药学学报

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Run	Target cell (×10⁵ per mL)	Effector cell (×10⁵ per mL)	Induction time/h	R²	Window value
4	30	30	20	0.971	4.26
5	60	10	3	0.972	1.95
7	30	5	6	0.969	7.63
9	60	30	3	0.972	2.70
14	60	5	6	0.987	11.19
15	30	30	3	0.995	1.64
19	30	60	3	0.993	2.01
22	10	10	3	0.962	0.75
26	30	5	3	0.960	2.08
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39	60	30	4.5	0.999	8.72
40	30	10	6	0.996	9.65
41	60	10	6	0.994	9.44

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41	60	10	6	0.994	9.44

利用实验设计优化和建立抗CD38单克隆抗体ADCP生物学活性测定方法

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刘春雨 ¹ , 于传飞 ¹ , 李欣 ² , 付志浩 ¹ , 崔永霏 ¹ , 郭璐韵 ¹ , 王兰 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2022,57(5): 1459-1464

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药学学报 | 研究论文 2022, 57(5): 1459-1464

利用实验设计优化和建立抗CD38单克隆抗体ADCP生物学活性测定方法

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刘春雨¹, 于传飞¹, 李欣², 付志浩¹, 崔永霏¹, 郭璐韵¹, 王兰¹^,^*

作者信息

1.中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室, 国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室/国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室, 北京 102629

2.广州市药品检验所, 广州 510160

通讯作者:

*王兰, E-mail: wanglan@nifdc.org.cn

A method for measuring the ADCP potency of anti-CD38 monoclonal antibody

Chun-yu LIU¹, Chuan-fei YU¹, Xin LI², Zhi-hao FU¹, Yong-fei CUI¹, Lu-yun GUO¹, Lan WANG¹^,^*

Affiliations

1. Division of Monoclonal Antibody, National Institutes for Food and Drug Control, NHC Key Laboratory of Research on Quality and Standardization of Biotech Products, NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Biological Products, Beijing 102629, China

2. Guangzhou Insititue for Drug Control, Guangzhou 510160, China

出版时间: 2022-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-1613

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摘要

收起

利用实验设计(design of experiment, DoE) 方法建立抗CD38单抗(monoclonal antibody, mAb) 的抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP) 生物学活性检测方法。以Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ转基因细胞系作为效应细胞, Daudi细胞系作为靶细胞, 通过荧光素酶检测系统(BrightGlo^TM Luciferase Assay system) 检测抗CD38单抗的ADCP生物学活性, 并运用DoE方法进行实验参数优化。结果显示, 抗CD38单抗在该方法中存在量效关系, 且符合四参数方程: y = (A - D) / [1 + (x / C)^B] + D, 方法经统计学实验设计对多个实验参数进行筛选和优化, 确定抗体工作浓度为800~20.81 ng·mL^-1, 靶细胞和效应细胞的接种量分别为每孔7.5×10⁴和2.5×10⁴个, 诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性; 5个不同组回收率样本经3次检测, 相对效价分别为(59.97 ± 4.74) %、(82.44 ± 5.15) %、(110.69 ± 11.71) %、(129.23 ± 5.22) %和(162.15 ± 3.66) %; 回收率在103%~120%, RSD均小于11%, 线性检测范围为50%~150%。本研究利用DoE设计成功筛选、优化和建立基于报告基因的抗CD38单抗ADCP生物学活性测定方法, 该方法具有良好的专属性、重复性和准确性, 可作为抗CD38单抗ADCP生物学活性的评价方法。

关键词

抗CD38单抗 / 抗体依赖性细胞吞噬作用 / 生物学活性 / 实验设计 / Plackett-Burman设计 / 优化 / 验证

Abstract

收起

A method to measure the antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) potency of anti-CD38 mAb was developed based on design of experiment (DoE) with a Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ transgenic cell line as the effector cell, the Daudi cell line as the target cells, and luciferase as the detection system. The DoE method was used for optimization of experimental parameters and methodological validation. The results show that anti-CD38 mAb exhibits a dose-response relationship with the following four-parameter equation: y = (A - D) / [1 + (x / C)^B] + D. Several experimental parameters were optimized by statistical experimental design and determined as follows: the working concentration of anti-CD38 mAb was 800-20.81 ng·mL^-1, the density of the target cells was 7.5×10⁴ per well, and the density of effector cells was 2.5×10⁴ per well, with an induction time of 6 h. The method showed good specificity. The recovery rate for samples from 5 different groups showed that the relative potencies of anti-CD38 mAb were (59.97 ± 4.74) %, (82.44 ± 5.15) %, (110.69 ± 11.71) %, (129.23 ± 5.22)% and (162.15 ± 3.66) %. The recoveries ranged from 103% to 120% and the RSDs of the above results were all less than 11%. The linear detection range was 50%-150%. Based on DoE design, this method for measuring ADCP potency of anti-CD38 mAb was optimized and validated with good specificity, repeatability and accuracy. This method can be used for evaluation of ADCP biological activity of anti-CD38 mAbs.

Key words

anti-CD38 monoclonal antibody / antibody-dependent cell-mediated phagocytosis / biological activity / design of experiment / Plackett-Burman design / optimization / validation

引用本文

刘春雨, 于传飞, 李欣, 付志浩, 崔永霏, 郭璐韵, 王兰. 利用实验设计优化和建立抗CD38单克隆抗体ADCP生物学活性测定方法. 药学学报, 2022 , 57 (5) : 1459 -1464 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-1613

Chun-yu LIU, Chuan-fei YU, Xin LI, Zhi-hao FU, Yong-fei CUI, Lu-yun GUO, Lan WANG. A method for measuring the ADCP potency of anti-CD38 monoclonal antibody[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2022 , 57 (5) : 1459 -1464 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-1613

正文

收起

抗白细胞分化抗原38 (cluster of differentiation 38, CD38) 是参与细胞的分化和活化的重要分子。CD38分子是一种单链跨膜糖蛋白, 包括N端短的胞质尾、跨膜区和C端较长的胞外区, 能催化环腺苷二磷酸核糖(cyclic ADP-ribose, cADPR) 的合成及降解^[1-4], 参与多种病理和ryanodine钙动员生理过程。CD38通常在T细胞和B淋巴细胞分化的早期阶段及成熟的最后阶段表达, 而在成熟的中期阶段表达则缺失, CD38可广泛检出于自然杀伤细胞(natural killer cells, NK)、树突状细胞(dendritic cell, DC)、单核细胞(monocyte) 和巨噬细胞(macrophage)。因其可在淋巴细胞及骨髓等血液来源的恶性肿瘤细胞表面过度表达, 因此, 成为治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)^{[5, 6]}、B样弥漫性大B细胞淋巴瘤(B-like diffuse large B-cell lymphoma, GCB-DLBCL)^[7]及其相关淋巴细胞白血病^[8]、急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL) 和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)^{[9, 10]}等血液肿瘤的理想靶分子。

抗CD38单克隆抗体Daratumumab已于2019年7月在国内获批上市, 临床疗效明显, 国内外多家企业也正在开展抗CD38单抗的研发。研究表明, 抗CD38单抗可以通过补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity, CDC) 和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), 以及抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP) 发挥其Fc效应子功能, 特异性杀伤肿瘤细胞^[11-15]。由于ADCP效应的评价方法难以建立, 在抗CD38单抗生物学活性的质量控制和评价研究中, 尚无ADCP活性的评价方法纳入质控, 因此需要探索和建立这一关键质量属性(critical quality attributes, CQA) 的评价方法。实验设计(design of experiments, DoE) 已被广泛应用于生物学产业及技术领域^[16-19], 尤其对于生物学方法建立过程中的实验条件筛选、优化及实验参数选择。利用DoE设计在降低工作量同时, 减少实验偏差, 并可高效分析各个参数之间是否存在交互作用。实验方法的原理系以荧光素酶报告基因检测系统为平台, 以Daudi细胞为靶细胞、稳定转染FcγRIIa受体及NFAT (nuclear factor of activated T-cells) 应答元件的Jurkat细胞为效应细胞, 待测抗体的Fab段识别靶细胞上的靶抗原表位(CD38), 同时, 抗体的Fc段与效应细胞上的FcγRIIa结合, 激活ADCP作用机制通路, 转录因子NFAT启动荧光素酶报告基因的表达, 加入荧光底物后产生化学发光, 根据荧光素酶的表达量与抗体的浓度拟合剂量效应曲线, 得到半数有效浓度EC₅₀值, 进而得到抗体药物的ADCP生物学活性。本研究利用DoE统计学实验设计方法, 高效优化实验参数, 建立并验证了抗CD38单抗的ADCP生物学活性测定方法。

材料与方法

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细胞系 Daudi细胞系、Raji细胞系和Ramos细胞系均为人淋巴细胞系, 购于ATCC; Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ效应细胞系(稳定转染了CD32a分子, 即FcγRIIa的胞外区与FcεRIγ的胞内区的融合蛋白及NFAT反应元件)和Jurkat-NFAT对照细胞系(仅转染NFAT反应元件, 无FcγRIIa受体), 为本室构建。

供试品 抗CD38单抗, 抗PD-L1单抗, 抗HER2单抗, 均为本室留样。

试剂及仪器 RPMI1640培养基(含/不含酚红)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、遗传霉素(G418) 及嘌呤霉素(Puromycin) 购自GIBCO公司; 荧光素酶检测系统(BrightGlo^TM Luciferase Assay system) 购自Promega公司。SoftMax 5.4分析软件为Molecular Devices公司产品; Design Expert 10.0分析软件为Statease公司产品。酶标仪为Perkin Elmer (珀金埃尔默, 美国)公司的Envision。

抗CD38单抗ADCP生物学活性检测方法 200 ×g离心5 min收集靶细胞(Daudi细胞) 和效应细胞(Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ细胞) 后以稀释液(含0.5% BSA的无酚红RPMI1640培养基) 重悬并调整细胞浓度分别为每毫升3×10⁶和1×10⁶个, 二者1∶1混匀后以每孔50 μL接种96孔细胞板; 以稀释液将抗CD38单抗稀释至1.6 μg·mL^-1 (起始工作浓度为800 ng·mL^-1), 再按1∶2依次往下稀释, 共10个浓度, 以每孔50 μL加入96孔细胞板后37 ℃、5% CO₂条件下孵育6 h; 分别以每孔100 μL稀释液作为背景孔, 每孔50 μL稀释液及50 μL细胞混合液作为阴性对照孔; 细胞板平衡至室温后每孔加入Bright-Glo底物100 μL并用酶标仪读取相对光单位(relative light unit, RLU); 利用SoftMax5.4软件分析数据, 以抗体工作浓度为x轴, 诱导倍数(fold of induction, FI) 为y轴, 拟合四参数方程剂量效应曲线。FI = (反应孔RLU均值- 背景孔RLU均值) / (阴性对照孔RLU均值- 背景孔RLU均值), 四参数方程的C值即为半数有效剂量(50% of maximal effect, EC₅₀)。

实验参数优化 抗体工作浓度的优化: 以1 mg·mL^-1作为单抗起始工作浓度按1∶2倍稀释27个梯度。根据抗体浓度点在剂量效应曲线的上、下平台及线性部分的分布特点, 缩窄浓度范围进一步优化; 分别以600、800和1 000 ng·mL^-1为起始, 1∶2倍稀释10个梯度; 以800 ng·mL^-1为起始, 分别1∶1.5、1∶2和1∶3倍稀释10个梯度; 靶细胞种类的优化: 分别以CD38表达(+) 的Daudi细胞、Raji细胞及Ramos细胞作为靶细胞进行实验; 其他实验参数的优化: 利用Design Expert软件进行实验设计及统计学分析, 采用两步法进行优化。首先选用Plackett-Burman设计(PB设计) 挑选出对实验结果影响较大的实验参数; 再选用optimal (custom) 设计方案对靶细胞数量、效应细胞数量及诱导时间进一步优化。

方法学验证 分别以稀释液和仅转染NFAT反应元件, 无FcγRIIa受体的Jurkat-NFAT细胞系替代Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ效应细胞进行细胞专属性验证; 分别以稀释液及无关单抗(抗HER2单抗和抗PD-L1单抗) 代替抗CD38单抗进行抗体专属性验证; 以起始工作浓度800 ng·mL^-1为100%, 分别制备50%、75%、100%、125%和150%回收率样品, 独立检测3次。以另一独立稀释的100%样品为参比品, 按照参比品EC₅₀/样品EC₅₀×100%计算各组相对效价及其均值、标准差(standard deviation, SD) 和相对标准差(relative standard deviation, RSD); 按照相对效价实测值/理论值×100%计算各组回收率及其均值、RSD以验证准确性; 分别以5组样品相对效价的理论值为x轴, 实测值为y轴, 拟合回归直线并根据准确性、精密度和线性结果确定方法测定有效范围。

统计学实验设计方法 筛选实验PB设计: PB设计基于不完全平衡板块原理, 通过n个实验至多可研究(n-1) 个变量, 实验设计中通常预留虚拟变量以作为误差分析, 每个变量有两水平, 按照PB设计2^6-3方案, 共设6组变量, 包括靶细胞数量(x₁)、效应细胞数量(x₂)、诱导时间(x₃)、稀释液(x₄) 和两个虚拟变量(x₅, x₆)。其中x₁和x₂的低水平(-) 和高水平(+) 分别为每毫升1×10⁶和6×10⁶个。x₃则为3和30 h。x₄为稀释液A (含0.5% BSA的无酚红RPMI 1640培养基) 及稀释液B (含1% FBS的无酚红RPMI 1640培养基)。共执行8组方案, 见表 1。以窗口值(FI_max-FI_min) 作为考察指标, Log₁₀变量变换后进行统计学分析; 优化实验optimal (custom) 设计: 根据PB设计的实验参数筛选结果, 确定进一步optimal (custom) 4×4×4优化方案, 3组变量为靶细胞数量(x₁)、效应细胞数量(x₂) 诱导时间(x₃), 每个变量有四水平, 分别记作(-2)、(-1)、(+1) 和(+2)。其中x₁和x₂的四水平分别为每毫升5×10⁵、1×10⁶、3×10⁶和6×10⁶个, x₃则为3、4.5、6和20 h。共执行42组方案, 见表 2。窗口值Log₁₀变换后分析数据, 并根据各组量效曲线R²、窗口值等优化各实验参数。

结果

收起

1 抗CD38单抗的ADCP剂量效应关系

本研究建立的抗CD38单抗ADCP测定方法, 曲线在半对数坐标轴上呈典型的S型曲线, 符合四参数方程: y = (A - D) / [1 + (x / C)^B] + D。EC₅₀ = 45.6 ng·mL^-1, R² = 0.999。

2 实验参数优化

2.1 抗体工作浓度

不同的抗体起始工作浓度优化结果见图 1A, 不同稀释倍数优化结果见图 1B, 最终确定由800 ng·mL^-1起始按1∶2倍稀释, 共10个浓度点, 抗体工作浓度范围为800~20.81 ng·mL^-1。

2.2 靶细胞种类

分别以CD38表达(+) 的Daudi细胞、Raji细胞及Ramos细胞作为靶细胞进行ADCP实验, 最终确定靶细胞为Daudi细胞, 结果见图 2。

2.3 PB设计实验参数筛选

按照表 1所述方案筛选靶细胞数量(x₁)、效应细胞数量(x₂) 诱导时间(x₃) 及稀释液(x₄), 因窗口值非正态分布, 对其进行Log₁₀变量变换后再进行统计学分析。方差分析结果显示, x₁、x₂及x₃对实验结果的影响均具有显著性(P < 0.05), 而x₄对实验结果的影响无显著性(P > 0.05)。由残差正态图(图 3A) 所见, 结果分布接近直线, 说明回归模型拟合效果良好, 线性回归方程式为y = 5.974 871 + 0.505 76x₁ + 0.925 741x₂ + 2.254 714x₃ + 0.073 476x₄。由标准效应图(图 3B) 所示, 参数越远离回归线, 则对结果影响越大, 反之亦然。因此, 认为稀释液非关键实验参数, 选择稀释液A进行后续实验; 而靶细胞数量、效应细胞数量、诱导时间则为关键实验参数, 需进一步优化。

2.4 optimal (custom) 优化实验参数

按照表 2所述进一步优化x₁、x₂和x。方差分析结果显示, 三个实验参数对实验结果的影响均具有显著性(P < 0.05) 而三者之间的两两交互作用无显著性(P > 0.05)。所得结果中剔除曲线拟合效果不理想(R² < 0.95) 组共获得19组剂量效应曲线。该19组实验参数设计及实验结果见表 3。根据R²、窗口值选择Run40作为最终优化参数, 即靶细胞数量为每毫升3×10⁶个、效应细胞数量为每毫升1×10⁶个、诱导时间为6 h。

3 方法学验证

3.1 专属性

结果显示, 无论稀释液、无FcγRIIa受体的Jurkat-NFAT对照细胞还是其他无关抗体(抗HER2单抗和抗PD-L1单抗), 都无法诱导产生ADCP反应, 证明该方法具有良好的专属性, 见图 4。

3.2 精密度与准确性

5组回收率样品的相对效价分别为(59.97 ± 4.74) %、(82.44 ± 5.15) %、(110.69 ± 11.71) %、(129.23 ± 5.22) %和(162.15 ± 3.66) %; 回收率在103%~120%之间, RSD均小于11%, 表明该方法的精密性与准确性良好。

3.3 线性与范围

5组样品的理论相对效价与实测相对效价线性回归拟合方程式为y = 1.004 6 x + 8.433 2, R² = 0.993 9, 说明线性拟合较好。根据准确性、精密度和线性的结果, 本方法测定的范围为50%~150%。

4 不同抗CD38单抗的ADCP活性检测

分别对3株不同来源的抗CD38单抗均可诱导产生ADCP反应, 说明本方法可应用于不同CD38靶点单抗的ADCP活性评价, 见图 5。

讨论

收起

随着免疫学的发展和对肿瘤临床研究的深入, 新靶点的抗肿瘤药物不断涌现, 目前, 针对CD38靶点的单抗药物渐渐成为研发热点。生物学活性是反映单抗药效的最重要指标, 因此建立单抗的体外生物学活性评价方法是单抗质控实验室的重要工作之一。抗CD38单抗的主要作用机制包括CDC、ADCC和ADCP, 可诱导表达CD38分子的恶性肿瘤发生肿瘤细胞溶解。但目前由于ADCP活性测定方法多为基于操作复杂且变异大的流式细胞术及原代细胞染色方法, 既难以建立也不适于放行, 因此在抗CD38单抗生物学活性的质量控制和评价研究中, 尚无ADCP活性的评价方法纳入质控。

根据前期的基础, 本研究将表达FcγRIIa (胞外区)/FcεRIγ (胞内区) 的融合蛋白及NFAT应答元件稳定转染入Jurkat细胞, 构建了一株转基因效应细胞株^[20], 其中, FcγRIIa与抗CD38单抗的Fc端结合, 而FcεRIγ则负责将结合后的胞内信号转导引发后续诱导效应。本方法经抗体量效范围、靶细胞种类、细胞数量、诱导时间等实验参数优化, 得到良好的S型剂量效应曲线。按照ICH-Q2 (R1) 进行验证^[21], 证明该方法具有良好的专属性、精密性和准确性, 线性检测范围为50%~150%。本方法也可应用于检测不同抗CD38单抗样品的ADCP活性。

基于DoE高效的统筹设计, 本研究针对众多对影响实验结果可能造成影响的实验参数进行两步筛选及优化。PB设计理论是由Plackett和Burman于1946年建立的, 目前已被广泛应用于抗体生产工艺参数的优化当中^{[22, 23]}。本研究将PB设计方法引入实验参数的筛选中, 首先设置4参数2水平共8组实验方案, 最终筛选出靶细胞、效应细胞数量及诱导时间是结果影响有显著意义的实验参数。下一步是基于正交设计的optimal (custom) 4×4×4方案, 理论需要执行64组实验, 而根据DoE的设计方案, 只需要执行42组实验, 通过数据比较优选出理想的实验条件, 并通过Design Expert软件分析检测结果, 比较各个实验参数的影响及交互作用, 并进行方差分析, 提供统计学依据。在方法优化过程中, 由于部分极限条件会导致量效曲线拟合不理想, 因此, 本研究以FI_max-FI_min作为窗口值进行考察, 又由于该窗口值不呈现正态分布, 因此进行了以10为底的对数变量变换后进行统计学分析。

综上所述, 本研究建立了灵敏、准确的ADCP测活方法, 该方法周期短、信噪比高, 为抗CD38单抗的工艺稳定性评价及结构与功能关系的研究奠定基础, 保证了该类产品质量可控、安全可靠。

作者贡献: 刘春雨负责实验设计、完成实验的主要部分、数据分析及文章撰写; 于传飞负责构建实验思路、完成实验的主要部分及文章润色; 李欣、付志浩、崔永霏、郭璐韵负责完成实验的优化及验证部分, 王兰负责总体实验设计及文章润色。

利益冲突: 无任何利益冲突。

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“重大新药创制”国家科技重大专项(2018ZX09736-016-007)
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2022年第57卷第5期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-1613

接收时间：2021-11-10
首发时间：2025-12-23
出版时间：2022-05-12

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收稿日期：2021-11-10
修回日期：2022-03-22

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中山市重大科技专项(210204163866513)

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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Run	Target cell	Effector cell	Induction time	Dilution buffer
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Run

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Dilution buffer

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1	-2	+1	+1		22	-1	-1	-2
2	-2	+2	+1	23	+2	-2	+2
3	+2	+2	-1	24	-1	-1	+2
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7	+1	-2	+1	28	-2	-1	-2
8	-2	+1	-2	29	+2	+2	+2
9	+2	+1	-2	30	-1	+1	-1
10	-1	+1	+1	31	+1	+1	-1
11	-2	-2	-2	32	-1	-2	-2
12	-1	-2	-1	33	-1	+2	+1
13	-2	-2	+2	34	+1	+2	+1
14	+2	-2	+1	35	+2	-1	+2
15	+1	+1	-2	36	+1	-1	-1
16	-1	+2	+2	37	+1	-1	+2
17	-1	-1	-1	38	+2	-2	-1
18	-2	-1	+1	39	+2	+1	-1
19	+1	+2	-2	40	+1	-1	+1
20	-1	-2	+1	41	+2	-1	+1
21	-2	-1	-1	42	-2	+2	+2

Run

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Induction time

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-1

-2

Run	Target cell (×10⁵ per mL)	Effector cell (×10⁵ per mL)	Induction time/h	R²	Window value
4	30	30	20	0.971	4.26
5	60	10	3	0.972	1.95
7	30	5	6	0.969	7.63
9	60	30	3	0.972	2.70
14	60	5	6	0.987	11.19
15	30	30	3	0.995	1.64
19	30	60	3	0.993	2.01
22	10	10	3	0.962	0.75
26	30	5	3	0.960	2.08
27	60	60	3	0.996	3.38
29	60	60	20	0.982	3.03
34	30	60	6	0.947	5.09
35	60	10	20	0.955	3.94
36	30	10	4.5	0.982	5.80
37	30	10	20	0.987	3.33
38	60	5	4.5	0.998	8.17
39	60	30	4.5	0.999	8.72
40	30	10	6	0.996	9.65
41	60	10	6	0.994	9.44

Run

Target cell (×10⁵ per mL)

Effector cell (×10⁵ per mL)

Induction time/h

R²

Window value

0.971

4.26

0.972

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7.63

0.972

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0.995

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0.993

2.01

0.962

0.75

0.960

2.08

0.996

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0.982

3.03

0.947

5.09

0.955

3.94

4.5

0.982

5.80

0.987

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0.998

8.17

4.5

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0.994

9.44