药学学报

钙蛋白酶抑制剂对纤连蛋白诱导的MCF-10A乳腺上皮细胞-间质转化的影响

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洪端阳 ¹ , 陈林 ¹ , 张彦燕 ¹ , 王婧 ¹ , 王昌权 ¹ , 陈妍 ¹^,²^,^* , 沈祥春 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文药理学 2017,52(4): 569-574

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药学学报 | 研究论文药理学 2017, 52(4): 569-574

钙蛋白酶抑制剂对纤连蛋白诱导的MCF-10A乳腺上皮细胞-间质转化的影响

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洪端阳¹, 陈林¹, 张彦燕¹, 王婧¹, 王昌权¹, 陈妍¹^,²^,^*, 沈祥春¹^,²^,^*

作者信息

1.贵州医科大学天然药物资源优效利用重点实验室, 贵州贵阳 550025

2.贵州省高等学校天然药物药理与成药性评价重点实验室, 贵州贵阳 550025

通讯作者:

* 陈妍, Tel/Fax:86-851-8416149, E-mail:457335071@qq.com;

沈祥春, E-mail:shenxiangchun@126.com

The inhibitory effects of calpain inhibitors on epithelial-mesenchymal transition of MCF-10A mammary epithelial cells induced by fibronectin

Duan-yang HONG¹, Lin CHEN¹, Yan-yan ZHANG¹, Jing WANG¹, Chang-quan WANG¹, Yan CHEN¹^,²^,^*, Xiang-chun SHEN¹^,²^,^*

Affiliations

1. Key Laboratory of Optimal Utilization of Natural Medical Resources, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China

2. The High Educational Key Laboratory of Guizhou Province for Natural Medicinal Pharmacology and Druggability, Guiyang 550025, China

出版时间: 2017-04-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2016-1181

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摘要

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本研究观察钙蛋白酶抑制剂（ALLN和calpain inhibitor Ⅳ）对纤连蛋白（FN）诱导的MCF-10A乳腺上皮细胞-间质转化（EMT）的影响。FN作用MCF-10A细胞48 h后，采用划痕修复实验检测MCF-10A细胞的迁移能力；基质胶包被的transwell小室实验检测细胞的侵袭能力；Western blot法检测波形蛋白（vimentin）、E-钙粘着蛋白（E-cadherin）、锌指蛋白（snail）和钙蛋白酶-2（calpain-2）的表达。研究结果显示，FN诱导MCF-10A细胞形态发生改变；显著增加MCF-10A细胞的迁移和侵袭能力；上调calpain-2、vimentin和snail蛋白表达，下调E-cadherin蛋白水平。ALLN和calpain inhibitor Ⅳ能显著抑制FN诱导的MCF-10A细胞形态变化、迁移和侵袭能力增强、vimentin、snail和calpain-2蛋白表达上调及E-cadherin蛋白表达下调。以上研究结果表明，FN诱导MCF-10A乳腺上皮细胞发生EMT可能与上调calpain-2的表达有关，ALLN和calpain inhibitor Ⅳ能够抑制FN诱导的上皮间质转化。

关键词

钙蛋白酶抑制剂 / MCF-10A乳腺上皮细胞 / 纤连蛋白 / 上皮间质转化 / 钙蛋白酶

Abstract

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The aim of this research is to investigate the inhibitory effects of calpain inhibitors (ALLN and calpain inhibitor Ⅳ) on mammary epithelial-mesenchymal transition (EMT) of MCF-10A cells induced by fibronectin (FN). After FN treatment of MCF-10A cells for 48 h, cell migration and invasion were determined by scratch repair assay and matrigel coated transwell assay, respectively. Vimentin, E-cadherin, snail and calpain-2 protein expression were measured by Western blot. The results suggest that FN induced morphological changes in MCF-10A cells, significantly increased the migration and invasion abilities of MCF-10A cells, upregulated the expression of calpain-2, vimentin and snail, and downregulated the expression of E-cadherin. All such changes by FN were reversed with ALLN and calpain inhibitor Ⅳ. In conclusion, the upregulation of calpain-2 was involved in FN-induced EMT of MCF-10A mammary epithelial cells, which may be inhibited by ALLN and calpain inhibitor Ⅳ.

Key words

calpain inhibitor / MCF-10A mammary epithelial cells / fibronectin / epithelial-mesenchymal transformation / calpain

引用本文

洪端阳, 陈林, 张彦燕, 王婧, 王昌权, 陈妍, 沈祥春. 钙蛋白酶抑制剂对纤连蛋白诱导的MCF-10A乳腺上皮细胞-间质转化的影响. 药学学报, 2017 , 52 (4) : 569 -574 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-1181

Duan-yang HONG, Lin CHEN, Yan-yan ZHANG, Jing WANG, Chang-quan WANG, Yan CHEN, Xiang-chun SHEN. The inhibitory effects of calpain inhibitors on epithelial-mesenchymal transition of MCF-10A mammary epithelial cells induced by fibronectin[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017 , 52 (4) : 569 -574 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-1181

正文

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乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤, 目前乳腺癌的发病率逐年上升, 且发病年龄呈年轻化发展^[1]。上皮细胞-间质转化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 是指上皮细胞在形态学上发生间质细胞表型的转变过程^[2]。近年来的大量研究表明, EMT广泛参与了乳腺癌的致病过程^[3]。Park等^[4]研究证明, 纤连蛋白 (fibronectin, FN) 与EMT密切相关, FN是细胞外基质的大分子糖蛋白, 也是乳腺上皮细胞微环境中的重要成分, 影响细胞迁移、生长、形态、分化和致癌性转变^[5]。在FN作用下, 乳腺上皮细胞逐渐失去原有的极性, 从生长抑制状态转变为增殖状态, 并发生上皮间质转化, 使细胞发生胞间黏附减少、迁移和侵袭能力增强等肿瘤样行为的变化^[6]。

钙蛋白酶 (calpain) 是一种Ca²⁺依赖性的蛋白分解酶^[7], 主要有两种亚型, 钙蛋白酶-1 (calpain-1) 和钙蛋白酶-2 (calpain-2)^[8]。有研究报道表明calpain能将骨桥蛋白水解为活性小分子片段, 介导丙肝病毒诱导肝细胞EMT^[9]。此外, 应用同位素标记技术和串联质谱检测发现在转化生长因子-β诱导A549肺癌细胞EMT的过程中, calpain等14种与细胞骨架和运动有关的蛋白表达上调。以上研究提示, calpain蛋白表达增加可能是调控EMT的一个重要环节^[10], 但calpain是否在FN诱导的EMT中发挥作用尚不清楚。本研究通过建立FN诱导的EMT体外模型, 观察钙蛋白酶抑制剂 (ALLN和calpain inhibitor Ⅳ) 对FN诱导的上皮间质转化的影响, 并对其作用机制进行初步探讨, 为其应用于乳腺癌的防治提供新的研究思路。

材料与方法

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细胞株及试剂 正常人乳腺上皮细胞株MCF-10A购自中国科学院昆明细胞库, DMEM/F12培养基、马血清 (horse serum, HS)、青霉素/链霉素 (penicillin/streptomycin)、氢化可的松 (hydrocortisone, HC)、生长因子 (epithelial growth factor, EGF)、胰岛素 (insulin)、霍乱毒素 (cholera toxin) 及胰蛋白酶 (trypsin) 购自美国HyClone公司。纤连蛋白、钙蛋白酶抑制剂 (ALLN和calpain inhibitor Ⅳ) 购自Sigma公司, 抗vimentin、E-cadherin、snail及calpain-2单克隆抗体购自Santa Cruze公司, 抗GAPDH抗体购自Cell Signaling公司, 羊抗兔/羊抗鼠IgG-HRP抗体购自博士德公司。

细胞培养 正常人乳腺上皮细胞MCF-10A常规培养采用DMEM/F12培养基 (含10% HS、1%青霉素/链霉素、0.1% HC、0.02% EGF、0.1%胰岛素、0.01%霍乱毒素), 在37 ℃及5% CO₂的条件下进行培养, 待细胞覆盖率达90%~100%时进行传代培养。

细胞划痕实验 按照划痕修复实验法^[11]将细胞随机分为4组, 分别加入无血清培养基 (control) 和含20 μg·mL^-1 FN、20 μg·mL^-1 FN + 10 μmol·L^-1 ALLN、20 μg·mL^-1 FN + 25 μmol·L^-1 calpain inhibitor Ⅳ处理, 其中ALLN和calpain inhibitor Ⅳ在加入FN前预处理1 h, 置于培养箱内培养。分别于0 h和48 h在倒置显微镜下拍照。计算细胞迁移率= (0 h伤口宽度-48 h伤口宽度) / 0 h伤口宽度× 100%, 实验重复3次, 进行统计学分析。

细胞侵袭实验 培养的MCF-10A细胞覆盖率达90%后, 将培养基换成无血清DMEM, 同时按“细胞划痕实验”将细胞分为4组, 并施以相同处理。按照transwell小室侵袭实验法^[12]重复3次。以control组的微孔滤膜细胞数为对照, 各组穿过Matrigel胶的细胞数与其相比所得百分率表示细胞的侵袭能力。

Western blot检测 培养的MCF-10A细胞覆盖率达90%后, 将培养基换为无血清DMEM, 同时按“细胞划痕实验”将细胞分为4组, 并施以相同处理。药物处理48 h后, 加入RIPA裂解液裂解细胞。4 ℃、12 000 r·min^-1离心20 min后取样品上清液留用, 采用BCA蛋白定量法进行蛋白定量。每个泳道按40 μg蛋白质样品进行上样, 按照Western blot法^[12]实验, 检测vimentin、E-cadherin、snail和calpain-2的蛋白表达。采用Bio-Rad系统进行成像, Image Lab软件分析蛋白印迹结果。

统计学处理 采用SPSS 19.0处理和分析数据, 实验结果以均值±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析法, P < 0.05表示差异具有统计学意义。

结果

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1 FN对MCF-10A细胞中calpain-2蛋白表达的影响

FN (20 μg·mL^-1) 作用MCF-10A细胞0、12、24和48 h后, 与0 h相比, calpain-2蛋白表达逐渐增加, 差异均具有统计学意义 (P < 0.05)。FN使MCF-10A细胞中的calpain-2蛋白表达增加 (图 1)。

2 钙蛋白酶抑制剂对FN诱导的MCF-10A细胞中calpain-2蛋白表达的影响

与对照组相比, FN (20 μg·mL^-1) 作用48 h后, calpain-2蛋白表达显著增加, 差异具有统计学意义 (P < 0.05); (FN + ALLN) 和 (FN + calpain inhibitor Ⅳ) 组与FN组相比, calpain-2蛋白表达显著降低, 差异均具有统计学意义 (P < 0.05)。钙蛋白酶抑制剂 (ALLN和calpain inhibitor Ⅳ) 能显著抑制FN诱导的MCF-10A细胞中calpain-2蛋白表达上调 (图 2)。

3 钙蛋白酶抑制剂对FN诱导的MCF-10A细胞形态的影响

FN (20 μg·mL^-1) 作用MCF-10A细胞48 h后, 对照组细胞形态为鹅卵石状, 细胞之间黏附力较强, 结构紧密。与对照组细胞相比, FN组细胞拉长呈纺锤形, 细胞之间黏附力降低, 结构松散, 形态接近成纤维细胞; 与FN组细胞相比, (FN + ALLN) 和 (FN + calpain inhibitor Ⅳ) 组细胞之间黏附力增强, 结构紧密, 细胞形态接近鹅卵石状 (图 3)。以上结果说明, 钙蛋白酶抑制剂ALLN和calpain inhibitor Ⅳ能够逆转FN诱导的MCF-10A细胞形态变化。

4 钙蛋白酶抑制剂对FN诱导的MCF-10A细胞迁移能力的影响

划痕修复实验结果表明, 与对照组相比, FN (20 μg·mL^-1) 作用48 h后, 细胞的迁移率增加到 (188.9 ± 1.8) %, 差异具有统计学意义 (P < 0.05); (FN + ALLN) 和 (FN + calpain inhibitor Ⅳ) 组与FN组相比, 细胞的迁移率分别降低到 (92.3 ± 6.1) %和 (98.8 ± 1.7) %, 差异均具有统计学意义 (P < 0.05) (图 4)。钙蛋白酶抑制剂ALLN和calpain inhibitor Ⅳ对FN诱导的MCF-10A细胞迁移有明显的抑制作用。

5 钙蛋白酶抑制剂对FN诱导的MCF-10A细胞侵袭能力的影响

基质胶包被的transwell小室实验结果表明, FN (20 μg·mL^-1) 作用48 h后, 侵袭细胞数增加到 (234.5 ± 9.4) %, 与对照组相比, 差异具有统计学意义 (P < 0.05); (FN + ALLN) 和 (FN + calpain inhibitor Ⅳ) 组侵袭细胞数分别降低到 (102.4 ± 6.1) %和 (116.7 ± 7.3) %, 与FN组相比, 差异均具有统计学意义 (P < 0.05) (图 5)。钙蛋白酶抑制剂ALLN和calpain inhibitor Ⅳ对FN诱导的MCF-10A细胞侵袭有明显的抑制作用。

6 钙蛋白酶抑制剂对FN诱导的MCF-10A细胞中vimentin、E-cadherin和snail蛋白表达的影响

与对照组相比, FN (20 μg·mL^-1) 作用48 h后, vimentin和snail蛋白表达显著增加, E-cadherin蛋白表达显著降低, 差异均具有统计学意义 (P < 0.05); (FN + ALLN) 和 (FN + calpain inhibitor Ⅳ) 组与FN组相比, vimentin和snail蛋白表达显著降低, E-cadherin蛋白表达显著增加, 差异均具有统计学意义 (P < 0.05) (图 6)。钙蛋白酶抑制剂ALLN和calpain inhibitor Ⅳ能显著抑制FN诱导的MCF-10A细胞中vimentin和snail蛋白表达上调及E-cadherin蛋白表达下调。

讨论

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上皮间质转化是肿瘤细胞自身塑形的重要标志^[13], EMT在乳腺癌的发展、浸润和转移方面有着密切联系^[14]。当细胞发生EMT时, 细胞极性消失, 转变为有间质细胞形态和特性的细胞^[15]。这种转变使细胞间的黏附能力减弱、细胞的运动和侵袭能力增强, 使细胞获得可塑性、迁移、侵袭、对抗凋亡的能力及干细胞样特征^[16], 从而促进肿瘤的发生和发展。EMT为细胞的恶变和转移提供了基础, 调控EMT的发生可能是防治肿瘤的一个靶点^[17]。乳腺肿瘤源于乳腺上皮细胞的恶变, 抑制乳腺上皮细胞EMT可能有效控制肿瘤细胞的侵袭和转移以及降低乳腺癌患者的死亡率。

Park等^[4]研究证明, 乳腺肿瘤组织中的FN水平与肿瘤的恶性程度呈正相关, 与乳腺癌患者的存活率呈负相关。本研究发现FN能够诱导MCF-10A乳腺上皮细胞形态向间质细胞形态发生改变。此外, 通过划痕修复实验和transwell小室侵袭实验, 发现FN能够显著增强MCF-10A乳腺上皮细胞的迁移和侵袭能力。Western blot法检测结果显示, FN能够明显上调MCF-10A细胞中vimentin和snail的蛋白表达及明显下调E-cadherin的蛋白表达, 表明FN能够诱导乳腺上皮细胞发生间质转化。钙蛋白酶抑制剂通过模拟calpain底物结构, 竞争性地与calpain相互作用, 从而阻止calpain对底物的水解来发挥作用^[18]。Calpain抑制剂是抗肿瘤药物开发的重要方向, 抑制calpain的活性可能会成为抑制肿瘤细胞转移的重要手段^[19]。Čáslavský等^[20]研究证明, calpain能使细胞从静态的上皮表型转变为具有运动和侵袭性的间质表型, 提示calpain表达增加及其活性的发挥可能在EMT中扮演着一个重要的角色。本研究发现FN能够使MCF-10A细胞中calpain-2蛋白表达上调。两种钙蛋白酶抑制剂 (ALLN和calpain inhibitor Ⅳ) 均能显著抑制FN诱导的MCF-10A细胞中calpain-2蛋白的表达, 并显著抑制细胞的形态变化、迁移和侵袭能力增强。此外, ALLN和calpain inhibitor Ⅳ能够显著抑制MCF-10A细胞中vimentin和snail蛋白表达上调及E-cadherin蛋白表达下调。

综上所述, FN能够诱导上皮细胞发生间质转化, 钙蛋白酶抑制剂ALLN和calpain inhibitor Ⅳ能够抑制FN诱导的乳腺上皮细胞EMT, 有望应用于乳腺癌的预防。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81560598)
国家自然科学基金资助项目(81302804)
中国博士后基金(2015M582759XB)
贵阳市科技局项目(筑科合同[20141001])
贵州省教育厅自然科学基金优秀人才计划(黔教合KY字[2015]492)
贵州省科学技术基金(黔科合J字[2014]2007号)
贵州省2016年大学生创新创业训练计划项目(201610660042)
贵州省高等教育科技创新团队(黔教合人才团队字[2014]31)
贵州省科技创新团队(黔科合人才团队[2015]4025号)
贵州省高层次创新型人才百层次人才(贵州省科技厅黔科合人才[2015]4029号)
贵州医科大学开放性实验(070701817)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2017年第52卷第4期

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171

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接收时间：2016-12-11
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出版时间：2017-04-12

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收稿日期：2016-12-11
修回日期：2017-01-05

基金

国家自然科学基金资助项目(81560598)

国家自然科学基金资助项目(81302804)

中国博士后基金(2015M582759XB)

贵阳市科技局项目(筑科合同[20141001])

贵州省教育厅自然科学基金优秀人才计划(黔教合KY字[2015]492)

贵州省科学技术基金(黔科合J字[2014]2007号)

贵州省2016年大学生创新创业训练计划项目(201610660042)

贵州省高等教育科技创新团队(黔教合人才团队字[2014]31)

贵州省科技创新团队(黔科合人才团队[2015]4025号)

贵州省高层次创新型人才百层次人才(贵州省科技厅黔科合人才[2015]4029号)

贵州医科大学开放性实验(070701817)

作者信息

1.贵州医科大学天然药物资源优效利用重点实验室, 贵州贵阳 550025

2.贵州省高等学校天然药物药理与成药性评价重点实验室, 贵州贵阳 550025

通讯作者:

* 陈妍, Tel/Fax:86-851-8416149, E-mail:457335071@qq.com;

沈祥春, E-mail:shenxiangchun@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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