药学学报

Latin name	No. of specimens	Voucher No.	Collection location
Bos grunniens	13	SS0001MT01-10 SS0001MT11-13	Kangding, Sichuan Xining, Qinghai Tianzhu, Gansu
Bos Taurus	14	SS0002MT01-08 SS0002MT09-11 SS0002MT12-14	Xinxiang, Henan Bengbu, Anhui Jining, Shandong
Bubalus bubalis	20	SS0003MT01-14 SS0003MT15-17 SS0003MT18-20	Liuzhou, Guangxi Yangjiang, Guangdong Hengyang, Hunan
Capra hircus	28	SS0004MT01-22 SS0004MT23-25 SS0004MT26-28	Xinxiang, Henan Bengbu, Anhui Jining, Shandong
Ovis aries	18	SS0005MT01-12 SS0005MT13-15 SS0005MT16-18	Xinxiang, Henan Bengbu, Anhui Jining, Shandong

Latin name	No. of specimens	Voucher No.	Collection location
Bos grunniens	13	SS0001MT01-10 SS0001MT11-13	Kangding, Sichuan Xining, Qinghai Tianzhu, Gansu
Bos Taurus	14	SS0002MT01-08 SS0002MT09-11 SS0002MT12-14	Xinxiang, Henan Bengbu, Anhui Jining, Shandong
Bubalus bubalis	20	SS0003MT01-14 SS0003MT15-17 SS0003MT18-20	Liuzhou, Guangxi Yangjiang, Guangdong Hengyang, Hunan
Capra hircus	28	SS0004MT01-22 SS0004MT23-25 SS0004MT26-28	Xinxiang, Henan Bengbu, Anhui Jining, Shandong
Ovis aries	18	SS0005MT01-12 SS0005MT13-15 SS0005MT16-18	Xinxiang, Henan Bengbu, Anhui Jining, Shandong

No.	No. of samples	Format	Collection location	Species assignment
QR01-QR04	4	Horn tips	Anguo, Hebei	Bos grunniens
QR05-QR07	3	Horn wires	Beijing	Bos grunniens
QR08-QR10	3	Horn wires	Yulin, Guangxi	Bos grunniens
QR11	1	Horn wires	Anguo, Hebei	Bos grunniens
QR12	1	Horn wires	Nanchang, Jiangxi	Bos grunniens
QR13	1	Horn wires	Lasha, Xizang	Bos grunniens
QR14	1	Horn wires	Wulumuqi, Xinjiang	Bos grunniens
QR15-QR17	3	Horn wires	Kunming, Yunnan	Bos grunniens
QR18	1	Horn wires	Chongqing	Bos grunniens
QR19-QR23	5	Horn wires	Bozhou, Anhui	Bubalus bubalis
QR24-QR28	5	Horn wires	Beijing	Bubalus bubalis
QR29	1	Horn wires	Linzhao, Gansu	Bubalus bubalis
QR30, QR31	2	Horn wires	Guangzhou, Guangdong	Bubalus bubalis
QR32, QR33	2	Horn wires	Nanning, Guangxi	Bubalus bubalis
QR34	1	Horn wires	Yulin, Guangxi	Bubalus bubalis
QR35	1	Horn wires	Haikou, Hainan	Bubalus bubalis
QR36-QR39	4	Horn wires	Anguo, Hebei	Bubalus bubalis
QR40	1	Horn wires	Wuhan, Hubei	Bubalus bubalis
QR41, QR42	2	Horn wires	Nanjing, Jiangsu	Bubalus bubalis
QR43, QR44	2	Horn wires	Nanchang, Jiangxi	Bubalus bubalis
QR45, QR46	2	Horn wires	Yinchuan, Ningxia	Bubalus bubalis
QR47	1	Horn wires	Jinan, Shandong	Bubalus bubalis
QR48	1	Horn wires	Chengdu, Sichuan	Bubalus bubalis
QR49-QR51	3	Horn wires	Hehuachi, Sichuan	Bubalus bubalis
QR52	1	Horn wires	Lasha, Xizang	Bubalus bubalis
QR53	1	Horn wires	Bozhou, Anhui	Capra hircus
QR54, QR55	2	Horn wires	Beijing	Capra hircus
QR56	1	Horn powders	Chendu, Sichuan	Pythium sp.
QR57	1	Horn powders	Chendu, Sichuan	Attagenus sp.
QR58	1	Horn powders	Zhenzhou, Henan	Trichophyton sp.
QR59	1	Horn powders	Zhenzhou, Henan	Archaeoattacus sp.
QR60	1	Horn powders	Tianjin	Tinea sp.
QR61	1	Horn tips	Baoding, Hebei	No sequence
QR62	1	Horn wires	Kunming, Yunnan	No sequence

No.	No. of samples	Format	Collection location	Species assignment
QR01-QR04	4	Horn tips	Anguo, Hebei	Bos grunniens
QR05-QR07	3	Horn wires	Beijing	Bos grunniens
QR08-QR10	3	Horn wires	Yulin, Guangxi	Bos grunniens
QR11	1	Horn wires	Anguo, Hebei	Bos grunniens
QR12	1	Horn wires	Nanchang, Jiangxi	Bos grunniens
QR13	1	Horn wires	Lasha, Xizang	Bos grunniens
QR14	1	Horn wires	Wulumuqi, Xinjiang	Bos grunniens
QR15-QR17	3	Horn wires	Kunming, Yunnan	Bos grunniens
QR18	1	Horn wires	Chongqing	Bos grunniens
QR19-QR23	5	Horn wires	Bozhou, Anhui	Bubalus bubalis
QR24-QR28	5	Horn wires	Beijing	Bubalus bubalis
QR29	1	Horn wires	Linzhao, Gansu	Bubalus bubalis
QR30, QR31	2	Horn wires	Guangzhou, Guangdong	Bubalus bubalis
QR32, QR33	2	Horn wires	Nanning, Guangxi	Bubalus bubalis
QR34	1	Horn wires	Yulin, Guangxi	Bubalus bubalis
QR35	1	Horn wires	Haikou, Hainan	Bubalus bubalis
QR36-QR39	4	Horn wires	Anguo, Hebei	Bubalus bubalis
QR40	1	Horn wires	Wuhan, Hubei	Bubalus bubalis
QR41, QR42	2	Horn wires	Nanjing, Jiangsu	Bubalus bubalis
QR43, QR44	2	Horn wires	Nanchang, Jiangxi	Bubalus bubalis
QR45, QR46	2	Horn wires	Yinchuan, Ningxia	Bubalus bubalis
QR47	1	Horn wires	Jinan, Shandong	Bubalus bubalis
QR48	1	Horn wires	Chengdu, Sichuan	Bubalus bubalis
QR49-QR51	3	Horn wires	Hehuachi, Sichuan	Bubalus bubalis
QR52	1	Horn wires	Lasha, Xizang	Bubalus bubalis
QR53	1	Horn wires	Bozhou, Anhui	Capra hircus
QR54, QR55	2	Horn wires	Beijing	Capra hircus
QR56	1	Horn powders	Chendu, Sichuan	Pythium sp.
QR57	1	Horn powders	Chendu, Sichuan	Attagenus sp.
QR58	1	Horn powders	Zhenzhou, Henan	Trichophyton sp.
QR59	1	Horn powders	Zhenzhou, Henan	Archaeoattacus sp.
QR60	1	Horn powders	Tianjin	Tinea sp.
QR61	1	Horn tips	Baoding, Hebei	No sequence
QR62	1	Horn wires	Kunming, Yunnan	No sequence

Samples	DNA concentration/ng·μL^-1/DNA purity (A₂₆₀/A₂₈₀)
Bos grunniens horn	20.6/1.55	54.6/1.65	60.1/1.70	4.5/1.34
Bubalus bubalis horn	32.0/1.39	87.4/1.67	86.5/1.78	2.0/1.38
Capra hircus horn	23.8/1.56	55.5/1.78	52.3/1.67	18.7/1.39
Ovis aries horn	29.3/1.49	61.5/1.77	63.1/1.72	13.2/1.49
Bos taurus horn	20.6/1.55	61.2/1.67	67.3/1.80	7.2/1.58
Commercial medicine	20.1/1/45	55.1/1.76	57.9/1.80	8.1/1.23

Samples	DNA concentration/ng·μL^-1/DNA purity (A₂₆₀/A₂₈₀)
Bos grunniens horn	20.6/1.55	54.6/1.65	60.1/1.70	4.5/1.34
Bubalus bubalis horn	32.0/1.39	87.4/1.67	86.5/1.78	2.0/1.38
Capra hircus horn	23.8/1.56	55.5/1.78	52.3/1.67	18.7/1.39
Ovis aries horn	29.3/1.49	61.5/1.77	63.1/1.72	13.2/1.49
Bos taurus horn	20.6/1.55	61.2/1.67	67.3/1.80	7.2/1.58
Commercial medicine	20.1/1/45	55.1/1.76	57.9/1.80	8.1/1.23

Samples	DNA concentration/ng·μL^-1/DNA purity (A₂₆₀/A₂₈₀)
Bos grunniens horn	57.9/1.73	64.2/1.78	50.5/1.63	51.7/1.61
Bubalus bubalis horn	83.8/1.65	87.4/1.78	52.9/1.64	37.2/1.57
Capra hircus horn	64.5/1.71	93.1/1.81	58.7/1.77	51.5/1.56
Ovis aries horn	61.3/1.71	70.8/1.73	65.2/1.53	35.9/1.60
Bos taurus horn	62.8/1.84	67.8/1.83	49.3/1.61	51.2/1.60
Commercial medicine	54.9/1.77	56.1/1.79	37.8/1.78	39.7/1.61

Samples	DNA concentration/ng·μL^-1/DNA purity (A₂₆₀/A₂₈₀)
Bos grunniens horn	57.9/1.73	64.2/1.78	50.5/1.63	51.7/1.61
Bubalus bubalis horn	83.8/1.65	87.4/1.78	52.9/1.64	37.2/1.57
Capra hircus horn	64.5/1.71	93.1/1.81	58.7/1.77	51.5/1.56
Ovis aries horn	61.3/1.71	70.8/1.73	65.2/1.53	35.9/1.60
Bos taurus horn	62.8/1.84	67.8/1.83	49.3/1.61	51.2/1.60
Commercial medicine	54.9/1.77	56.1/1.79	37.8/1.78	39.7/1.61

Samples	DNA concentration/ng·μL^-1/DNA purity (A₂₆₀/A₂₈₀)
Bos grunniens horn	56.6/1.60	58.9/1.41	50.2/1.67
Bubalus bubalis horn	77.4/1.48	69.5/1.51	73.9/1.68
Capra hircus horn	50.5/1.44	57.8/1.50	52.7/1.78
Ovis aries horn	67.5/1.43	62.4/1.51	60.1/1.77
Bos taurus horn	65.0/1.43	67.3/1.48	56.9/1.67
Commercial medicine	57.3/1.50	47.2/1.50	55.1/1.76

Samples	DNA concentration/ng·μL^-1/DNA purity (A₂₆₀/A₂₈₀)
Bos grunniens horn	56.6/1.60	58.9/1.41	50.2/1.67
Bubalus bubalis horn	77.4/1.48	69.5/1.51	73.9/1.68
Capra hircus horn	50.5/1.44	57.8/1.50	52.7/1.78
Ovis aries horn	67.5/1.43	62.4/1.51	60.1/1.77
Bos taurus horn	65.0/1.43	67.3/1.48	56.9/1.67
Commercial medicine	57.3/1.50	47.2/1.50	55.1/1.76

Haplotype	508	571
A1	A	T
A2	T	C

Haplotype	508	571
A1	A	T
A2	T	C

Haplotype	11	220	226	235	496	499	601
B1	C	T	T	C	T	C	T
B2	C	C	C	T	C	T	C
B3	T	T	T	C	T	C	T

Haplotype	11	220	226	235	496	499	601
B1	C	T	T	C	T	C	T
B2	C	C	C	T	C	T	C
B3	T	T	T	C	T	C	T

Haplotype	12	50	157	184	265	382	502	607	634	646
C1	T	C	C	A	C	A	G	C	C	T
C2	C	T	T	G	T	T	A	T	T	C

Haplotype	12	50	157	184	265	382	502	607	634	646
C1	T	C	C	A	C	A	G	C	C	T
C2	C	T	T	G	T	T	A	T	T	C

Haplotype	151	334
D1	T	C
D2	C	C
D3	T	T

Haplotype	151	334
D1	T	C
D2	C	C
D3	T	T

Haplotype	157	187	359	385	406	472	490	523	544	565	601
E1	T	T	T	T	C	C	T	T	C	T	T
E2	T	C	C	C	C	A	T	C	C	T	C
E3	T	C	C	T	T	C	T	T	C	T	T
E4	T	T	C	T	C	C	T	T	C	T	T
E5	T	T	C	T	C	C	T	T	T	C	T
E6	C	T	C	T	C	C	T	T	C	T	T
E7	T	T	C	T	C	C	C	T	C	T	T

Haplotype	157	187	359	385	406	472	490	523	544	565	601
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E4	T	T	C	T	C	C	T	T	C	T	T
E5	T	T	C	T	C	C	T	T	T	C	T
E6	C	T	C	T	C	C	T	T	C	T	T
E7	T	T	C	T	C	C	C	T	C	T	T

基于COI序列的水牛角及其易混伪品DNA条形码鉴定研究

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刘旭朝 ¹^,² , 周丽思 ¹ , 刘金欣 ¹^,³ , 贾静 ¹ , 宋经元 ¹^,^* , 石林春 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2017,52(3): 494-499

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药学学报 | 研究论文 2017, 52(3): 494-499

基于COI序列的水牛角及其易混伪品DNA条形码鉴定研究

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刘旭朝¹^,², 周丽思¹, 刘金欣¹^,³, 贾静¹, 宋经元¹^,^*, 石林春¹^,^*

作者信息

1.中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室, 北京 100193

2.山东中医药大学药学院, 山东济南 250355

3.承德医学院, 河北省中药研究与开发重点实验室, 河北承德 067000

通讯作者:

* 宋经元, Tel:86-10-57833206, E-mail:lcshi@implad.ac.cn;

石林春, Tel:86-10-57833199, E-mail:jysong@implad.ac.cn

Identification of water buffalo horn and its adulterants using COI barcode

Xu-zhao LIU¹^,², Li-si ZHOU¹, Jin-xin LIU¹^,³, Jing JIA¹, Jing-yuan SONG¹^,^*, Lin-chun SHI¹^,^*

Affiliations

1. Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

2. College of Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

3. Hebei Key Laboratory of Study and Exploitation of Chinese Medicine, Chengde Medical College, Chengde 067000, China

出版时间: 2017-03-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2016-1020

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摘要

收起

水牛角作为犀角的代用品是急症用药安宫牛黄丸的主要成份，近年来常有混伪品流入市场，急需建立有效鉴定方法。本研究共收集155份原动物及市售水牛角样品，通过优化DNA提取方法，PCR扩增、双向测序、序列拼接获得153条COI序列。93份原动物COI序列经条形码间隔法和建树法核验后纳入中药材DNA条形码动物药材数据库，利用中药材DNA条形码鉴定系统（www.tcmbarcode.cn）对62份市售水牛角药材进行鉴定。除2份市售药材无法获得COI序列外，54.8%的市售药材为水牛角，29%的市售药材为牦牛角。本研究表明牦牛角为市售水牛角药材主要伪品来源，DNA条形码技术可用于区分水牛角及其易混伪品，应加强市场监管，以确保急症用药临床疗效。

关键词

水牛角 / COI序列 / DNA条形码 / 鉴定 / 混伪品

Abstract

收起

Bubali cornu (water buffalo horn) has been used as the substitute for Cornu rhinoceri asiatici (rhino horn) in clinical applications, and is the essential ingredient of Angong Niuhuang Wan. In recent years, there are a number of adulterants on the commercial herbal medicine markets. An efficient tool is required for species identification. In this study, 155 Bubali cornu samples have been taken from original animals and collected from commercial herbal medicine markets. 153 COI sequences have been successfully obtained from 155 samples through DNA extraction, PCR amplification, bidirectional sequencing and assembly. 93 COI sequences have been added to the DNA barcoding database of traditional Chinese animal medicine after validation using DNA barcoding GAP and tree-based methods. The species identification of the 62 commercial Bubali cornu medicines has been accomplished on the DNA barcoding system for identifying herbal medicine using the updated animal medicine database (www.tcmbarcode.cn). Except two samples failed to obtain COI sequences, 54.8% of the commercial Bubali cornu medicines were water buffalo horns and 29% were yak horns. Our results showed that yak horn was the major adulterant of Bubali cornu and the DNA barcoding method may accurately discriminate Bubali cornu and their adulterants. Therefore, we recommend that supervision on the herbal medicine markets should be strengthened with this new method to warren the effectiveness of herbal medicines.

Key words

water buffalo horn / COI sequences / DNA barcoding / identification / adulterants

引用本文

刘旭朝, 周丽思, 刘金欣, 贾静, 宋经元, 石林春. 基于COI序列的水牛角及其易混伪品DNA条形码鉴定研究. 药学学报, 2017 , 52 (3) : 494 -499 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-1020

Xu-zhao LIU, Li-si ZHOU, Jin-xin LIU, Jing JIA, Jing-yuan SONG, Lin-chun SHI. Identification of water buffalo horn and its adulterants using COI barcode[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017 , 52 (3) : 494 -499 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-1020

正文

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水牛角为牛科动物水牛Bubalus bubalisLinnaeus的角, 取角后, 水煮, 除去角塞, 干燥^[1]。上世纪60年代因犀角资源稀少, 商品奇缺, 价格昂贵, 科研工作者选取乙脑、小儿暑热等病症开展水牛角替代犀角临床实践研究, 指出“水牛角的性味、归经、功用、主治, 与犀角近似, 水牛角可用于犀角的适应症”^[2]。1977版《中国药典》增加对水牛角和水牛角浓缩粉的收载^[3]。1993年国务院颁布《关于禁止犀牛角和虎骨贸易的通知》, 《中国药典》删除收载犀角, 中药处方中所含有的犀角成分全部由水牛角或水牛角浓缩粉代替。2015版《中国药典》(一部) 收载含水牛角或水牛角浓缩粉的中成药44种^[1], 占所收载中药成方及单味制剂总量的11%, 包含被誉为中医治疗高热症“瘟病三宝”的安宫牛黄丸、局方至宝散和紫雪 (散)。市售水牛角的商品规格以水牛角丝为主, 缺乏完整性状鉴定特征, 难以准确鉴定到物种, 药市中常有以牦牛角或其他牲畜角混作水牛角销售现象, 急需建立有效的鉴定方法。

DNA条形码技术利用基因组内一段标准序列对物种进行鉴定, 不受材料外观形态影响^[4], 已经纳入《中国药典》^{[5, 6]}, 适用于中药材 (包括药材及部分饮片) 及基原物种的鉴定。本研究以COI序列为DNA条形码, 尝试建立基于DNA条形码技术的水牛角及其易混伪品鉴定方法, 为水牛角准确鉴别提供新方法, 保障其临床用药安全。

材料与方法

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材料

本研究共收集水牛角及其易混品的原动物和市售药材样品155份, 其中62份样品为市售水牛角药材, 来自安徽亳州药市、河北安国药市、四川荷花池药市、广西玉林药市等全国19个省份, 所有实验样品均保存于中国医学科学院药用植物研究所 (表 1和表 2)。

方法

DNA提取、PCR扩增及测序 使用超纯水将角类样品清洗干净。对于全角、角尖、角丝, 使用75%乙醇 (体积分数) 擦拭样品表面, 置于经紫外消毒的通风橱内30 min以挥干乙醇。使用骨钻、刮刀、剪刀、钥匙等工具取约60 mg样品, 使用液氮充分研磨至细粉。使用柱式骨骼DNAout试剂盒 (北京天恩泽基因科技有限公司) 提取总DNA。采用Nano Drop 2000 (Thermo Scientific, USA) 测定DNA浓度及A₂₆₀/A₂₈₀值。序列扩增、测序及数据处理依照中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则进行^[6]。

序列分析 采用BLAST和系统树 (NJ树) 分析防错方法, 核验新获得原动物COI序列的准确性, 并将核验准确的序列加入中药材DNA条形码动物药材数据库^[7]。基于中药材DNA条形码鉴定系统^[8]对市售水牛角药材进行鉴定。使用MEGA6.0软件构建系统发育树 (NJ树), 利用Bootstrap (1 000次重复) 检验各分支的支持率^[9]。

结果

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1 水牛角及其混伪品DNA提取方法优化

选取水牛、牦牛、黄牛、山羊、绵羊等5种原动物角类样品各1份, 市售水牛角样品1份, 从取样量、水浴时间和纯化流程3方面优化DNA提取方法。具体结果为: ①取样量:比较取样量30、60、90和200 mg对提取DNA浓度的影响。结果发现当取样量为60和90 mg时, DNA浓度均大于50 ng·μL^-1 (表 3); ②水浴时间:在取样量为60 mg时, 比较水浴时间0.5、1、2、8 h对提取DNA浓度的影响, 结果显示当水浴0.5和1 h时, DNA浓度在50~100 ng·μL^-1之间 (表 4); ③纯化流程:在取样量为60 mg、水浴时间1 h条件下, 比较3种纯化流程对提取DNA纯度的影响, 结果表明当采取溶液B+氯仿抽提2次时, 提取DNA的A₂₆₀/A₂₈₀值均在1.65~1.80之间 (表 5)。

2 水牛角及其易混伪品的原动物COI序列分析

共获得93条水牛角及其易混伪品的原动物COI序列, 经核验后均已纳入中药材DNA条形码鉴定系统数据库。水牛角共20条序列, 分为2个单倍型 (A1、A2), 含2个变异位点; 牦牛角共13条序列, 分为3个单倍型 (B1~B3), 含7个变异位点; 黄牛角共14条序列, 分为2个单倍型 (C1、C2), 含10个变异位点; 山羊角共28条序列, 分为3个单倍型 (D1~D3), 含2个变异位点; 绵羊角共18条序列, 分为7个单倍型 (E1~E7), 含11个变异位点。变异位点信息见表 6~10。5种原动物种内最大K-2P距离均小于0.015、种内平均K-2P距离均小于0.008。基于原动物单倍型构建的NJ系统发育树可以看出, 5种原动物各自聚为一支, 可以相互区分, Bootstrap支出率均为100%, 见图 1。

3 基于DNA条形码技术鉴定市售水牛角

登录中药材DNA条形码鉴定系统, 点击鉴定功能模块, 选择中药材DNA条形码动物药材数据库, 对购自药材市场和药店的水牛角药材进行基原物种鉴定, 结果表明: 34份市售水牛角药材基原动物为水牛, 占54.8%; 18份市售水牛角药材基原动物为牦牛, 占29.0%; 3份市售水牛角药材基原动物为山羊, 占4.8%, 2份样品无法获得COI序列, 占3.2%; 5份样品无法鉴定到基原物种, 已被卵菌 (oomycetes)、子囊菌 (ascomycetes)、甲虫 (beetles)、蛾 (moths) 等外源物污染, 占8.1 %鉴定结果见表 2。

讨论

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稳定获得高质量DNA是水牛角DNA条形码鉴定的前提。水牛角是高度角质化的真皮组织, 由角质细胞组成, 质地坚韧, 富含蛋白质, 存储过程中表面易发生虫蛀或霉变。因此, 如何充分消化角质细胞, 使DNA更易溶出, 避免虫蛀霉变部位污染, 是水牛角DNA成功提取的关键。①避免污染:市售水牛角商品规格有去角塞整角 (个子)、角尖、角丝、角粉, 个子、角尖和角丝可用75%乙醇清洗表面, 并在通风橱或超净工作台内挥干乙醇。角粉可先使用无菌水浸泡, 再使用75%乙醇短时清洗, 低速离心后弃去上清, 沉淀物在烘箱中低温烘干, 但实验结果显示5份角粉均发生虫蛀或霉变, 可能与角粉存储时间较长或存储方法不当有关。②研磨方法:实验初期, 将水牛角用组织研磨仪 (Retsch MM400) 研磨2~3次, 发现组织研磨仪不能将样品充分研碎, 消化效果较差, 需使用液氮将水牛角研磨至细粉。③提高DNA提取浓度和质量:减少取样量 (30~60 mg)、延长水浴时间 (1~2 h), 并将原有试剂盒中“加入溶液B和氯仿抽提”的操作重复1次, 可更好的去除蛋白质, 获得较高质量的DNA。

近年来水牛养殖数量持续下降, 水牛角制工艺品价格走高, 水牛角资源紧缺, 牦牛角已成为水牛角主要混伪品来源, 本研究中发现29%的市售药材为牦牛角。全世界约90%的牦牛生活在我国青藏高原等地区, 资源丰富, 且牦牛角丝与水牛角丝功能主治、外观性状一定程度相似。根据中华本草记载^[10], 牦牛角具有清热解毒、凉血熄风的功效, 主治高热惊痫、血热出血等症。Wang等^[11]研究证实牦牛角粗提取液有明显的解热和镇痛作用, 并从牦牛角粗提取液中分离得到不同分子量大小的具有解热和镇痛作用多肽。Shen等^[12]比较西藏牦牛角替代古方犀角汤中的犀角后对发热家兔的退热作用, 认为其退热作用与原古方作用相当。Wang等^{[13, 14]}通过元素、氨基酸、牛磺酸、胆固醇、氨基己糖等分析认为牦牛角较为接近犀 (广) 角。Shi等^[15]观察发现牦牛角超细粉对小鼠大剂量灌胃给药后, 小鼠自发活动明显减少, 表明牦牛角超细粉具有镇静催眠作用。但是, 在尚不明确其能否代替中药犀角应用于临床的情况下应加强对市售水牛角药材的监管, 以避免牦牛角混作水牛角使用。

据2015版《中国药典》记载^[1], 水牛角的鉴别方法为性状鉴别法和粉末显微鉴别法。市售水牛角药材商品规格多以牛角尖、牛角丝或牛角粉形式出现, 其外观形态已被破坏, 缺乏进行性状鉴定的形态特征。运用粉末显微鉴别法鉴定水牛角药材真伪要求鉴定人员具有扎实的专业背景知识和丰富的鉴定经验, 易受水牛角镑片和角尖粉碎工艺的影响。近年来, DNA条形码技术已广泛应用于植物类中药材 (包括药材及部分饮片) 及基原物种的鉴定^{[16, 17]}, 在动物类中药材的研究主要集中在水蛭^[18]、地龙^[19]、鹿茸^[20]、蕲蛇^[21]等较易获得DNA的动物药材中。Zhang等^[22]通过实验和GenBank下载获得《中国药典》45种动物药材的51种原动物COI序列, 为基于COI条形码鉴定《中国药典》中动物药材提供参考。Yan等^[23]运用DNA条形码技术对传统角类药材进行了鉴定研究, 并对保护濒危动物及其代替品的寻找提供了参考方法, 但该研究序列扩增为新设计的特异引物, 其应用具有一定的局限性。Jia等^[24]利用DNA条形码技术对市售鹿茸粉的基原物种进行鉴定, 证实了DNA条形码技术可准确、有效鉴别市售鹿茸粉饮片。本研究基于COI作为DNA条形码序列, 对市售水牛角进行基原鉴定, 证明DNA条形码技术可准确、有效鉴别市售水牛角药材。DNA条形码技术为《中国药典》关于水牛角的鉴定方法提供了有效的辅助手段, 可作为水牛角真伪鉴定的新方法, 同时也为中药材DNA条形码鉴定系统数据库提供了补充, 对保障传统角类药材的临床用药安全具有重要意义。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81303158)
国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目(2014ZX09304307001)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2017年第52卷第3期

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文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2016-1020

接收时间：2016-10-20
首发时间：2026-01-14
出版时间：2017-03-12

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作者

出版历史

收稿日期：2016-10-20
修回日期：2016-12-01

基金

国家自然科学基金资助项目(81303158)

国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目(2014ZX09304307001)

作者信息

1.中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室, 北京 100193

2.山东中医药大学药学院, 山东济南 250355

3.承德医学院, 河北省中药研究与开发重点实验室, 河北承德 067000

通讯作者:

* 宋经元, Tel:86-10-57833206, E-mail:lcshi@implad.ac.cn;

石林春, Tel:86-10-57833199, E-mail:jysong@implad.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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