迄今已经被证明的分布最广、分子结构高度保守的钙靶蛋白, 每种钙感知蛋白均包含着大量的家族成员, 每个家族成员又可以激活大量的下游转录因子。此外, 钙信号和其他信号转导通路之间亦存在着大量的交叉, 可以相互激活、相互反馈、相互调节^{[20, 21]}。正是由于这些多样化的钙信号传导蛋白家族成员的存在, 植物体内信号传递网络才会更加复杂、多样, 也才能保证植物细胞能将多样化的刺激进行精准传递。在连作条件下, 植物遭受着根际化感自毒物质、有害病原微生物等多种因素的直接或间接胁迫, 并且多种胁迫因子交叉在一起形成连作所特有的复杂胁迫逆境。前期课题组通过设置不同逆境胁迫条件研究连作胁迫的属性, 发现连作胁迫包含了不同胁迫的特征属性^{[22, 23]}, 可以推论地黄体内的钙信号刺激响应可能是不同复合作用的结果, 或者不同胁迫因子诱发钙信号交叉结果。因此, 如何筛选连作特异的钙信号或者化感自毒物质、连作特异有害微生物诱发的特异信号对于了解地黄连作障碍形成分子机制和实行彻底的分子治疗具有重要的意义。虽然不同的逆境胁迫因子引发的钙信号会在变化幅度、时间及空间分布上有所不同(即产生了不同特征的“钙信号”), 但现有技术手段对此还无法区分, 也就无法利用这些特征将响应自毒物质的特异信号提取出来。然而钙信号体系的传递蛋白往往具有特定胁迫响应特征和属性, 可以通过钙信号的解码蛋白对连作特异的信号转导途径进行鉴定。因此, 对钙信号传递蛋白通路中的各个成员进行精细鉴定, 研究其在连作障碍形成过程中的分子行为, 对于理解连作障碍形成复杂胁迫背景下钙信号的作用具有重要意义。

本课题组在前期大容量转录组文库基础上研究其在连作障碍形成过程中的分子行为, 对于理解连作障碍形成复杂胁迫背景下钙信号的作用具有重要意义。详细鉴定地黄所有钙信号感知与传递系统蛋白的基因, 并详细分析其在地黄连作障碍形成中的表达模式, 筛选出连作胁迫下地黄体内钙信号基因的响应状况。同时, 进一步通过焦锑酸盐钙离子原位沉淀法和钙荧光指示剂法测定钙离子浓度以直接确证连作地黄中钙信号的作用。本研究为揭示钙信号体系相关基因在地黄连作障碍形成过程中的作用机制, 完善连作障碍形成的关键分子证据链提供重要的技术支撑。

材料与方法

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材料本研究以河南温县广泛种植的“温85-5”地黄品种(经河南省中医药研究院张留记研究员鉴定, 为Rehmannia glutinosa L.)为供试材料, 在福建农林大学中药材GAP研究所野外生态定位观测站(温县基地)选择试验田种植地黄, 以头茬地黄为对照、连作地黄为处理, 各设立3个重复。在地黄苗期、拉线期、块根膨大前期、块根膨大中期、块根膨大后期共5个不同生长时期^[24], 分别采集头茬与连作地黄根系鲜样, 液氮速冻, -80 ℃保存, 用于钙离子浓度及位置分布的检测。

地黄中钙信号传递系统相关基因的筛选和鉴定 在拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)中搜索并筛选出拟南芥CaM家族、CBL家族、CDPK家族、CIPK家族、CML家族、CRK家族的完整的核酸和氨基酸序列。以拟南芥钙信号传递蛋白家族基因的编码序列作为探针序列, 用Blastn工具在地黄转录组文库中进行同源比对检索(E值设为1×10^-20), 筛选出地黄中钙信号传递蛋白家族相关的候选编码基因。将上述所获取的地黄钙信号候选基因再次与地黄转录组原始数据进行比对, 筛选出具有同源性片段, 使用CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3)对原始数据重新组装去冗余, 获得相对完整的核苷酸序列。

地黄中钙信号体系相关基因的生物信息学分析 将筛选出的地黄钙信号体系相关基因序列通过ORF finder工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析其氨基酸和开放阅读框长度。同时, 用MEGA7.0对其进行家族分析(采用Neighbor-Joining算法, Bootstrap检测1 000次^[25]); 用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)和IBS1.0 (http://www.mybiosoftware.com/ibs-illustrator-of-biological-sequences/)预测其结构域并绘制蛋白结构图; 用Target P1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)预测其所处的细胞位置。

地黄中钙信号体系相关基因表达量分析 基于前期课题组所构建的连作和头茬地黄不同时期RNA-Seq测序结构^[26], 对本研究所获取的地黄钙信号体系相关基因的表达量进行重新统计, 获取连作和头茬地黄钙信号体系相关基因在苗期、拉线期、膨大前期、膨大中期、膨大后期等5个生长时期的表达量, 并将数据统一标准化(获取RPKM值)。为了对比分析钙信号体系相关基因在连作和头茬地黄中的表达模式差异, 分别以苗期地黄作为对照, 按照log₂ (拉线期/苗期)、log₂ (膨大前期/苗期)、log₂ (膨大中期/苗期)、log₂ (膨大后期/苗期)方式获取不同时期的表达量。随机选择12个钙信号相关基因, 用荧光实时定量PCR (qRT-PCR)验证钙信号相关基因在连作和头茬地黄发育过程中表达水平。利用Beacon Designer 8.0软件(http://beacon-designer.software.informer.com/8.0/)设计荧光定量引物(表 1)。

用Trizol法提取连作和头茬地黄不同时期根系的总RNA, 使用TaKaRa公司的PrimeScript™RT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA。用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法检测所选基因在连作和头茬地黄不同时期的表达水平。各cDNA样品分别用对应基因(表 1)和内参基因进行荧光实时定量PCR, 且每个反应重复3次。反应体系为25 μL: SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNase H Plus) 12.5 μL, cDNA模板2 μL, ddH₂O 8.5 μL, 引物各1 μL^[27]。PCR反应程序: 95.0 ℃ 2 min; 95.0 ℃ 5 s, 60.0 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s进行39个循环; 熔解曲线检测条件是95 ℃ 1 min, 60 ℃ 1 min, 然后以0.5 ℃·s^-1的速度提高到95 ℃, 连续检测荧光信号。基因的表达量以参照基因18S (DQ469606)作为标准进行相对定量分析, 相对定量方法采样普遍使用的是2^-ΔΔCt (Livak)方法^[28]。进行目的基因表达模式分析时, 计算同一个样品目的基因的Ct值, 取3个平行孔校正后Ct值的平均数。分别以连作与头茬地黄苗期样品的Ct值的平均数设为1, 进行基因表达分析。以内参18S进行校正, 数据处理使用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

利用钙离子荧光染料法测定头茬与连作地黄根尖组织内钙离子浓度 分别采集头茬与连作地黄拉线期的根尖, 清水轻洗干净, 剪取2 cm左右根尖, 放入含50 μmol·L^-1 Fluo-3/AM、50 mmol·L^-1山梨糖醇、1%皂素的溶液中, 4 ℃下避光孵育2 h, 水洗后转入50 mmol·L^-1山梨糖醇溶液, 20 ℃避光孵育2 h。将标记有Fluo-3/AM的根尖临时压片, 以未孵育Fluo-3/AM的根尖为对照, 在LSM510共聚焦荧光显微镜下进行观察拍照(激发波长为488 nm, 发射波长为535 nm)。

利用焦锑酸钾沉淀法测定头茬与连作地黄根尖组织内钙离子浓度 分别采集头茬和连作地黄拉线期的块根, 在解剖显微镜下将块根的分裂形成层组织切成1 mm × 1 mm × 2 mm的横切小块。经初固定、再固定、脱水、透明、树脂浸透、树脂包埋与聚合、切片、染色、镜检(JEM-1400型透射电镜)后, 进行对照处理, 将在电镜下已确定由焦锑酸钾沉淀的定位切片漂浮在100 mmol·L^-1 EGTA (pH 8.0)溶液中, 60 ℃处理1 h, 使EGTA与Ca²⁺螯合, 脱去原沉淀中的钙离子, 再置于电镜下观察与拍照。

结果与分析

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1 头茬与连作地黄根尖及块根组织内钙离子的浓度检测

分别采集地黄拉线期的头茬和连作根尖及块根, 利用共聚焦荧光显微技术在组织水平对钙离子在头茬和连作根尖区细胞内的分布进行了观察。在共聚焦荧光显微镜下观察到, 连作地黄根尖的荧光强度明显高于头茬地黄根尖的荧光强度(如图 1A~1D)。并且在头茬地黄根尖细胞内, 荧光信号只集中在细胞内的部分区域, 而在连作地黄细胞内的大部分区域都有强烈的荧光强度, 表明连作地黄细胞内出现了大量的钙离子积累。通过透射电镜观察焦锑酸钾钙离子原位沉淀超薄切片, 发现在头茬地黄拉线期的块根分裂形成层组织细胞内, 只有很少量的钙离子黑色沉淀颗粒, 多数都分布在细胞膜和液泡膜等膜结构上, 钙沉淀颗粒小而分散; 而在同期的连作地黄块根分裂形成层组织细胞内, 则存在大量的钙离子沉淀黑色颗粒, 除了在膜结构上分布有大量钙沉淀颗粒, 在细胞质和液泡内也存在有大量钙沉淀颗粒散乱分布, 钙沉淀颗粒大而集聚; 含有钙离子黑色沉淀颗粒的切片经EGTA处理之后, 在电镜下观察到在原有钙沉淀的地方出现空洞, 说明电镜下观察到的黑色颗粒为钙离子沉淀(如图 1a~1d)。超薄切片电镜观察结果表明在连作地黄细胞内钙离子浓度增加, 细胞质内出现大量游离钙离子积累。两种钙离子浓度的检测方法均说明连作胁迫的影响促使地黄细胞内钙离子大量积累, 导致钙离子介导的信号通路出现紊乱。

2 地黄中钙信号体系相关基因的筛选和鉴定

利用生物信息学方法在地黄转录组共筛选得到84条地黄钙信号感知与传递蛋白基因, 其中, 包括5个CaM家族基因、12个CBL家族基因、21个CDPK家族基因、21个CIPK家族基因、16个CML家族基因、9个CRK家族基因(表 2)。序列长度分析表明, 地黄CaM家族基因和拟南芥基因的平均相似度为83%, 基因平均长度为1 024 bp, 开放阅读框(ORF)长度均值为451 bp, 编码蛋白长度均值为149个氨基酸(aa); CBL家族基因和拟南芥基因的平均相似度为83%, 基因平均长度为1 429 bp, ORF长度均值为685 bp, 编码蛋白长度均值为226 aa; CDPK家族基因和拟南芥基因的平均相似度为79%, 基因平均长度为2 349 bp, ORF长度均值为1 619 bp, 编码蛋白长度均值为539 aa; CIPK家族基因和拟南芥基因的平均相似度为82%, 基因平均长度为2 382 bp, ORF长度均值为1 335 bp, 编码蛋白长度均值为444 aa; CML家族基因和拟南芥基因的平均相似度为88%, 基因平均长度为1 097 bp, ORF长度均值为597 bp, 编码蛋白长度均值为198 aa; CRK家族基因和拟南芥基因的平均相似度为80%, 基因平均长度为2 399 bp, ORF长度均值为1 732 bp, 编码蛋白长度均值为576 aa。采用Target P1.1分析其亚细胞定位预测结果表明, 有6个CBLs位于SP (signal peptide)、2个CMLs位于SP、2个CBLs位于mTP (mitochondrial targeting peptide)、3个CDPKs位于mTP、5个CIPKs位于mTP、1个CML位于mTP、6个CDPKs位于cTP (chloroplast transit peptide)、1个CIPK位于cTP、5个CMLs位于cTP、2个CRKs位于cTP。但仍有51个钙信号相关蛋白无法预测其相应的亚细胞位置。

3 地黄中钙信号体系相关基因的系统进化分析和蛋白结构域分析

通过对所有钙信号相关蛋白进行聚类分析发现, 所有地黄钙信号体系相关基因可被明显聚类为两个部分, 一类是CML、CaM、CBL, 拥有典型的EF-hand结构域, 另一类是CRK、CDPK、CIPK, 这两类的主要区别在于蛋白结构域中是否有蛋白激酶域。进一步对钙信号相关蛋白的保守结构域进行分析发现, (如图 2B)地黄中CaM、CBL和CML家族蛋白均只含有EF-hand结构域, CRK家族和CDPK家族大部分同时含有EF-hand域和protein kinase-like域, 而CIPK家族基因均含3个或4个结构域, 除含有EF-hand域和protein kinase-like域外, 个别蛋白同时还拥有NAF域和NAF/FISL域。

4 钙信号感知蛋白在地黄连作障碍形成中的表达模式

为了进一步阐明连作地黄钙信号相关基因对地黄连作胁迫的响应特征, 作者在前期RNA-seq数据的基础上, 对钙信号相关基因在连作和头茬中的表达模式进行重新定量。结果如图 2C表明, 在连作/头茬地黄不同生育阶段, 钙信号相关基因中, 有表达的基因共84个。对所有钙信号相关基因的表达模式聚类, 可以明显看出3种截然不同的表达模式, 第一种表达模式:在地黄发育进程中, 连作响应基因显著高于头茬, 此类基因共有37个; 第二种表达模式:在头茬和连作时期基因表达量均下调, 此类基因共有22个。第三种表达模式:基因表达量在头茬和连作不同时期存在上调情况但并不显著, 此类基因共有25个。此外, 第一个模式中的基因在连作条件下的响应和头茬条件下差异最大, 可能是响应连作特异的钙信号感知蛋白, 也是阐述地黄连作障碍机制的重要候选蛋白。

5 地黄中钙信号感知蛋白关键基因的表达模式分析

为了深入分析验证钙信号体系相关基因在连作中的功能方式, 本研究从上述钙信号体系相关基因中选取CaM1、CaM3、CBL4、CBL6、CDPK11、CDPK20、CIPK2、CIPK10、CIPK20、CML2、CML6和CRK3这12个基因, 用qRT-PCR方法详细研究其在地黄连作形成中的功能表达模式(图 3)。结果从连作和头茬地黄不同发育时期整体来看, 部分钙信号基因随发育时期其表达量相对增强, 而部分钙信号基因的表达量随着发育进程的推进表达量则逐渐降低。从连作和头茬地黄在不同时期的表达量来看绝大部分钙信号基因在连作地黄不同时期的表达量显著高于头茬地黄, 但是部分钙信号相关基因在特定时期在连作地黄中表达量相对低于头茬。比如, CaM1的表达量在连作地黄的4个时期均上调表达, CBL6、CML2、CIPK10和CBL4在拉线期、膨大前期和膨大后期在连作中的表达量均显著高于头茬; CIPK2在膨大前期、膨大中期和膨大后期在连作中的表达量均高于头茬; CRK3在连作条件下在拉线期和膨大后期上调表达; CaM3和CML6在膨大后期连作地黄中表达量显著高于头茬地黄; CIPK20在连作条件下除膨大中期以外, 其余3个时期均下调表达; CDPK11在连作地黄拉线期表达量上调, 其余时期均下调; CDPK20则在膨大中期连作地黄中表达量显著高于头茬地黄, 其余时期均下调。从钙信号相关基因在连作和头茬地黄的整体表达趋势来看, 不同钙信号编码蛋白可能在地黄连作障碍形成过程的不同阶段承担相应角色, 一些钙信号基因可能在连作障碍形成整个过程深入参与, 一些钙信号基因可能只在连作障碍形成的某个特定时期起作用, 这些钙信号更像钙信号主要转导途径的候补角色, 但整体而言这些钙信号的蛋白相互补充和相互增益显著介导和促进了地黄连作障碍的形成。

讨论

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在植物的生长发育过程中, 经常会遭受逆境胁迫的影响。植物在面对逆境胁迫时, 细胞膜会感知外界胁迫信号因子, 再通过膜受体的一系列磷酸化反应激活膜上的钙离子通道, 引发钙离子从钙库释放到细胞质中, 进而导致细胞质内钙离子浓度增加, 产生钙信号^{[29, 30]}。如Dias等^[31]发现在高温下小麦根中出现Ca²⁺积累, Tracy等^[32]发现NaCl的胁迫水平与钙离子的升高程度有着密切关系, Bita等^[33]发现热激能诱导拟南芥细胞内钙离子瞬时剧烈升高。因此, 越来越多的研究表明:钙信号传递系统是响应胁迫的重要系统, 而胞内钙离子浓度的增加是胁迫响应的一个主要标志^[34-36]。连作障碍形成及加重发生的原因不是单一或孤立的, 而是“栽培植物-土壤-微生物”系统内多种因素综合作用的结果, 其主要根源在自毒物质诱导下的根际微生态失衡^[37]。前期的大量研究表明药用植物化感自毒物质及其所诱发的环境灾变机制是连作障碍形成基本原因, 包含了连作植物体本身、微生物群体失衡和化感自毒物质影响等多元的胁迫因素。因此, 连作障碍就其本质而言同样是一种胁迫, 其体内的钙信号体系很有可能被扰动^[37-39]。比如: Biedrzycki等^[40]发现化感物质焦儿茶酸能引起拟南芥和白花蛇舌草细胞内钙离子浓度震荡, 并能引起钙信号系统调控基因的表达。Chi等^[12]发现化感物质胡桃醌(Juglone)能引起水稻根尖细胞内的钙积累, 显著诱导根部CDPK的上调表达。本研究利用焦锑酸钾沉淀法和钙信号荧光染色法详细研究了连作障碍形成过程中钙离子浓度的状态变化, 结果显示在连作地黄根尖组织细胞内, 钙离子浓度显著大于头茬, 并且钙离子在细胞内的分布散乱, 证实了连作条件下诱发了地黄根细胞内钙离子浓度的增加, 表明连作地黄体内的钙离子被大量释放。

外界胁迫所诱发的钙离子信号, 只有通过细胞内的钙调素(CaM)、钙依赖蛋白激酶(CDPK)、钙磷脂酶(CBL)等一系列靶蛋白才能最终诱发植物体内的一系列胁迫响应。钙靶蛋白又通过和其他靶蛋白分子结合而启动基因表达, 从而构成钙信号转导的复杂体系, 传递各种外界信号刺激。虽然课题组前期明确证实了钙信号参与地黄连作障碍的形成^{[7, 41]}, 但地黄中究竟是哪些钙信号传递了连作的伤害, 目前仍未被证实。本研究通过生物信息学、高通量测序的方法鉴定了共84个在地黄中特异表达的钙信号体系相关基因, 其中包括5个CaMs家族基因、12个CBLs家族基因、21个CDPKs家族、21个CIPKs家族基因、16个CMLs家族、9个CRKs家族基因。根据钙信号相关基因在连作和头茬地黄发育进程中的表达模式差异, 可以将地黄钙信号相关基因分为三种功能模式。第一种钙信号相关基因在连作地黄的发育进程中显著高于头茬, 这些钙信号基因很可能参与了地黄连作胁迫进程, 在连作障碍的形成中起着重要的作用; 第二种是钙信号相关基因表达量在头茬和连作地黄不同发育时期随着发育进程推进显著上调表达, 这些钙信号体系相关基因可能同时参与连作胁迫和地黄植株生理发育的过程; 第三种钙信号相关基因在连作和头茬地黄不同发育时期表达模式基本相似, 并且在不同发育时期其表达丰度变化不大, 这些基因可能在地黄发育进程中更多的是一种组成性表达, 可能与植物基本发育有关。

对于本研究而言, 更多关注的是第一类地黄钙信号基因, 这些基因表达与地黄连作障碍形成症状具有明显的契合性、同步性。对这类基因的详细解析可以进一步为深入地理解钙信号在连作障碍形成过程中的具体机制提供重要参考。本研究共获取了37个连作障碍中显著上调钙信号基因, 这些基因中值得注意的是CaM1、CBL6、CML2和CIPK10, 这4个基因在不同作物中已经有了较为明晰的功能。其中, CaM1在拟南芥细胞中与钙信号传递相关, 主要存在于保卫细胞、维管束和叶中, 有束缚钙离子的作用; CBL6在拟南芥全株中都有表达, 在花粉和胚的发育等过程中都有参与, 还有着束缚钙离子的作用; CML2在拟南芥的花和叶中有表达, 有束缚钙离子的功能; CIPK10在拟南芥的花、茎、根中都有表达, 能编码丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶, 在甘露醇影响下、低温胁迫、盐害条件下有响应作用。此外, 在第二种模式下, 连作和头茬地黄钙信号基因均为上调表达, 可能在地黄连作形成中具有双向的功能, 一方面参与了连作胁迫, 另一方面可能与植物正常发育进程密切相关。例如:在此类中CIPK13在拟南芥中有着结合ATP和调节激酶活性等作用, CIPK10既有结合钙离子的功能, 在信号转导过程中响应, 也能应答脱落酸和调节激酶活性等。此外, 前期实验证明钙信号除了参与连作胁迫响应外, 还与地黄的块根启动和发育密切相关^[42]。不同研究也证明了钙信号广泛参与了植物根系等进程, 虽然通过钙离子荧光信号检测发现头茬地黄的根系内钙离子荧光较低, 但仍然能够明显看见一些钙信号。可以推测并非所有的钙信号均对连作响应, 而部分钙信号承担着植物的基本生长发育功能, 因此, 这部分钙信号基因具有典型的双向调节功能, 适当的钙离子浓度可能促进了植物的发育, 而过多钙离子可能响应胁迫毒害。

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国家自然科学基金资助项目(81573538)
国家自然科学基金资助项目(81503193)
国家自然科学基金资助项目(81403042)
国家自然科学基金资助项目(81603243)
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高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(20123515110005)

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2017年第52卷第12期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0488

接收时间：2017-05-15
首发时间：2026-01-14
出版时间：2017-12-12

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收稿日期：2017-05-15
修回日期：2017-09-27

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国家自然科学基金资助项目(81503193)

国家自然科学基金资助项目(81403042)

国家自然科学基金资助项目(81603243)

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高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(20123515110005)

作者信息

1.福建农林大学作物科学学院, 福建福州 350002

2.福建农林大学福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室, 福建福州 350002

3.河南农业大学农学院, 河南郑州 450002

通讯作者:

* 张重义, Tel:86-591-83742793, E-mail:hauzzy@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

No.	Gene Name	Sequence (5'-3')
Contig1	CaM1	F: TCGGTATCCTTCATCTTCC R: GAGGTCACTTGGACAGAA
Contig10	CaM3	F: TCGGAGTCTGTGTCTTTC R: AATGAAGGACACCGACTC
Contig6	CBL4	F: TCCATCCTGGTCAATGTC R: ACTTCTGTGTGAGTCTGAG
Contig11	CBL6	F: CTACGACTTGAGGCATACT R: CTACTACATCATCGGACAGA
Contig262	CDPK11	F: CCTCAACAACTCCTACAATG R: GGCTGGTCACAAGAATATAG
Contig363	CDPK20	F: TCTCGCAACCTACATCAG R: CAGCACTCCAAACATCAG
Contig47	CIPK2	F: GAAGATATTGGACGAGGGTA R: TGGTCTTGTGAGAGTAGTG
Contig351	CIPK10	F: GAAACCCTGAGACCTTGA R: GAGCGTAAGTCTTGATGATG
Contig455	CIPK20	F: CTTATCCTCGTGCTTGGA R: GTGTGGCGTTATTCTCTATG
Contig33	CML2	F: ACGGAGGATCAGTTGAAG R: CTGCCATCACCATCTGTA
Contig139	CML6	F: AATCTCCCTAACCGAACTC R: GTCTAACTCCGACATTATGC
Contig9	CRK3	F: CCTTCATCGCATCAGTTG R: TCCACAGTTAGCCTATCTTC

No.

Gene Name

Sequence (5'-3')

Contig1

CaM1

F: TCGGTATCCTTCATCTTCC R: GAGGTCACTTGGACAGAA

Contig10

CaM3

F: TCGGAGTCTGTGTCTTTC R: AATGAAGGACACCGACTC

Contig6

CBL4

F: TCCATCCTGGTCAATGTC R: ACTTCTGTGTGAGTCTGAG

Contig11

CBL6

F: CTACGACTTGAGGCATACT R: CTACTACATCATCGGACAGA

Contig262

CDPK11

F: CCTCAACAACTCCTACAATG R: GGCTGGTCACAAGAATATAG

Contig363

CDPK20

F: TCTCGCAACCTACATCAG R: CAGCACTCCAAACATCAG

Contig47

CIPK2

F: GAAGATATTGGACGAGGGTA R: TGGTCTTGTGAGAGTAGTG

Contig351

CIPK10

F: GAAACCCTGAGACCTTGA R: GAGCGTAAGTCTTGATGATG

Contig455

CIPK20

F: CTTATCCTCGTGCTTGGA R: GTGTGGCGTTATTCTCTATG

Contig33

CML2

F: ACGGAGGATCAGTTGAAG R: CTGCCATCACCATCTGTA

Contig139

CML6

F: AATCTCCCTAACCGAACTC R: GTCTAACTCCGACATTATGC

Contig9

CRK3

F: CCTTCATCGCATCAGTTG R: TCCACAGTTAGCCTATCTTC

Name	R. glutinosa Gene Name	Accession No.	Putative name of gene in Arabidopsis thaliana	Identity /%	Nucleotide length (ORF)	Protein length	Localization
a. CaM
1	CaM1	Contig1	AT5G21274.1	81	1 004 (450)	149	-
2	CaM2	Contig6	AT4G14640.1	85	698 (453)	150	-
3	CaM3	Contig10	AT3G56800.1	83	1 143 (450)	149	-
4	CaM4	Contig46	AT3G56800.1	85	1 287 (450)	149	-
5	CaM5	Contig92	AT5G21274.1	80	990 (450)	149	-
b. CBL
6	CBL1	Contig1	AT4G33000.3	78	1 303 (759)	252	S
7	CBL2	Contig3	AT4G26570.1	82	1 191 (684)	227	S
8	CBL3	Contig4	AT4G26570.1	83	1 219 (735)	224	S
9	CBL4	Contig6	AT4G17615.1	81	1 400 (642)	213	-
10	CBL5	Contig9	AT5G24270.2	79	1 370 (678)	225	M
11	CBL6	Contig11	AT5G24270.2	96	1 455 (648)	215	-
12	CBL7	Contig12	AT4G33000.3	78	1 077 (756)	251	-
13	CBL8	Contig17	AT4G26570.1	84	1 579 (675)	224	S
14	CBL9	Contig18	AT5G24270.2	84	754 (618)	205	M
15	CBL10	Contig19	AT4G26570.1	82	2 446 (681)	226	S
16	CBL11	Contig20	AT4G26570.1	82	2 220 (684)	227	S
17	CBL12	Contig21	AT4G17615.2	91	1 134 (660)	219	-
c. CDPK
18	CDPK1	Contig129	AT4G36070.2	80	2 416 (1 782)	593	C
19	CDPK2	Contig132	AT4G21940.2	79	2 298 (1 635)	544	-
20	CDPK3	Contig141	AT5G23580.1	79	2 344 (1 593)	530	C
21	CDPK4	Contig156	AT1G76040.1	79	1 855 (1 584)	527	C
22	CDPK5	Contig225	AT1G74740.1	78	2 263 (1 629)	542	C
23	CDPK6	Contig228	AT1G35670.1	79	1 687 (1 491)	496	M
24	CDPK7	Contig247	AT4G23650.1	76	2 017 (1 545)	514	C
25	CDPK8	Contig248	AT5G12480.1	79	2 142 (1 596)	531	-
26	CDPK9	Contig249	AT5G19450.2	79	2 505 (1 596)	531	-
27	CDPK10	Contig261	AT2G17290.1	82	2 559 (1 707)	568	-
28	CDPK11	Contig262	AT2G17290.1	82	2 623 (1 707)	568	-
29	CDPK12	Contig265	AT3G51850.1	77	2 067 (1 587)	528	-
30	CDPK13	Contig267	AT1G74740.1	81	1 951 (1 629)	542	-
31	CDPK14	Contig268	AT1G74740.1	78	2 466 (1 629)	542	-
32	CDPK15	Contig305	AT1G50700.1	77	2 504 (1 554)	517	-
33	CDPK16	Contig321	AT5G04870.1	77	2 720 (1 866)	621	-
34	CDPK17	Contig339	AT2G17290.1	82	2 525 (1 707)	568	-
35	CDPK18	Contig343	AT1G12580.1	80	2 900 (1 479)	492	M
36	CDPK19	Contig350	AT3G51850.1	78	2 309 (1 587)	528	-
37	CDPK20	Contig363	AT1G12580.1	80	2 915 (1 476)	491	M
38	CDPK21	Contig260	AT1G74740.1	81	2 262 (1 629)	542	C
d. CIPK
39	CIPK1	Contig44	AT4G14580.1	89	1 989 (1 335)	444	-
40	CIPK2	Contig47	AT5G21326.1	87	2 678 (1 443)	480	M
41	CIPK3	Contig48	AT2G26980.5	80	1 957 (1 320)	439	M
42	CIPK4	Contig79	AT1G01140.3	79	2 030 (1 332)	443	M
43	CIPK5	Contig92	AT4G24400.2	87	2 194 (1 341)	446	-
44	CIPK6	Contig138	AT5G58380.1	81	2 768 (1 359)	452	-
45	CIPK7	Contig165	AT1G30270.1	81	3 170 (1 122)	373	-
46	CIPK8	Contig196	AT2G30362.1	83	1 730 (1 263)	420	-
47	CIPK9	Contig337	AT2G30360.1	78	2 398 (1 314)	437	-
48	CIPK10	Contig341	AT1G01140.3	79	2 046 (1 323)	440	M
49	CIPK11	Contig351	AT5G58380.1	87	2 555 (1 359)	452	-
50	CIPK12	Contig362	AT2G26980.5	80	1 937 (1 320)	439	M
51	CIPK13	Contig373	AT4G18700.1	84	1 951 (1 401)	466	-
52	CIPK14	Contig395	AT1G30270.1	79	3 368 (1 401)	466	C
53	CIPK15	Contig402	AT5G01820.1	82	3 018 (1 311)	436	-
54	CIPK16	Contig409	AT4G24400.2	80	2 237 (1 341)	446	-
55	CIPK17	Contig430	AT4G30960.1	81	1 999 (1 287)	428	-
56	CIPK18	Contig431	AT5G45810.1	84	2 095 (1 359)	452	-
57	CIPK19	Contig437	AT5G45820.1	86	3 004 (1 383)	460	-
58	CIPK20	Contig455	AT4G30960.1	81	1 991 (1 296)	431	-
59	CIPK21	Contig488	AT4G18700.1	82	2 897 (1 431)	476	-
e. CML
60	CML1	Contig1	AT3G50770.1	88	1 229 (471)	156	-
61	CML2	Contig33	AT1G32250.1	81	996 (495)	164	-
62	CML3	Contig51	AT5G63960.2	100	1 243 (669)	222	C
63	CML4	Contig56	AT5G63960.2	100	1 118 (753)	250	C
64	CML5	Contig82	AT5G39670.1	81	856 (567)	188	S
65	CML6	Contig139	AT5G67360.1	95	1 423 (456)	151	-
66	CML7	Contig147	AT4G23260.2	100	1 204 (495)	164	-
67	CML8	Contig156	AT5G63960.2	80	1 078 (756)	251	C
68	CML9	Contig196	AT1G12310.1	79	836 (444)	147	-
69	CML10	Contig234	AT2G27480.1	91	1 146 (792)	263	-
70	CML11	Contig241	AT4G13730.3	100	1 541 (666)	221	C
71	CML12	Contig244	AT5G04170.1	79	1 301 (891)	296	C
72	CML13	Contig281	AT1G24620.1	90	855 (582)	193	M
73	CML14	Contig286	AT5G39670.1	86	993 (573)	190	S
74	CML15	Contig292	AT1G32250.1	81	828 (495)	164	-
75	CML16	Contig308	AT1G12310.1	78	911 (444)	147	-
f. CRK
76	CRK1	Contig2	AT3G50530.1	81	2 519 (1 845)	614	-
77	CRK2	Contig5	AT2G46700.1	79	2 385 (1 821)	606	-
78	CRK3	Contig9	AT2G41140.1	79	2 327 (1 827)	608	-
79	CRK4	Contig15	AT2G41140.1	78	1 997 (1 731)	576	C
80	CRK5	Contig25	AT5G24430.1	85	2 538 (1 785)	594	-
81	CRK6	Contig48	AT3G50530.1	80	1 697 (1 251)	416	-
82	CRK7	Contig152	AT2G41140.1	79	2 764 (1 740)	579	-
83	CRK8	Contig155	AT2G41140.1	79	2 800 (1 740)	579	C
84	CRK9	Contig200	AT3G50530.1	80	2 563 (1 845)	614	-

Name

R. glutinosa Gene Name

Accession No.

Putative name of gene in Arabidopsis thaliana

Identity /%

Nucleotide length (ORF)

Protein length

Localization

a. CaM

CaM1

Contig1

AT5G21274.1

1 004 (450)

149

CaM2

Contig6

AT4G14640.1

698 (453)

150

CaM3

Contig10

AT3G56800.1

1 143 (450)

149

CaM4

Contig46

AT3G56800.1

1 287 (450)

149

CaM5

Contig92

AT5G21274.1

990 (450)

149

b. CBL

CBL1

Contig1

AT4G33000.3

1 303 (759)

252

CBL2

Contig3

AT4G26570.1

1 191 (684)

227

CBL3

Contig4

AT4G26570.1

1 219 (735)

224

CBL4

Contig6

AT4G17615.1

1 400 (642)

213

CBL5

Contig9

AT5G24270.2

1 370 (678)

225

CBL6

Contig11

AT5G24270.2

1 455 (648)

215

CBL7

Contig12

AT4G33000.3

1 077 (756)

251

CBL8

Contig17

AT4G26570.1

1 579 (675)

224

CBL9

Contig18

AT5G24270.2

754 (618)

205

CBL10

Contig19

AT4G26570.1

2 446 (681)

226

CBL11

Contig20

AT4G26570.1

2 220 (684)

227

CBL12

Contig21

AT4G17615.2

1 134 (660)

219

c. CDPK

CDPK1

Contig129

AT4G36070.2

2 416 (1 782)

593

CDPK2

Contig132

AT4G21940.2

2 298 (1 635)

544

CDPK3

Contig141

AT5G23580.1

2 344 (1 593)

530

CDPK4

Contig156

AT1G76040.1

1 855 (1 584)

527

CDPK5

Contig225

AT1G74740.1

2 263 (1 629)

542

CDPK6

Contig228

AT1G35670.1

1 687 (1 491)

496

CDPK7

Contig247

AT4G23650.1

2 017 (1 545)

514

CDPK8

Contig248

AT5G12480.1

2 142 (1 596)

531

CDPK9

Contig249

AT5G19450.2

2 505 (1 596)

531

CDPK10

Contig261

AT2G17290.1

2 559 (1 707)

568

CDPK11

Contig262

AT2G17290.1

2 623 (1 707)

568

CDPK12

Contig265

AT3G51850.1

2 067 (1 587)

528

CDPK13

Contig267

AT1G74740.1

1 951 (1 629)

542

CDPK14

Contig268

AT1G74740.1

2 466 (1 629)

542

CDPK15

Contig305

AT1G50700.1

2 504 (1 554)

517

CDPK16

Contig321

AT5G04870.1

2 720 (1 866)

621

CDPK17

Contig339

AT2G17290.1

2 525 (1 707)

568

CDPK18

Contig343

AT1G12580.1

2 900 (1 479)

492

CDPK19

Contig350

AT3G51850.1

2 309 (1 587)

528

CDPK20

Contig363

AT1G12580.1

2 915 (1 476)

491

CDPK21

Contig260

AT1G74740.1

2 262 (1 629)

542

d. CIPK

CIPK1

Contig44

AT4G14580.1

1 989 (1 335)

444

CIPK2

Contig47

AT5G21326.1

2 678 (1 443)

480

CIPK3

Contig48

AT2G26980.5

1 957 (1 320)

439

CIPK4

Contig79

AT1G01140.3

2 030 (1 332)

443

CIPK5

Contig92

AT4G24400.2

2 194 (1 341)

446

CIPK6

Contig138

AT5G58380.1

2 768 (1 359)

452

CIPK7

Contig165

AT1G30270.1

3 170 (1 122)

373

CIPK8

Contig196

AT2G30362.1

1 730 (1 263)

420

CIPK9

Contig337

AT2G30360.1

2 398 (1 314)

437

CIPK10

Contig341

AT1G01140.3

2 046 (1 323)

440

CIPK11

Contig351

AT5G58380.1

2 555 (1 359)

452

CIPK12

Contig362

AT2G26980.5

1 937 (1 320)

439

CIPK13

Contig373

AT4G18700.1

1 951 (1 401)

466

CIPK14

Contig395

AT1G30270.1

3 368 (1 401)

466

CIPK15

Contig402

AT5G01820.1

3 018 (1 311)

436

CIPK16

Contig409

AT4G24400.2

2 237 (1 341)

446

CIPK17

Contig430

AT4G30960.1

1 999 (1 287)

428

CIPK18

Contig431

AT5G45810.1

2 095 (1 359)

452

CIPK19

Contig437

AT5G45820.1

3 004 (1 383)

460

CIPK20

Contig455

AT4G30960.1

1 991 (1 296)

431

CIPK21

Contig488

AT4G18700.1

2 897 (1 431)

476

e. CML

CML1

Contig1

AT3G50770.1

1 229 (471)

156

CML2

Contig33

AT1G32250.1

996 (495)

164

CML3

Contig51

AT5G63960.2

100

1 243 (669)

222

CML4

Contig56

AT5G63960.2

100

1 118 (753)

250

CML5

Contig82

AT5G39670.1

856 (567)

188

CML6

Contig139

AT5G67360.1

1 423 (456)

151

CML7

Contig147

AT4G23260.2

100

1 204 (495)

164

CML8

Contig156

AT5G63960.2

1 078 (756)

251

CML9

Contig196

AT1G12310.1

836 (444)

147

CML10

Contig234

AT2G27480.1

1 146 (792)

263

CML11

Contig241

AT4G13730.3

100

1 541 (666)

221

CML12

Contig244

AT5G04170.1

1 301 (891)

296

CML13

Contig281

AT1G24620.1

855 (582)

193

CML14

Contig286

AT5G39670.1

993 (573)

190

CML15

Contig292

AT1G32250.1

828 (495)

164

CML16

Contig308

AT1G12310.1

911 (444)

147

f. CRK

CRK1

Contig2

AT3G50530.1

2 519 (1 845)

614

CRK2

Contig5

AT2G46700.1

2 385 (1 821)

606

CRK3

Contig9

AT2G41140.1

2 327 (1 827)

608

CRK4

Contig15

AT2G41140.1

1 997 (1 731)

576

CRK5

Contig25

AT5G24430.1

2 538 (1 785)

594

CRK6

Contig48

AT3G50530.1

1 697 (1 251)

416

CRK7

Contig152

AT2G41140.1

2 764 (1 740)

579

CRK8

Contig155

AT2G41140.1

2 800 (1 740)

579

CRK9

Contig200

AT3G50530.1

2 563 (1 845)

614