药学学报

阿司匹林抑制HGF/c-Met介导的肿瘤细胞转移作用

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代晓阳 ^* , 陈思康 , 车金鑫

药学学报 | 专题报道Ⅰ：药物发现的新靶标、新策略与抗病毒药物研究 2022,57(10): 2985-2994

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药学学报 | 专题报道Ⅰ：药物发现的新靶标、新策略与抗病毒药物研究 2022, 57(10): 2985-2994

阿司匹林抑制HGF/c-Met介导的肿瘤细胞转移作用

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代晓阳^*, 陈思康, 车金鑫

作者信息

浙江大学药学院, 浙江杭州 310058

通讯作者:

*代晓阳, Tel: 86-571-88208076, E-mail: daixiaoyang@zju.edu.cn

Aspirin inhibits tumor cell metastasis mediated by HGF/c-Met

Xiao-yang DAI^*, Si-kang CHEN, Jin-xin CHE

Affiliations

College of Pharamaceutical Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

出版时间: 2022-10-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0674

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摘要

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本研究主要探讨了阿司匹林对肝细胞生长因子/细胞间质表皮转化因子受体(HGF/c-Met) 轴介导的肿瘤生物学效应的影响, 初步探究阿司匹林抑制肿瘤转移的分子机制。利用分子模拟预测阿司匹林与c-Met的结合情况; 采用蛋白质胞内热稳定性实验验证阿司匹林在细胞水平与c-Met的结合情况; 采用激酶活性检测阿司匹林对c-Met激酶的抑制作用; Western blot、细胞分散实验、细胞分枝形态变化实验及Transwell实验用于检测细胞信号转导、形态与迁移能力的变化。结果显示, 阿司匹林能够有效抑制c-Met的激酶活性, 半数抑制浓度为0.95 mmol·L^-1。分子模拟实验结果显示, 阿司匹林能够结合在c-Met蛋白的ATP口袋, 主要结合位点为Tyr1230、Tyr1159和Met1229。同样, 蛋白质胞内热稳定性实验显示, 阿司匹林能够与c-Met蛋白结合。Western blot结果显示, 阿司匹林能够浓度依赖性地抑制HGF刺激后磷酸化Met的上调。细胞分散实验结果显示, 阿司匹林能够浓度依赖性地阻断HGF/c-Met介导的细胞分散, 在4 mmol·L^-1浓度下阿司匹林几乎可以完全阻断c-Met活化介导的生物学功能, 且该阻断作用与HGF无关。同样, 细胞分枝实验结果显示, 阿司匹林能够浓度依赖性抑制HGF/c-Met介导的MDCK细胞侵袭性生长细胞分枝的形态变化。Transwell实验结果显示, 阿司匹林能够浓度依赖性地阻断HGF/c-Met介导的细胞迁移与侵袭, 在4 mmol·L^-1浓度下阿司匹林几乎可以完全阻断c-Met活化介导的生物学功能, 且该阻断作用与HGF无关。以上结果表明, 阿司匹林能够与c-Met结合, 进而阻断HGF/c-Met介导的生物学效应, 从而发挥抑制肿瘤转移的作用。本研究揭示了阿司匹林的新生物学功能, 为全面理解阿司匹林的抗肿瘤转移作用提供了新的理论基础。

关键词

阿司匹林 / 肿瘤转移 / HGF/c-Met / 受体酪氨酸激酶 / 小分子抑制剂

Abstract

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In this study, we investigated the effect of aspirin on tumor biological effects mediated by hepatocyte growth factor/cellular-mesenchymal-epithelial transition factor (HGF/c-Met) axis, and preliminarily explored the molecular mechanism of inhibiting tumor metastasis by aspirin. The binding of aspirin to c-Met was predicted by molecular docking; cellular thermal shift assay (CETSA) was used to verify the binding of aspirin to c-Met at the cellular level. The inhibitory effect of aspirin on c-Met kinase was detected by kinase activity; Western blot, cell scattering test, cell branching morphogenesis and Transwell test were used to evaluate the cell signal transduction, morphological changes and migration and invasion ability. The results showed that aspirin could effectively inhibit the kinase activity of c-Met with a half inhibitory concentration of 0.95 mmol·L^-1. The results of docking showed that aspirin could bind to the ATP pocket of c-Met protein, and the main binding sites were Tyr1230, Tyr1159 and Met1229. The CETSA test also showed that aspirin could form binding complex with c-Met protein. Western blot results showed that aspirin could inhibit the up-regulation of phosphorylated Met stimulated by HGF in a concentration-dependent manner. The results of cell scattering test showed that aspirin could block HGF/c-Met promoted cell scattering in a concentration dependent manner. Aspirin could almost completely block the biological function mediated by c-Met activation at the concentration of 4 mmol·L^-1, and this effect was independent of HGF. Similarly, the results of MDCK cell branching morphogenesis experiment showed that aspirin could inhibit HGF/c-Met mediated invasive growth in a concentration dependent manner. The results of Transwell test showed that aspirin could block HGF/c-Met mediated cell migration and invasion in a concentration-dependent manner. Aspirin could almost completely block the biological function mediated by c-Met activation at the concentration of 4 mmol·L^-1, and this effect was independent of HGF. The above results indicate that aspirin can bind to c-Met, thereby blocking the biological effects mediated by HGF/c-Met, and inhibiting tumor metastasis. This study revealed the new biological function of aspirin, and provided a new theoretical basis for a comprehensive understanding of the anti-metastatic effect of aspirin.

Key words

aspirin / tumor metastasis / HGF/c-Met / receptor tyrosine kinase / small molecule inhibitor

引用本文

代晓阳, 陈思康, 车金鑫. 阿司匹林抑制HGF/c-Met介导的肿瘤细胞转移作用. 药学学报, 2022 , 57 (10) : 2985 -2994 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0674

Xiao-yang DAI, Si-kang CHEN, Jin-xin CHE. Aspirin inhibits tumor cell metastasis mediated by HGF/c-Met[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2022 , 57 (10) : 2985 -2994 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0674

正文

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癌症患者死亡的重要原因之一在于肿瘤恶性进展导致的转移累积重要脏器, 临床中约有90%的患者死于肿瘤转移^[1]。Stephen Page提出的肿瘤转移“种子与土壤”学说, 阐述了肿瘤转移是一个涉及多基因、多因素的复杂生物学过程^[2-4]。近年来, 越来越多的研究表明肿瘤细胞的可塑性与肿瘤微环境是转移的关键因素^[5-9]。细胞间质表皮转化因子(cellular-mesenchymal-epithelial transition factor, c-Met) 及其配体肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF) 所介导的信号轴在细胞可塑性和肿瘤-肿瘤微环境交互中发挥着重要作用。

研究显示, c-Met在恶性肿瘤如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、肠癌等均存在高表达或基因突变的情况^[10-14]。c-Met是由MET基因编码生成的酪氨酸激酶受体, 可分为胞外段、跨膜段和胞内段。其中, 胞外N端由氨基酸残基25~514组成的SEMA结构域是配体识别区, HGF是c-Met目前已知的唯一配体。胞内段包括了近膜结构域、催化结构域和功能结合域。在上述恶性肿瘤中, HGF与c-Met胞外结构域结合后, 促使酪氨酸激酶残基在催化结构域发生磷酸化, 形成c-Met异常活化的状态, 激活多个肿瘤依赖性的信号通路, 进而介导肿瘤转移等恶性演进事件, 如细胞形态的变化、运动能力的增强、耐药等。因此, 寻找、合成靶向阻断HGF/c-Met的药物具有较好研发及应用前景。

阿司匹林(aspirin) 又名乙酰水杨酸, 是典型的非甾体类抗炎药, 在临床中应用于解热镇痛、预防血栓等, 已有百年的应用史。近些年来, 伴随着大量的流行病学研究、临床前体内外实验及临床试验发现, 长期服用阿司匹林能够有效降低胃癌、结直肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤的发生率及肿瘤转移的发生风险等^[15-19]。目前认为阿司匹林的抗肿瘤作用机制主要分为环氧化酶(cyclooxygenase, COX) 依赖性和COX非依赖性两类。其中, COX依赖途径更多的是通过乙酰化COX-1/COX-2, 调控前列腺素E2、降低原癌基因, 增强特异性促炎症消退介质, 进而介导炎性、免疫调控等途径抑制肿瘤细胞的生长和免疫逃逸^[20-22]。COX非依赖相关作用机制主要集中于其乙酰化功能(如乙酰化P53、HDAC2、HE3K) 及对周期阻滞、凋亡及肿瘤干性关键基因与蛋白的调控功能^[23-28]。阿司匹林临床作用广泛, 其抗肿瘤与抗肿瘤转移作用并不能仅从抗炎作用解释。越来越多关于阿司匹林的靶点研究广泛开展, 揭示了这一传统药物的多靶点特征与不同的药理作用机制, 本团队2017年发现阿司匹林可以通过靶向乙酰肝素酶的酶活性功能及降低其表达进而抑制肿瘤转移的作用^[29]。近年有研究表明, HGF/c-Met的活化能够促进乙酰肝素酶表达, 乙酰肝素酶又可以通过其酶活性功能进一步调控HGF的表达与释放, 进而促进肿瘤侵袭转移^[30]。基于此, 本研究拟在前期研究与文献报道的基础上, 进一步拓展阿司匹林的抗转移作用是否与抑制HGF/c-Met的活化有关, 探究阿司匹林对c-Met活性抑制及对HGF/c-Met信号轴的阻断功能, 进而深入了解阿司匹林的抗肿瘤转移作用。

材料与方法

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主要试剂及材料 阿司匹林、磺酰罗丹明B (SRB) 购自美国Sigma-Aldrich公司; c-MET、poly (4∶1 Glu, Tyr) peptide、kinase assay buffer Ⅲ均购自加拿大SignalChem公司; ADP-GloTM reagent和kinase detection购自于美国Promega公司; Met (D1C2) XP^® rabbit mAb、phospho-Met (Tyr1234/1235) (D26) XP^® rabbit mAb、Akt (pan) (C67E7) rabbit mAb、phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® rabbit mAb、p44/42 MAPK (Erk1/2) (137F5) rabbit mAb均购买自美国Cell Signalling Technology公司; anti-GAPDH (db106) 购买自杭州戴格生物; DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司; 重组人源HGF购自美国PeproTech公司; I型胶原、Materigel均购自美国BD公司; Transwell 24孔板(8 μm) 购自美国Corning公司。

细胞培养 人皮肤癌细胞A431、肝癌细胞SMMC-7721均购自中国科学院上海细胞库, 犬肾上皮细胞MDCK购自ATCC。A431细胞和MDCK细胞均培养于DMEM培养基, SMMC-7721培养于RPMI-1640培养基, 所有培养基均加入10% FBS、1%双抗(青霉素/链霉素), 放置于二氧化碳培养箱在37 ℃、5% CO₂的条件下培养。

分子对接 c-Met蛋白晶体结构(PDB ID: 7B44) 通过RCSB网站数据库获得, 经Schrödinger 2021-2软件的Protein Preparation Wizard模块对蛋白结构进行预处理、修补缺失侧链原子、氢原子优化和能量最小化。阿司匹林分子通过软件的LigPrep模块对配体分子结构进行预处理: 加氢、质子化及能量最小化。以上预处理过程均在OPLS4的力场下进行, 参数均选择默认参数。

使用Glide模块的Receptor Grid Generation功能在c-Met蛋白的ATP结合口袋构建受体活性口袋文件, 然后使用Ligand Docking功能在SP (standard prediction) 模式下将预处理过的阿司匹林配体小分子对接进入受体蛋白上的活性口袋并计算RMSD值, 每个配体构象输出5个对接构象, 依据对接打分和目视决策挑选最可能的结合构象。

分子动力学模拟 使用Schrödinger 2021-2软件进行分子动力学模拟, 在System Builder模块中将分子对接所得蛋白配体复合物加上模拟溶剂体系以模拟体内环境, 溶剂体系选择SPC水溶剂, 最小化溶剂体系体积, 并加盐中和体系, 通过Molecular Dynamics模块在OPLS4分子力场中执行分子动力学模拟, 在NPT系统下(300.0 K, 1.013 25 bar) 开展10 ns分子动力学模拟, 每隔10 ps记录一次轨迹。使用Simulation Interactions Diagram模块分析动力学轨迹中蛋白和配体的RMSD和非共价相互作用。其余选项均使用模块默认参数。

蛋白质胞内热稳定性实验(cellular thermal shift assay, CETSA) 处于对数生长期的SMMC-7721细胞用胰酶消化, 收集细胞并用PBS缓冲液重悬, 置于EP管中。分别给予终浓度为20 mmol·L^-1阿司匹林或等体积DMSO, 置于室温30 min后, 细胞悬液在所示温度条件下孵育10 min。对热刺激后的细胞进行裂解, 离心后取上清可溶性蛋白液制备样本, 并用Western blot考察c-Met的热稳定性。

c-Met激酶活性检测 冰上解冻c-Met酶(胞内区)、poly (4∶1 Glu, Tyr) peptide, kinase assay buffer Ⅲ等试剂备用, 按每孔1 μL的体积将0.064、0.32、1.6、8、40、200 μmol·L^-1和1、2、4、8 mmol·L^-1阿司匹林加入384微孔板中, 同时设置空白对照孔、阳性对照孔(1% DMSO, 不影响c-Met活性)。将c-Met酶用kinase assay buffer Ⅲ工作液稀释至2 ng·μL^-1, 按每孔1 μL的体积加入到384微孔板中(空白对照孔不加), 1 000 r·min^-1离心1 min。配制poly (4∶1 Glu, Tyr) peptide/ATP混合液, 并按照每孔2 μL的体积加入到384微孔板中, 1 000 r·min^-1离心1 min, 贴膜密封30 ℃孵育1 h。取5 μL ADP-Glo^TM reagent加入384微孔板中, 30 ℃中孵育40 min后, 每孔中加入10 μL kinase detection混合, 继续于30 ℃中孵育30 min; 孵育结束后进行化学发光检测, 读取发光值(RLU), 计算相对酶活力及抑制率, 拟合计算半数抑制浓度(IC₅₀): 相对酶活力(%) = (RLU_样品 - RLU_空白) / (RLU_{1% DMSO} - RLU_Blank)×100%, 抑制率= 100% - 相对酶活力%。

SRB法测定细胞增殖抑制率 取对数生长期的细胞, 胰酶消化后配制成每毫升5×10⁴个的细胞密度, 按照每孔90 μL细胞悬液的标准接种于96孔板中。过夜贴壁生长后, 按照每孔10 μL的体积加入0.25、0.5、1、2、4 mmol·L^-1阿司匹林, 每个浓度设置3个平行孔, 并设置空白对照组。培养至实验所设定时间后, 用10%预冷的三氯乙酸(TCA) 于4 ℃固定细胞, 完成细胞固定后冲洗TCA, 待其自然干燥。干燥后加入SRB溶液染色30 min, 用1%冰醋酸洗涤后烘干。加入10 mmol·L^-1的Tris溶液溶解后, 酶标仪515 nm波长下测定OD值。按以下公式计算阿司匹林对细胞生长的抑制率。抑制率= (OD_{空白对照组} - OD_给药组)/OD_{空白溶剂对照组}×100%。

Western blot 将SMMC-7721细胞接种于6孔板过夜培养, 在无血清的条件下饥饿24 h后, 加入0.5、1、2、4 mmol·L^-1阿司匹林在37 ℃下处理2 h, 用HGF 100 ng·mL^-1刺激15 min, 然后每孔加入适量的细胞裂解液, 收集样本, 100 ℃煮样10 min。10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白, 湿法转膜将蛋白转至PVDF膜, 5%脱脂奶粉封闭1 h, 与相应的抗体于4 ℃孵育过夜。次日, 用TBST室温洗膜3次, 每次10 min。加入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗, 室温孵育1 h。然后用TBST室温漂洗3次, 每次10 min。根据曝光强度选择合适的发光试剂进行显色, 通过超灵敏多功能成像仪进行成像。

细胞分散实验 将MDCK细胞按照每孔1.5×10³个细胞的接种量, 接种于96孔板中, 培养过夜。将1、2、4 mmol·L^-1阿司匹林与100 ng·mL^-1 HGF加入对应的孔中, 37 ℃、5% CO₂下培养24 h后, 4%多聚甲醛固定15 min, 接着使用0.2%结晶紫染色, 冲洗多余染料干燥后采集图片。在阿司匹林撤药实验中, 先将0.25、0.5、1、2、4 mmol·L^-1阿司匹林加入96孔板中作用6 h后, 再更换新的培养基(含100 ng·mL^-1 HGF) 继续培养24 h后进行同样的操作。

细胞分枝形态变化实验 收集MDCK细胞并调整至每毫升2×10⁴个细胞的密度, 按照1∶1的比例与I型胶原混合, 混合均匀后以每孔0.1 mL的体积接种于96孔板, 37 ℃、5% CO₂下培养45 min后, 向每个孔中添加100 μL的培养基(含100 ng·mL^-1 HGF及1、2、4 mmol·L^-1阿司匹林)。每隔两天更换新鲜培养基, 第5天采集图像。

细胞迁移与侵袭实验 收集SMMC-7721、A431细胞, 将1.5×10⁵个细胞重悬于100 μL无血清的培养基接种于Transwell上室, 下室加入600 μL含100 ng·mL^-1 HGF的无血清培养液, 在上下两室中均加入1、2、4 mmol·L^-1阿司匹林。37 ℃、5% CO₂下培养24 h。培养结束弃上室培养基, 90%乙醇4 ℃固定细胞, 0.1%结晶紫室温染色15 min, 洗除多余染料后采集图像分析。在阿司匹林预处理实验中, 先将0.25、0.5、1、2、4 mmol·L^-1阿司匹林加入6孔板中与SMMC-7721细胞孵育48 h后, 再收集细胞进行上述迁移实验, 实验过程中不再添加阿司匹林。侵袭实验时先将Transwell小室用Matrigel (与无血清培养基按照1∶15稀释) 包被过夜后弃去包被液再使用, 细胞接种量为3×10⁵个细胞重悬于100 μL无血清的培养基。

统计学分析 使用GraphPad Prism 8.0作图, 实验数据以均数±标准差(x±s) 表示。采用SPSS V27统计分析, 组间采用单因素方差分析(one-way ANOVA), P < 0.05视为有统计学意义。

结果

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1 阿司匹林可与c-Met结合并形成稳定结构

分子对接结果显示, 阿司匹林能够较好地结合在c-Met蛋白的ATP结合口袋(图 1A), Glide docking score = -6.415 kcal·mol^-1, 阿司匹林的羧基能够与c-Met蛋白的Tyr1230形成氢键, 苯环与Tyr1159形成pi-pi相互作用, 并且乙酰基上的羰基氧原子通过水桥与Met1229间接产生氢键相互作用(图 1B), 且分子动力学模拟结果表明该体系结合稳定(图 1C), 观察c-Met蛋白各残基对其与阿司匹林结合的相互作用力贡献, Tyr1230和Tyr1159是结合过程中的关键氨基酸残基(图 1D)。

2 阿司匹林在细胞内可与c-Met结合, 影响c-Met的稳定性

通常, 化合物与靶蛋白结合后, 靶蛋白的热稳定性将会发生改变^[31]。为了验证阿司匹林在肿瘤细胞中靶向c-Met的作用, 本研究开展了CETSA。如图 2结果所示, 内参蛋白在各温度条件下丰度稳定不变。而c-Met的蛋白丰度在温度升高的情况下逐渐降低, 但在48.2、50.8、55.3 ℃时, 阿司匹林处理组c-Met的蛋白丰度皆高于DMSO对照组。以上结果提示, 阿司匹林可结合至潜在靶点c-Met上, 进而增强c-Met的热稳定性。

3 阿司匹林可抑制c-Met的激酶活性

通过结合激酶的ATP口袋, 进而阻断激酶活性是典型的小分子抑制剂作用方式。分子对接的实验结果提示, 阿司匹林有可能通过结合于ATP口袋直接抑制c-Met的活性。为了验证这一假说, 本研究采用体外激酶活性测定的方式检测了阿司匹林对c-Met激酶活性的影响。结果显示, 阿司匹林能够有效抑制c-Met的激酶活性, IC₅₀为0.95 mmol·L^-1, 在4 mmol·L^-1可以达91.33% ± 2.28%的抑制率(图 3)。

4 阿司匹林可抑制HGF刺激的c-Met信号转导

进一步探究阿司匹林在细胞内对c-Met激酶活性的抑制作用, 如图 4 Western blot结果显示, 阿司匹林能够抑制HGF刺激的c-Met磷酸化及其关键下游分子AKT、ERK的磷酸化。

5 阿司匹林可抑制HGF/c-Met介导的细胞分散

HGF与c-Met结合后形成的活化信号轴可促进细胞分散, 刺激细胞脱离原始环境, 是肿瘤发生转移与侵袭的重要标志。本研究采用HGF刺激MDCK细胞分散的实验, 评估阿司匹林对HGF/c-Met介导的细胞分散的影响。如图 5所示, 阿司匹林处理后能够剂量依赖性地抑制HGF/c-Met介导的MDCK细胞分散, 在4 mmol·L^-1剂量下几乎能够完全阻断细胞分散(图 5C~E)。为了明确阿司匹林是通过与c-Met结合而非与HGF结合进而抑制HGF/c-Met介导的细胞分散, 在实验中设置阿司匹林预处理组, 即先将阿司匹林与MDCK共孵育6 h, 撤药后更换含有HGF的新鲜培养基。结果显示, 阿司匹林预处理依然能够有效抑制HGF/c-Met介导的MDCK细胞分散, 且呈现浓度依赖性(图 5F~H)。

6 阿司匹林可抑制HGF/c-Met介导的细胞分枝

目前已知c-Met活化后能够诱导系列生物学效应, 共同促进细胞的侵袭性生长。基于此, 本研究采用3D培养模型, 通过HGF激活c-Met进而刺激MDCK细胞在胶原三维环境的侵袭性生长出现分枝等形态变化。与文献^{[32, 33]}一致, 在没有给予HGF刺激的情况下, 仅观察到MDCK细胞的圆形囊肿, 给予HGF刺激后MDCK细胞则出现分枝结构。然后, 本研究评估了阿司匹林对HGF/c-Met介导的这一形态变化的影响, 与前述实验一致, 在给予阿司匹林后能够明显抑制MDCK细胞的这种分枝形态发生(图 6), 表明阿司匹林抑制了HGF刺激的c-Met介导的侵袭性生长。

7 阿司匹林可抑制HGF/c-Met介导的肿瘤细胞转移与侵袭

目前, 已明确HGF/c-Met的活化能够促进肿瘤细胞迁移运动能力的增强。因此, 本研究采用Transwell模型评价了阿司匹林对于HGF/c-Met介导的肿瘤细胞迁移与侵袭能力的影响(图 7、8)。首先, 本研究进行了阿司匹林对肿瘤细胞杀伤功能的考察, 选取不高于30%抑制率的作用浓度及作用时间进行后续的迁移实验(图 7A和8A)。从肿瘤细胞迁移实验的结果中可以看出, 在HGF刺激下, A431细胞和SMMC-7721细胞的运动能力明显增强(图 7C和8C)。而在给予阿司匹林后, 可以看到其能够浓度依赖性地抑制HGF/c-Met诱导的肿瘤细胞迁移, 4 mmol·L^-1剂量下几乎可以完全阻止SMMC-7721细胞和A431细胞的迁移运动能力(图 7D~F和8D~F)。为了明确该效应是由阿司匹林作用于c-Met引起的, 本课题组再次采用了预处理的方式, 先将细胞与阿司匹林孵育48 h, 撤除阿司匹林后再将肿瘤细胞用HGF进行刺激的方法进行验证。同样, 结果显示即使在撤除阿司匹林后, HGF刺激c-Met活化促进肿瘤细胞迁移的能力依然受到限制, 且呈现出阿司匹林浓度依赖性(图 7G~I)。在肿瘤侵袭实验中(图 7J~N), 同样可以观察到, 阿司匹林剂量依赖性地抑制HGF/c-Met促进肿瘤细胞的侵袭能力。以上结果表明, 阿司匹林抑制HGF/c-Met介导的肿瘤迁移与侵袭能力, 且抑制作用直接作用于c-Met, 与HGF无关。

讨论

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c-Met作为一种原癌基因在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色^[34]。已有大量研究报道, HGF/c-Met在多种恶性肿瘤中高表达且异常活化, 其高表达与HGF的旁分泌/自分泌失调、MET基因扩增相关, HGF/c-Met轴的异常活化则与c-Met基因突变有关, 尤其是外显子14跳跃突变导致c-Met泛素化降解受到抑制, 进而持续激活。也有研究表明, 肿瘤细胞在低氧环境可刺激c-Met的转录进而导致HGF/c-Met轴过表达与活化^[35]。关于c-Met功能的研究揭示了, HGF/c-Met轴所介导的信号转导与肿瘤细胞形态转化、侵袭性生长、迁移侵袭和恶性增殖、血管新生及耐药性密切相关^{[36, 37]}。因此, HGF/c-Met是一个极具前景的肿瘤治疗靶点, 靶向阻断HGF/c-Met轴对于肿瘤治疗具有重要的临床治疗与应用意义。包括我国的赛沃替尼在内, 全球有5款c-Met小分子抑制剂和1款抗体药物上市^[38]。虽然已展现出令人欣喜的临床效果, 但仍然存在着诸如毒副作用强等缺陷。寻找高效、低毒性的靶向HGF/c-Met小分子抑制剂仍具有重要的意义。

阿司匹林在临床中已应用百年, 大量研究数据显示, 阿司匹林能够抑制肿瘤转移、协同增效其他抗肿瘤药物等作用, 但其作用机制仍未阐释清楚^{[19, 21, 39]}。本研究基于分子模拟及体外实验验证, 首次发现阿司匹林能够与c-Met结合, 阻断HGF/c-Met信号轴, 进而抑制该信号轴所介导的生物学效应。本研究评估了阿司匹林对于HGF/c-Met信号轴介导的生物学效应的抑制作用。阿司匹林在1 mmol·L^-1的浓度下即可有效抑制HGF/c-Met介导的MDCK细胞的分散及肿瘤细胞SMMC-771和A431的迁移运动能力, 且呈现浓度依赖性, 在4 mmol·L^-1的浓度下几乎可以完全抑制HGF刺激c-Met活化的生物学效应。同样地, 在HGF刺激下, 4 mmol·L^-1阿司匹林能够有效抑制c-Met介导细胞侵袭性生长的形态变化。

为了明确阿司匹林的作用靶点是c-Met而非HGF, 本研究在细胞分散实验和肿瘤细胞迁移实验中设置了阿司匹林预处理组作为比较。结果显示, 撤除预处理的阿司匹林后, 细胞响应HGF刺激的程度依然被限制, 且抑制作用与阿司匹林浓度依赖性相关。这些结果佐证了阿司匹林直接作用于c-Met进而阻断HGF/c-Met轴的假说。本研究进一步采用激酶活性检测和分子对接模拟的手段评估阿司匹林与c-Met直接作用的相关性。结果显示, 阿司匹林能够抑制c-Met的激酶活性, IC₅₀为0.95 mmol·L^-1。并且分子对接的结果表明, 阿司匹林与已上市c-Met抑制剂克唑替尼的作用方式类似, 克唑替尼与c-Met蛋白的Met1160形成氢键相互作用, 和Pro1158在c-Met激酶的铰链区形成氢键, 并与Tyr1230残基产生pi-pi堆积。而阿司匹林能够结合于c-Met蛋白的Tyr1230形成氢键, 苯环与Tyr1159形成pi-pi相互作用, 并且乙酰基上的羰基氧原子通过水桥与Met1229间接产生氢键相互作用。

尽管相对于c-Met小分子抑制剂而言, 阿司匹林对于c-Met激酶活性的半数抑制浓度略高, 但由于阿司匹林的低毒性, 在临床中实现这一血药浓度依然具有可行性。如阿司匹林应用于抗风湿时候, 临床用量为每日3~5 g, 血药浓度为0.83~1.67 mmol·L^{-1 [40]}。有文献^[30]报道HGF/c-Met的活化能够促进乙酰肝素酶表达, 乙酰肝素酶又可以进一步调控HGF的表达与释放, 进而促进肿瘤侵袭转移。结合本文研究者前期已发表的阐述阿司匹林能够抑制乙酰肝素酶活性的研究^[29], 可以推断阿司匹林在抑制肿瘤转移过程中发挥着多靶点抑制的功效, 这也进一步解释了为何体外研究中阿司匹林需要相对较高浓度才能够发挥抗肿瘤效应。本研究为全面理解阿司匹林的抗肿瘤转移作用提供了一种新的理论依据, 同时也为靶向HGF/c-Met的小分子抑制剂研发提供了新的方向与策略。

作者贡献: 代晓阳负责本研究设计思路; 车金鑫负责分子对接相关实验的设计; 代晓阳、陈思康负责完成相关实验研究, 并完成撰写论文工作。

利益冲突: 所有作者声明不存在利益冲突。

基金

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浙江大学实验技术研究项目(SJS202016)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Chaffer CL, Weinberg RA. A perspective on cancer cell metastasis[J]. Science, 2011, 331: 1559-1564.

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2022年第57卷第10期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0674

接收时间：2022-05-30
首发时间：2025-12-24
出版时间：2022-10-12

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出版历史

收稿日期：2022-05-30
修回日期：2022-07-01

基金

浙江大学实验技术研究项目(SJS202016)

作者信息

浙江大学药学院, 浙江杭州 310058

通讯作者:

*代晓阳, Tel: 86-571-88208076, E-mail: daixiaoyang@zju.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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