药学学报

No.	Peptide	Inhibition rate (100 μmol·L^-1)
1	Ac-MEEVD-COOH	99%
2	Ac-MEEVD-COO-NH2	29%
3	Ac-MEEVN-COOH	49%
4	Ac-MEEVN-COO-NH2	0%
5	Ac-MEEAD-COOH	15%
6	Ac-MEEID-COOH	90%
7	Ac-MEAVD-COOH	82%
8	Ac-MAEVD-COOH	40%
9	Ac-EEVD-COOH	54%
10	Ac-LEEVD-COOH	85%

No.

Peptide

Inhibition rate (100 μmol·L^-1)

Ac-MEEVD-COOH

99%

Ac-MEEVD-COO-NH2

29%

Ac-MEEVN-COOH

49%

Ac-MEEVN-COO-NH2

Ac-MEEAD-COOH

15%

Ac-MEEID-COOH

90%

Ac-MEAVD-COOH

82%

Ac-MAEVD-COOH

40%

Ac-EEVD-COOH

54%

Ac-LEEVD-COOH

85%

No.	Peptide	Inhibition rate (100 μmol·L^-1)
1	Ac-MEEVD-COOH	99%
2	Ac-MEEVD-COO-NH2	29%
3	Ac-MEEVN-COOH	49%
4	Ac-MEEVN-COO-NH2	0%
5	Ac-MEEAD-COOH	15%
6	Ac-MEEID-COOH	90%
7	Ac-MEAVD-COOH	82%
8	Ac-MAEVD-COOH	40%
9	Ac-EEVD-COOH	54%
10	Ac-LEEVD-COOH	85%

No.

Peptide

Inhibition rate (100 μmol·L^-1)

Ac-MEEVD-COOH

99%

Ac-MEEVD-COO-NH2

29%

Ac-MEEVN-COOH

49%

Ac-MEEVN-COO-NH2

Ac-MEEAD-COOH

15%

Ac-MEEID-COOH

90%

Ac-MEAVD-COOH

82%

Ac-MAEVD-COOH

40%

Ac-EEVD-COOH

54%

Ac-LEEVD-COOH

85%

基于均相时间分辨荧光技术 (HTRF) 的HSP90-HOP相互作用抑制剂活性测试方法的构建及其应用

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王慧洁 ¹ , 周子涵 ³ , 徐嘉辰 ¹ , 姜奋 ¹ , 尤启冬 ¹^,²^,^* , 徐晓莉 ¹^,²

药学学报 | 研究论文药物化学 2017,52(4): 592-597

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药学学报 | 研究论文药物化学 2017, 52(4): 592-597

基于均相时间分辨荧光技术 (HTRF) 的HSP90-HOP相互作用抑制剂活性测试方法的构建及其应用

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王慧洁¹, 周子涵³, 徐嘉辰¹, 姜奋¹, 尤启冬¹^,²^,^*, 徐晓莉¹^,²

作者信息

1.中国药科大学药物分子设计与成药性优化重点实验室, 江苏南京 210009

2.中国药科大学药物化学系, 江苏南京 210009

3.南京外国语学校, 江苏南京 210008

通讯作者:

* 尤启冬, Tel:86-25-83271351, E-mail:youqd@cpu.edu.cn

HTRF-based method for determination of HSP90-HOP inhibition activity and its application

Hui-jie WANG¹, Zi-han ZHOU³, Jia-chen XU¹, Fen JIANG¹, Qi-dong YOU¹^,²^,^*, Xiao-li XU¹^,²

Affiliations

1. Jiang Su Key Laboratory of Drug Design and Optimization, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China

2. Department of Medicinal Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China

3. Nanjing Foreign Language School, Nanjing 210008, China

出版时间: 2017-04-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2016-1177

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摘要

收起

热休克蛋白90（HSP90）是细胞内大量表达的一类蛋白，其主要功能是辅助细胞内其他蛋白（客户蛋白）的成熟。HSP90的众多客户蛋白与肿瘤的发生发展有重要的关系，因此抑制HSP90的功能可以使这些癌症相关蛋白降解，从而诱导肿瘤细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目的。HSP90在发挥功能时还需要与辅伴侣蛋白HOP相互作用，因此靶向HSP90-HOP的相互作用开展抑制剂研发成为抑制HSP90伴侣系统的新策略。本文基于均相时间分辨荧光技术（HTRF）构建了稳定的用于测试HSP90-HOP相互作用抑制剂活性的方法，并用该方法研究了HSP90 C-端五肽MEEVD及其突变肽段对HSP90-HOP相互作用的抑制活性，为新型HSP90-HOP相互作用抑制剂的筛选和发现提供了重要基础。

关键词

热休克蛋白90 / HOP / 均相时间分辨荧光技术 / 蛋白-蛋白相互作用

Abstract

收起

HSP90 is widely expressed in cells with the main function in assisting the maturation of other proteins that are called clients. Many clients play critical roles in the occurrence and development of cancer. Inhibition of HSP90 can lead to degradation of the oncogenic proteins, and result in potent anti-cancer effects. HSP90-HOP interaction is critical for the chaperone function of HSP90, thereby disruption of the HSP90-HOP interaction is a novel strategy in the inhibition of HSP90. Based on the technology of homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF), we developed a new assay for the identification of new inhibitors of HSP90-HOP interaction. This method was evaluated in the study of the HSP90-HOP inhibition activity of the pentapeptide MEEVD from HSP90 C-terminal and its derivatives. This study can provide a basis for the screening and discovery of novel HSP90-HOP disruptors.

Key words

heat shock protein 90 / HSP-organizing protein / homogeneous time-resolved fluorescence / protein-protein interaction

引用本文

王慧洁, 周子涵, 徐嘉辰, 姜奋, 尤启冬, 徐晓莉. 基于均相时间分辨荧光技术 (HTRF) 的HSP90-HOP相互作用抑制剂活性测试方法的构建及其应用. 药学学报, 2017 , 52 (4) : 592 -597 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-1177

Hui-jie WANG, Zi-han ZHOU, Jia-chen XU, Fen JIANG, Qi-dong YOU, Xiao-li XU. HTRF-based method for determination of HSP90-HOP inhibition activity and its application[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017 , 52 (4) : 592 -597 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-1177

正文

收起

HSP90 (heat shock protein 90) 是细胞内大量表达的一类分子伴侣蛋白, 其主要功能是对细胞内的其他蛋白 (客户蛋白) 进行折叠加工, 对于客户蛋白的成熟起着非常重要的作用^[1-3]。众多的HSP90客户蛋白与肿瘤的发生发展有密切的关系, 抑制HSP90的功能可以使与癌症相关的客户蛋白通过泛素化途径降解, 诱导肿瘤细胞发生凋亡, 从而达到抗肿瘤效果^[4-9]。

HSP90在发挥生物学功能时, 需要辅伴侣分子 (co-chaperones) 的参与, 二者相互作用后, 才能对客户蛋白进行加工。HOP (HSP-organizing protein) 作为重要的HSP90辅伴侣分子, 介导客户蛋白由HSP70向HSP90的转移。其主要通过TPR2A结构域与HSP90的C-端结合, 抑制HSP90-HOP (TPR2A) 的相互作用就可以阻断HSP90对客户蛋白的加工, 使其通过泛素化途径降解^{[10, 11]}。目前已有抑制HSP90-HOP (TPR2A) 相互作用的小分子抑制剂被报道, 并对Her2高表达的乳腺癌细胞株有很好的抗增殖活性^[12]。这表明抑制HSP90-HOP (TPR2A) 相互作用是一种有效的抗肿瘤策略。

HSP90主要通过C-端的MEEVD五肽序列与HOP蛋白上的TPR2A结构域结合, 解离常数 (K_d) 为11 μmol·L^-1^[13]。MEEVD五肽与HOP (TPR2A) 的晶体复合物显示, 五肽以一个伸展的构象占据TPR2A结构域的凹槽^{[14, 15]}。因此, 可以将MEEVD五肽作为模板分子来开展HSP90-HOP相互作用抑制剂研究。

在药物研发中, 化合物的活性测试方法起着非常重要的作用, 因此构建稳定的活性测试方法是开展对HSP90-HOP相互作用热区探索及抑制剂开发的关键。此前, Cortajarena等^[13]报道了利用Alphascreen方法筛选并得到嘧啶并三酮类抑制剂的研究, 这是目前唯一一种HSP90-HOP相互作用抑制剂活性测定方法。Alphascreen方法存在一定的不足, 该方法对测试仪器要求较高、操作繁琐、检测试剂昂贵, 且反应体系对于强光或是长时间室内光比较敏感。因此, 建立操作简单、灵敏可靠的HSP90-HOP相互作用抑制剂活性测试方法, 实现多方法联用、多层次交叉验证的评价体系对于靶向HSP90系统开发药物研究至关重要。

基于以上研究现状及需求, 本研究建立了基于均相时间分辨荧光技术 (HTRF) 的HSP90-HOP相互作用抑制剂活性测试方法, 该方法具有稳定、经济、操作简便的特点, 可以用于HSP90-HOP相互作用抑制剂的活性评价。用该方法对HSP90-HOP相互作用的关键热区进行了探索, 结果表明电性相互作用是两个蛋白之间的主要作用力, 为进一步的HSP90-HOP相互作用抑制剂发现提供了研究基础。

材料与方法

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药品与试剂 Escherichia coli BL21 (CD601-03, 广州潘峰生物科技有限公司)、TPR2A蛋白原核表达质粒 (南京金斯瑞公司构建)、HSP90 C-端原核表达质粒 (addgene, plasmid: 22483)、Anti-GST-Cryptate (61GSTKLA, CISBIO)、Anti-6His-XL665 (61HISXLA, CISBIO)、MEEVD及其突变肽段 (南京海星利技术有限公司)。

仪器酶标仪 (Molecular Device)、384孔板 (Greiner#784076)。

利用HTRF技术检测HSP90与TPR2A的相互作用 当带有His标签的HSP90 C-端蛋白和带有GST标签的HOP (TPR2A) 蛋白相互作用时 (空间距离小于10 nm), Anti-6His-XL665受体磁珠和Anti-GST-Cryptate供体磁珠也会相应靠近, 从而发生共振能量转移 (FRET) 现象。供体磁珠荧光分子的激发将诱发受体分子发出荧光, 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。当抑制剂分子阻断HSP90和HOP的相互作用时, FRET现象减弱。因此, FRET现象的强弱可以反映抑制剂分子对两个蛋白相互作用抑制作用的强弱。

HSP90 C-端蛋白与HOP (TPR2A) 蛋白相互作用最适浓度摸索 采用交叉滴定实验考察两个蛋白在384孔板中的最适反应浓度。实验体系为20 μL, 其中包括4 μL GST-tagged HSP90、4 μL His-tagged TPR2A、4 μL Anti-6His-XL665、4 μL Anti-GST-Cryptate和4 μL缓冲液 (100 mmol·L^-1 KF)。HOP (TPR2A) 蛋白从20 μmol·L^-1起梯度稀释9个浓度, HSP90蛋白从1.5 μmol·L^-1起梯度稀释5个浓度, 37 ℃下振摇孵育1 h, 加入检测试剂后室温避光孵育0.5 h, 扫板并记录荧光数值。

缓冲液中氟化钾 (KF) 浓度对HTRF荧光值的影响 KF是HTRF实验中荧光基团铕穴状化合物的保护剂, 其浓度对荧光值有显著影响。在不影响反应有效性的前提下, 减小KF浓度有助于提高筛选灵敏性。将KF浓度从400 mol·L^-1起梯度稀释10个浓度, 37 ℃下振摇孵育1 h, 加入检测试剂后室温避光孵育0.5 h, 扫板并记录荧光数值, 检测KF浓度对反应窗的影响。

DMSO浓度对HTRF荧光值的影响 DMSO作为化合物的溶剂, 其浓度对实验结果有不可忽视的影响。为了排除DMSO对检测信号的影响, 将DMSO使用浓度设置为10%、5%、2.5%、1.25%、0, 检测其对反应窗的影响。

Z因子的测定 Z-因子 (Z-factor) 是评估测试方法质量的主要参数, 为了评价所构建HTRF方法测试HSP90-HOP蛋白-蛋白相互作用抑制剂活性的稳定性, 本研究计算了该方法的Z因子。实验设计如下, 空白对照 (12 μL 100 mmol·L^-1 KF、4 μL Anti-6His-XL665、4 μL Anti-GST-Cryptate), 阴性对照 (4 μL GST-tagged HSP90、4 μL His-tagged TPR2A、4 μL Anti-6His-XL665、4 μL Anti-GST-Cryptate、4 μL 100 mmol·L^-1 KF), 阳性对照 (4 μL MEEVD五肽、4 μL GST-tagged HSP90、4 μL His-tagged TPR2A、4 μL Anti-6His-XL665、4 μL Anti-GST-Cryptate)。每块384孔板上都含有100个阳性对照和100个阴性对照孔, 计算而得的平均值、SD和CV都是作为评估均一性和稳定性的重要参数。

采用建立的HTRF测试方法研究HSP90-HOP (TPR2A) 的结合热区 基于上述建立的HTRF测试方法, 对HSP90-HOP (TPR2A) 的结合热区进行研究。以HSP90 C-端的MEEVD五肽为模板, 对其进行氨基酸突变, 获得9个多肽。将其加入384孔板, 每个浓度5个复孔, 加入HSP90蛋白 (终浓度为375 nmol·L^-1) 和TPR2A蛋白 (终浓度为625 nmol·L^-1), DMSO浓度为0.2%, 每孔体积共20 μL。每块板设置以下几种对照:空白对照 (12 μL 100 mmol·L^-1 KF、4 μL Anti-6His-XL665、4 μL Anti-GST-Cryptate), 阴性对照 (4 μL GST-tagged HSP90、4 μL His-tagged TPR2A、4 μL Anti-6His-XL665、4 μL Anti-GST-Cryptate、4 μL 100 mmol·L^-1 KF), 阳性对照 (4 μL MEEVD、4 μL GST-tagged HSP90、4 μL His-tagged TPR2A、4 μL Anti-6His-XL665、4 μL Anti-GST-Cryptate)。

数据统计和分析 测试数据是根据两束不同波长光的信号比计算得到: (Signal 665 nm/Signal 620 nm)*10 000。HTRF实验数据分析使用Prism软件 (GraphPad 5.0, Inc. San Diego, CA), IC₅₀数据是以LogC [Inhibitor]为横坐标、以信号值为纵坐标进行计算。为了确定实验的重复性, 所有的实验都设置5个复孔。Z因子的计算公式如下:

${\rm{Z}} = 1-\frac{{3*{\rm{S}}{{\rm{D}}_{{\rm{negative}}}} + 3*{\rm{S}}{{\rm{D}}_{{\rm{positive}}}}}}{{{\rm{Mea}}{{\rm{n}}_{{\rm{negative}}}}-{\rm{Mea}}{{\rm{n}}_{{\rm{positive}}}}}}$

结果与讨论

收起

1 HSP90 C-端蛋白与HOP (TPR2A) 蛋白相互作用最适浓度

当HSP90 C-端蛋白浓度不变时, 荧光信号值随着HOP (TPR2A) 蛋白浓度的变化呈现抛物线状变化。同样, 当HOP (TPR2A) 蛋白浓度不变时, 荧光信号值随着HSP90 C-端蛋白浓度也呈现抛物线状变化, 当HOP蛋白浓度达到最高时, 信号值几乎达到平衡。在HSP90 C-端蛋白和TPR2A蛋白浓度分别为375 nmol·L^-1、625 nmol·L^-1时信号值达到最大1 772.83 (图 1)。在此条件下, 实验的灵敏度最高, 因此选择此蛋白浓度作为后续的实验浓度。

2 缓冲液中KF浓度对信号值的影响

随着缓冲液中KF浓度的增大, 检测信号值升高, 但在KF浓度为100 mmol·L^-1时信号值达到稳定。为了最大程度减少对实验结果的影响, 选择100 mmol·L^-1的KF浓度作为后续的实验浓度 (图 2A)。

3 体系中DMSO浓度对检测信号值的影响

如图 2B所示, 体系中DMSO含量由0增加到10%, 检测信号值没有明显降低, 表明该实验体系对DMSO的含量有较强的耐受性。

4 测试方法稳定性分析

平均值、SD和CV都是作为评估均一性和稳定性的重要参数, 如图 3所示, 阳性参照的信号平均值为525.34, 标准偏差为48.33, 而阴性参照的平均值1 778.54, 标准偏差为71.99。所有的CV误差值都小于10%, 处于分子生物学检测试验可接受的范围。连续检测2 h, Z因子都稳定为0.71, 这也说明了该方法是均一稳定的。

5 HSP90 C-端内源MEEVD五肽活性测试

MEEVD五肽序列是HSP90 C-端的内源性肽段, 可以与HOP蛋白的TPR2A基序结合, 因此该肽段可以与HSP90 C-端蛋白竞争性地与HOP蛋白结合。本研究应用上述实验方法测试该肽段对HSP90 C-端与HOP蛋白相互作用的抑制活性。如图 4所示, 本实验中MEEVD五肽对HSP90 (CT)-HOP (TPR2A) 的蛋白-蛋白相互作用的抑制作用呈现浓度依赖性, 其IC₅₀值为14.28 ± 1.2 μmol·L^-1, 与文献^[11]报道的亲和力11 μmol·L^-1处于同一数量级。随着孵育时间的延长, 信号值响应越明显。结果表明, 该实验方法可以准确地测试出HSP90 (CT)-HOP (TPR2A) 抑制剂的活性, 可以用于后期的活性测试。

6 HSP90-HOP (TPR2A) 相互作用热区探索及MEEVD五肽衍生肽段构效关系研究

蛋白-蛋白相互作用热区的研究是开发蛋白-蛋白相互作用调控剂的研究基础。目前研究人员已经获得了HSP90 C-端MEEVD五肽与HOP上TPR2A基序的晶体复合物 (图 5), 但MEEVD五肽中每个氨基酸残基对两个蛋白结合的重要性尚不清楚。

为了研究MEEVD五肽中每个氨基酸残基对两个蛋白结合的重要性, 指导开展基于结构的合理药物设计, 对MEEVD五肽序列进行了氨基酸位点突变, 设计得到了9个衍生肽段, 并利用上述方法对肽段进行活性测试, 结果如表 1所示。

晶体复合物显示, MEEVD五肽以一个伸展的构象占据TPR2A结构域的凹槽 (图 5)。将末端的Asp标记为0位, Val、Glu、Glu、Met顺次标记为-1位、-2位、-3位、-4位。0位Asp与HOP (TPR2A) 结构域中的Lys229、Asn264、Gln298、Lys301形成强的氢键网络, 可能对两个蛋白的结合提供主要作用。为了验证0位Asp的重要性, 本研究将Asp的两个羧基分别突变为酰胺基或者同时突变为酰胺基得到了肽段2~4。活性测试结果表明, 0位Asp末端的两个羧基分别突变为两个酰胺基 (肽2和肽3) 后, 肽段的活性都大幅降低。如果将两个羧基都突变为酰胺基 (肽4), 肽段的活性骤降至无。这表明0位Asp的两个羧基对于肽段与HOP (TPR2A) 的相互作用具有非常重要的作用, 后期设计小分子抑制剂也需要具有此药效特征。-1位Val上异丙基占据一个小的疏水性口袋, 提供部分疏水性相互作用, 将其突变为Ala或Ile, 考察异丙基提供的疏水性作用的重要性。测试结果表明, 将此Val突变为Ala (肽5), 肽段的活性显著降低, 将其突变为有更大疏水性片段的Ile (肽6), 肽段的活性得到保持。这说明-1位Val上异丙基提供的疏水相互作用对于肽段活性的保持非常重要, 后期小分子抑制剂上引入疏水性取代基占据这个小的疏水性口袋可能有助于提高化合物的活性。-2位Glu伸入溶剂区, 与蛋白没有明显相互作用, 其对结合的重要性可能较小, 将其突变为Ala (肽7), 考察其对结合的贡献。测试结果显示肽段的活性稍有降低, 这与猜想是一致的, 后期设计小分子化合物无需保持这个药效特征。-3位的Glu与Arg305和Asn308形成强的氢键网络, 对两个蛋白的结合应该有较大贡献。将其突变为Ala后 (肽8), 肽段的活性大幅降低, 表明-3位Glu对于肽段活性的保持很重要。-4位的Met占据一个小的疏水口袋, 与蛋白形成疏水相互作用。为了考察此疏水作用对于两个蛋白结合的重要性, 设计了肽9和肽10。将此Met去掉后 (肽9), 肽段的活性大幅降低, 将其突变为疏水性更大的Leu后活性稍有降低 (肽10), 表明-4位Met提供的疏水作用对两个蛋白的结合非常重要。这些突变肽段的构效关系可以为今后开展HSP90-HOP (TPR2A) 小分子抑制剂的设计提供指导。

小结

收起

本文建立了基于HTRF技术的HSP90-HOP相互作用抑制剂活性测试方法, 该方法具有灵敏性高、稳定性好、操作简便等特点, 可以用于靶向HSP90-HOP (TPR2A) 相互作用抑制剂的高通量筛选和活性测试研究。该测试方法测试内源性MEEVD五肽对两个蛋白相互作用的IC₅₀为14.28 ± 1.2 μmol·L^-1。本研究对五肽序列进行氨基酸突变, 并用此方法测试了其对HSP90-HOP (TPR2A) 相互作用的抑制作用。结果表明, 0位的Asp和-3位Glu对于活性的保持至关重要, -1位Val和-4位Met的疏水作用也很重要, -2位的Glu对于肽段活性重要性较低。这些信息可以为开展合理药物设计, 发现新型结构的HSP90-HOP (TPR2A) 相互作用抑制剂提供指导。

基金

收起

国家自然科学基金资助项目(81502990)
国家自然科学基金资助项目(81573346)
江苏省自然科学基金资助项目(BK20150691)
江苏省博士后基金资助项目(1501033C)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

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2017年第52卷第4期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2016-1177

接收时间：2016-12-09
首发时间：2026-01-14
出版时间：2017-04-12

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收稿日期：2016-12-09
修回日期：2017-01-04

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国家自然科学基金资助项目(81502990)

国家自然科学基金资助项目(81573346)

江苏省自然科学基金资助项目(BK20150691)

江苏省博士后基金资助项目(1501033C)

作者信息

1.中国药科大学药物分子设计与成药性优化重点实验室, 江苏南京 210009

2.中国药科大学药物化学系, 江苏南京 210009

3.南京外国语学校, 江苏南京 210008

通讯作者:

* 尤启冬, Tel:86-25-83271351, E-mail:youqd@cpu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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