药学学报

Name	IC₅₀/nmol·L^-1 (95% confidence interval)	Hillslope	Ratio (IC₅₀ of MI = 1)	Oocyte count/n
MI	0.23 (0.15-0.36)	0.6 (0.85-0.47)	1	6
MIA	14.45 (9.135-22.51)	0.4 (0.54-0.38)	62.8	6
MIB	72.78 (41.84-23.10)	0.4 (0.55-0.32)	316.4	6
MIC	1.28 (0.85-1.93)	0.4 (0.48-0.35)	5.6	6

Name	IC₅₀/nmol·L^-1 (95% confidence interval)	Hillslope	Ratio (IC₅₀ of MI = 1)	Oocyte count/n
MI	0.23 (0.15-0.36)	0.6 (0.85-0.47)	1	6
MIA	14.45 (9.135-22.51)	0.4 (0.54-0.38)	62.8	6
MIB	72.78 (41.84-23.10)	0.4 (0.55-0.32)	316.4	6
MIC	1.28 (0.85-1.93)	0.4 (0.48-0.35)	5.6	6

Conotoxin	Sequence	Target	Reference
Ac1.1a	NGRCCHPACGKHFNC#	α1β1γδ (3.2 nmol·L^-1)	[18]
CIA	NGRCCHPACGKHFSC#	α1β1γδ (5.7 nmol·L^-1); α3β2 (2.06 μmol·L^-1)	[19]
GI	ECCNPACGRHYSC#	α1β1γδ (5.86 nmol·L^-1)	[20]
MI	GRCCHPACGKNYSC#	α1β1γδ (400 pmol·L^-1)	[11], this work
MIA	DGRCCHPACAKHFNC#	α1β1δε (14.45 nmol·L^-1)	This work
MIB	NGRCCHPACARKYNC#	α1β1δε (72.78 nmol·L^-1)	This work
MIC	CCHPACGKNYSC#	α1β1δε (1.28 nmol·L^-1)	[13], this work
SIA	YCCHPACGKNFDC#	Not determined	[21]
SII	GCCCNPACGPNYGCGTSCS#	α1β1γδ (8 μmol·L^-1)	[22]

Conotoxin	Sequence	Target	Reference
Ac1.1a	NGRCCHPACGKHFNC#	α1β1γδ (3.2 nmol·L^-1)	[18]
CIA	NGRCCHPACGKHFSC#	α1β1γδ (5.7 nmol·L^-1); α3β2 (2.06 μmol·L^-1)	[19]
GI	ECCNPACGRHYSC#	α1β1γδ (5.86 nmol·L^-1)	[20]
MI	GRCCHPACGKNYSC#	α1β1γδ (400 pmol·L^-1)	[11], this work
MIA	DGRCCHPACAKHFNC#	α1β1δε (14.45 nmol·L^-1)	This work
MIB	NGRCCHPACARKYNC#	α1β1δε (72.78 nmol·L^-1)	This work
MIC	CCHPACGKNYSC#	α1β1δε (1.28 nmol·L^-1)	[13], this work
SIA	YCCHPACGKNFDC#	Not determined	[21]
SII	GCCCNPACGPNYGCGTSCS#	α1β1γδ (8 μmol·L^-1)	[22]

α-芋螺毒素MIA和MIB特异性阻断肌肉型乙酰胆碱受体研究

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吴茜茜 ¹ , 王柳珺 ¹ , 朱晓鹏 ² , 长孙东亭 ¹ , 吴勇 ²^,^* , 罗素兰 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2022,57(3): 724-730

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药学学报 | 研究论文 2022, 57(3): 724-730

α-芋螺毒素MIA和MIB特异性阻断肌肉型乙酰胆碱受体研究

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吴茜茜¹, 王柳珺¹, 朱晓鹏², 长孙东亭¹, 吴勇²^,^*, 罗素兰¹^,²^,^*

作者信息

1.海南大学热带生物资源教育部重点实验室, 海南大学药学院, 海南海口 570228

2.广西大学医学院, 广西南宁 530004

通讯作者:

*吴勇, Tel: 86-898-66289538, E-mail: wuyong@gux.edu.cn;

罗素兰, E-mail: luosulan2003@163.com

Specific blockade of muscle acetylcholine receptor by α-conotoxin MIA and MIB

Xi-xi WU¹, Liu-jun WANG¹, Xiao-peng ZHU², Dong-ting ZHANGSUN¹, Yong WU²^,^*, Su-lan LUO¹^,²^,^*

Affiliations

1. Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, School of Pharmaceutical Sciences, Hainan University, Haikou 570228, China

2. School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China

出版时间: 2022-03-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-1434

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摘要

收起

α-芋螺毒素是从海洋软体动物芋螺毒液中发现的多肽类毒素, 能够特异作用于各种不同亚型烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs在调节神经递质释放、细胞兴奋性等方面发挥重要生理功能。因为nAChRs功能异常与多种疾病密切相关, 所以α-芋螺毒素可以开发为研究nAChRs的分子探针或直接作为先导药物进行开发。前期, 研究人员从幻芋螺中发现的4种α-3/5型芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC, 但MIA和MIB对不同亚型的nAChRs阻断活性及选择性还没有深入研究, 本研究通过9-芴甲氧羰基(Fmoc) 固相法合成了α-芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC, 并利用电生理技术对它们抑制不同亚型鼠源nAChRs的活性进行系统测定, 结果表明MIA和MIB是肌肉型乙酰胆碱受体拮抗剂, 半阻断剂量(IC₅₀) 分别是14.45和72.78 nmol·L^-1, 稍弱于MI与MIC, 且对其他神经型nAChRs阻断活性微弱。分子对接研究显示, MIA和MIB与肌肉型nAChRs作用机制类似, N-端氨基酸序列差异是其活性差异的主要原因。本研究表明, 芋螺毒素MIA和MIB有潜力发展成为检测肌肉型nAChRs功能以及诊断或治疗相关疾病的工具药物。

关键词

幻芋螺 / α-芋螺毒素 / 9-芴甲氧羰基固相合成法 / 氧化折叠 / 肌肉型乙酰胆碱受体 / 分子对接

Abstract

收起

The α-conotoxins are peptide toxins that are identified from the venom of marine cone snails and they hold outstanding potency on various subtypes of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs). nAChRs have an important role in regulating transmitter release, cell excitability, and neuronal integration, so nAChR dysfunctions have been involved in a variety of severe pathologies. Four types of α-3/5 conotoxins MI, MIA, MIB and MIC have been found from Conus magus. Among them, the activity and selectivity of MIA and MIB have not been well studied. In this study, four α-3/5 conotoxins MI, MIA, MIB and MIC were synthesized by solid peptide synthesis method, and the bioactivities of them were screened by double electrode voltage clamp electrophysiology. The results showed that MIA and MIB selectively inhibited muscle type acetylcholine receptors with IC₅₀ values of 14.45 and 72.78 nmol·L^-1, respectively, which are slightly weaker than MI and MIC. Molecular docking results have shown MIA and MIB interact with muscle-type nAChRs with similar mechanism. The reasons for activity differences may relate to the size of the N-terminal amino acids. Together, the conotoxins MIA and MIB may have the potential to develop as a tool for detect the function of muscle type nAChRs, as well as the diagnosis or treat of related diseases.

Key words

Conus magus / α-conotoxin / solid phase synthesis of 9-fluorene methoxycarbonyl / oxidative folding / muscle type nAChRs / molecular docking

引用本文

吴茜茜, 王柳珺, 朱晓鹏, 长孙东亭, 吴勇, 罗素兰. α-芋螺毒素MIA和MIB特异性阻断肌肉型乙酰胆碱受体研究. 药学学报, 2022 , 57 (3) : 724 -730 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-1434

Xi-xi WU, Liu-jun WANG, Xiao-peng ZHU, Dong-ting ZHANGSUN, Yong WU, Su-lan LUO. Specific blockade of muscle acetylcholine receptor by α-conotoxin MIA and MIB[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2022 , 57 (3) : 724 -730 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-1434

正文

收起

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs) 是配体门控离子通道家族成员, 介导着中枢和外周神经系统的快速兴奋性胆碱能神经传递, 广泛存在于整个中枢与外周神经系统中^{[1, 2]}。nAChRs根据组织分布可分为神经型nAChRs和肌肉型nAChRs两种类型^[3]。神经型nAChRs主要分布于自主神经节突触后膜和中枢神经系统, 其中α4β2是中枢神经系统中最主要的亚型^{[4, 5]}。肌肉型nAChRs分布于神经肌肉接头处, 介导神经肌肉信号传递, 是一种异五聚体膜蛋白, 由α1、β1、δ和ε (成人) 或γ (胎儿) 亚基组成。肌肉型nAChRs不仅在生物体中扮演重要生理功能, 也已被认为是多种疾病的潜在靶点, 如肌源性疾病、肌肉营养不良和重症肌无力^{[6, 7]}。因此, 作用于肌肉型nAChRs的配体具有开发为研究这类受体的探针或有着重要药用研究价值。

芋螺毒素(conopeptides; conotoxins, CTxs) 是由热带海洋软体动物芋螺(Conus) 毒管分泌的毒液中分离出的富含二硫化物的小肽毒素, 主要生物功能是捕食猎物和抵御天敌。每种芋螺毒液中含有上千种毒素肽, 每种多肽约含有12~20个氨基酸, 它们富含半胱氨酸, 形成二硫键, 这些芋螺毒素能够高效作用于多种不同类型离子通道受体^[8-10]。在芋螺毒素家族中, α-CTxs是研究最为深入而广泛的一类芋螺毒素, 其主要结构特征是含有C^IC^II(m)C^III(n)C^IV半胱氨酸框架, 其中m和n表示半胱氨酸之间的氨基酸残基数, 根据m和n数目不同, α-芋螺毒素可以分为α-3/5、α-4/3和α-4/7等多种亚型, 其中多种α-3/5型芋螺毒素以高效力阻断肌肉型nAChRs, 因而这类芋螺毒素可以作为研究肌肉型nAChRs的分子探针或直接作为药物先导分子进行研究。

随着分离鉴定和毒素组学技术的发展, 有着许多新发现的芋螺毒素多肽药理学活性需要进一步深入研究。早在上世纪80年代, 科研人员从食鱼芋螺幻芋螺(Conus magus) 毒液中发现了多种拮抗各种电压和配体门控离子通道的芋螺毒素, 其中ω-MVIIA已经作为治疗神经痛的药物被FDA批准。α-CTx MI是从幻芋螺中发现的, 能够有效拮抗肌肉型nAChRs, 半阻断剂量(IC₅₀) 仅有400 pmol·L^-1^[11], 其后又从幻芋螺发现了3种类似MI序列的α-CTx MIA、MIB和MIC (图 1), McIntosh等^[12]根据α-CTx MIA和MIB与MI序列相似性, 认为α-CTx MIA和MIB也作用于肌肉型乙酰胆碱受体, 但未进行实验深入其活性, 也没有研究MIA与MIB针对其他亚型nAChRs的活性。Kapono等^[13]从幻芋螺中分离鉴定了α-CTx MIC, 发现MIC对肌肉型nAChRs的半阻断剂量为248.70 nmol·L^-1, 对α4β2和α3β4几乎无活性。本研究以芋螺毒素MI和MIC为对照, 深入研究α-CTx MIA和MIB对不同亚型nAChRs (α1β1δε、α4β2、α2β4、α4β4、α3β2、α6β4、α3β4) 的作用, 电生理实验证明α-CTx MIA和MIB对肌肉型nAChRs有着非常强阻断作用, 且有着很好的受体亚型选择性, 这些研究结果表明, 这两种芋螺毒素在幻芋螺捕食中也发挥着重要作用。

材料与方法

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实验材料 微波多肽合成仪CEM Liberty Blue购自美国CEM公司; Waters 2535Q制备型高效液相色谱仪、Waters 2695分析型高效液相色谱仪(美国Waters公司); 分析型C18柱(Vydac, 5 μm, 4.6 mm × 250 mm)和制备型C18柱(Vydac, 10 μm, 22 mm × 250 mm)均购于美国Grace公司; 色谱级乙腈(acetonitrile, ACN, 美国Thermo Fisher公司); 色谱级三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA) 购自美国Tedia公司; 合成多肽所需树脂、保护氨基酸和偶联切割试剂购自上海吉尔生化有限公司; 其他常用试剂均为国产分析纯, 购自广州化学试剂公司。双电极电压钳系统(Axon 900A)、Digidata 1440A数模转换器、Axon 900A放大器购自美国Molecular Device公司; Alpha 1-4L冷冻干燥机购自德国Christ公司; 非洲爪蟾(Xenopus laevis) 购自美国Nasco公司, 动物实验由海南大学伦理学委员会批准, 并严格遵守动物管理条例指南。

9-芴基甲氧基羰基 (Fmoc) 法合成芋螺毒素多肽 线性肽合成方法为Fmoc多肽固相合成法, 合成仪器使用CEM Liberty Blue (CEM公司) 微波多肽合成仪, 合成规模为100 μmol, 合成树脂为可产生酰胺化的Rink Amide树脂, 4 min进行1个氨基酸连接循环: 其中2 min偶联(90 ℃), 1 min脱保护(90 ℃), 1 min进行清洗处理, 合成过程中使用五倍过量的Fmoc保护氨基酸, 偶联试剂为2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma) 和N, N-二异丙基碳二亚胺(DIC)。线性肽合成后使用裂解溶液[TFA/三异丙基硅烷/H₂O (95∶2.5∶2.5)] 室温下切割2 h, 切割后的多肽用冰乙醚处理后冻干。合成的粗肽进一步利用制备型液相纯化至≥ 70%后, 进行下一步氧化折叠。制备液相纯化使用Vydac-Grace C18制备柱(10 μm, 22 mm × 250 mm), 梯度洗脱: 10%~40%的溶剂B (99.9% ACN和0.1% TFA) 梯度洗脱40 min, 液相流速15 mL·min^-1, 监测波长214 nm。合成线性肽使用Wasters TQD质谱仪(UPLC-ESI-MS) 确证分子质量。

多肽氧化折叠形成二硫键 合成的芋螺毒素线性肽第I、III位半胱氨酸(cysteine, Cys, C) 侧链保护基团采用triphenylmethyl (S-Trt) 保护。芋螺毒素线性肽第II、IV位半胱氨酸侧链基团被acetomidomethyl (S-Acm) 保护, 再通过两步氧化折叠法定点连接二硫键。切割过程中, 侧链保护基团S-Trt已经被脱除, 形成自由巯基, 利用铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])氧化法氧化自由巯基形成第一对二硫键, 即将已经纯化好的线性肽溶解于60%乙腈溶液中, 缓慢滴加到氧化缓冲液(K₃[Fe(CN)₆] 10 mmol·L^-1, Tris 0.1 mol·L^-1, pH 7.5) 中, 氧化45 min。氧化后形成的含有一对二硫键的多肽通过制备型反相高效液相色谱纯化, 纯化后的多肽产物进行第二步碘氧化, 去除S-Acm基团, 同时形成第二对二硫键, 氧化产物缓慢加入充满氮气保护的碘反应液中(7.5 mmol·L^-1 I₂溶液; 溶液为水/TFA/乙腈= 20∶1∶8, v/v/v), 震荡反应10 min, 然后轻轻加入饱和抗坏血酸(Vc) 至溶液澄清, 终止反应。通过两步氧化法合成的含有两对二硫键的芋螺毒素多肽, 利用制备液相纯化, 合成结果分析型液相检测纯度(> 95%), ESI-MS鉴定合成多肽分子质量, 合成产物冻干分装备用。

cRNA的制备注射与受体表达 分别将nAChRs各个类型亚基质粒, 包括小鼠α1 (序列信息Genebank号: NM_007389.5)、β1 (XR_003949231)、δ (NM_021600) 和ε (XR_004936687)、α2 (NM_144803)、α3 (NM_145129)、α4 (NM_015730)、α6 (NM_021369)、α9 (NM_001081104) 和α10 (NM_001081424)、β2 (NM_009602) 和β4 (NM_148944) 转入感受态细胞E. coli DH5α中, 提取质粒, 测定质粒的浓度, 用相应的限制性内切酶对所提取的质粒酶切线性化, 获得线性化DNA, 纯化并测定其浓度。以纯化后的线性化DNA作为模板, 用Ambion mMESSAGE mMACHINE Kit体外转录试剂盒进行cRNA合成, 之后用RNA纯化试剂盒, 按步骤对所获得的cRNA进行纯化, 并在260 nm波长下测定cRNA的浓度, 分装于无RNA酶管中, 保存于-80 ℃备用。

非洲爪蟾卵母细胞取自成熟雌性非洲爪蟾, 用1.5 mg·mL^-1胶原酶(I型, Sigma公司) 去卵泡, 并在18 ℃下, 置于无菌ND96缓冲液(96.0 mmol·L^-1 NaCl、1.8 mmol·L^-1 CaCl₂、2.0 mmol·L^-1 KCl、1.0 mmol·L^-1 MgCl₂和5.0 mmol·L^-1 HEPES, pH 7.4)。利用显微注射器(Nanojet, Drummond Scientific Co.公司), 各亚基以1: 1的比例向卵母细胞注射每个亚型的5 ng cRNA, 其中肌肉型α1、β、δ、ε亚基的cRNA按2∶1∶1∶1的质量比例混合, 注射完后, 将卵母细胞放置于含抗生素(青霉素10 μg·mL^-1、链霉素10 μg·mL^-1、庆大霉素100 μg·mL^-1) 的无菌ND96培养液中, 17 ℃恒温恒湿培养。在注射后2~5天进行电生理记录, 观察nAChRs的表达状况。

电生理活性检测 先准备好ND96灌流液, 脱气至少30 min, 再将配制好的0.1 g·L^-1 BSA倒入ND96灌流液中。再将3 mol·L^-1 KCl溶液灌入电极针中, 使得电阻范围在0.5~2 MΩ内。打开数模转换器、放大器的操作程序, 吸取表达好的单个卵母细胞放入50 μL的细胞槽内, 将电极针以45°的倾斜角度刺入卵母细胞中, 调至TEVC模式钳住卵母细胞, 钳制电压为-70 mV, 基准电流小于200 nA, 运行程序, 以流速为2 mL·min^-1的ND96灌流液, 浓度为10 μmol·L^-1乙酰胆碱(ACh) 激活, 使得通道开放后产生电流。电流平稳后, 开启记录模式, 记录时间为1 min, 其中2 s ND96冲洗, 2 s ACh刺激, 56 s ND96冲洗。然后以ND96为空白对照, 将芋螺毒素多肽加入到细胞槽内孵育5 min, 使用Clampfit 10.2软件(Molecular Devices Corp.公司) 记录和分析电生理数据。所有测定数据均表示为至少3~6个卵母细胞的平均值±标准误。浓度反应曲线拟合方程反应(%) = 100/[1 + ([conotoxin]/IC₅₀)^nH], 其中nH是Hill系数, IC₅₀通过使用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software公司) 软件进行非线性回归分析。

芋螺毒素结构模拟和分子对接 MI、MIA、MIB和MIC属于α-3/5型芋螺毒素, 经过比较发现与芋螺毒素GI (PDB ID∶1QS3) 相似度高, 在此基础上, 本研究利用Moddler 9.16构建MIA和MIB结构。利用Rosetta软件中柔性对接包FlexPepDock进行分子对接, 对接以金环蛇毒素结合Torpedo nAChR冷冻电镜结构为模型(PDB ID: 6UWZ), 配体对接肌肉型nAChRs的α1和δ相互作用界面。在对接过程中, 首先使用了柔性对接算法中的prepack模块对蛋白和多肽的侧链进行结构初始优化, 以减少多肽的侧链冲突和优化骨架。然后, 对每个多肽进行了100次侧链搜索以产生高分辨率的理论预测结合结构。对接结果利用软件“Total_Score”方式评价, 选择100次对接中的最优结构, 进行对接结果分析。

结果

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1 α-芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC合成

本研究首先采用Fmoc固相合成法合成4种α-芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC线性肽, 利用制备型RP-HPLC对线性肽进行纯化, 纯化后进行两步法氧化折叠, 形成两对二硫键后, 用分析型RP-HPLC检测和ESI-MS进行鉴定, 最终产物纯度大于95%以上, 具体检测结果如图 2所示, 芋螺毒素MI、MIA、MIB、MIC的保留时间分别是15.3、10.2、10.1和9.7 min。每个合成的多肽分子利用ESI-MS鉴定其分子质量, 检测结果表明芋螺毒素MI、MIA、MIB、MIC的分子质量分别为1 493.8、1 659.9、1 691.2和1 280.4 Da, 与理论相对分子质量相符。

2 芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC对肌肉型nAChRs抑制活性

α-3/5型芋螺毒素的主要作用靶点是肌肉型nAChRs, 以ND96溶液对肌肉型nAChRs做一个空白对照实验(图 3A), 用ND96溶液溶解芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC, 测试其对肌肉型nAChRs抑制活性, 电生理结果如图 3B~E所示, 在10 μmol·L^-1多肽给药浓度下, 芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC几乎可以完全阻断ACh激发的肌肉型nAChRs电流, 表明合成的4种芋螺毒素对肌肉型nAChRs都有很强的阻断活性。在此基础上, 进一步测定4种多肽毒素在不同浓度下电流抑制情况, 绘制浓度剂量反应曲线, 每个浓度条件下至少测定3个蛙卵数据, 实验结果如图 3F所示, 4种芋螺毒素对肌肉型乙酰胆碱受体都有极强的阻断活性。IC₅₀计算结果如表 1所示, 芋螺毒素MI的活性最强, IC₅₀值为0.23 nmol·L^-1。与MI活性相比, MIC的IC₅₀值为1.28 nmol·L^-1, 升高了约5.6倍。另外, 与MI相比, MIA和MIB活性降低更多, 测定的IC₅₀分别为14.45和72.78 nmol·L^-1, 提升了62.8和316.4倍。如图 1所示, 序列比对MI序列N端比MIC多了Gly和Arg两个2个氨基酸, 导致MIC活性降低。MIA和MIB与MI序列差异较大, 主要表现在N端和loop2区, MIA和MIB的N端分别多出了Asp和Asn, loop2区氨基酸序列也存在明显差异, 这些氨基酸序列区别导致MIA和MIB活性降低。

3 α-芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC对其他亚型nAChRs抑制活性

在测定4种α-芋螺毒素抑制肌肉型乙酰胆碱受体活性的基础上, 本研究利用双电极电压钳技术, 进一步检测芋螺毒素MIA和MIB对其他不同亚型神经型nAChRs的抑制活性, 实验结果如图 4所示, 在100 μmol·L^-1乙酰胆碱浓度刺激下, 不同亚型乙酰胆碱受体门控通道都被激活打开, 加入10 μmol·L^-1 MIA条件下, 电流如图 4A~C、G~I所示, α4β2、α2β4、α4β4、α3β2、α6β4和α3β4的通道开放率分别为64%、68%、98%、48%、73%和92%, 表明高浓度情况下, MIA对α4β2、α2β4和α3β2有一定抑制活性。与MIA类似, 在10 μmol·L^-1 MIB的给药浓度条件下, α4β2、α2β4、α4β4、α3β2、α6β4和α3β4的电流开放依旧保持75%、52%、94%、64%、55%和88% (图 4D~F、J~L), 表明在高浓度情况下, MIB对α2β4和α6β4具有一定的抑制活性。通过3次平行实验, MIA和MIB对6种鼠源神经型nAChRs和肌肉型nAChRs的阻断活性如图 5所示, 对肌肉型nAChRs的活性非常强, 而对其他神经型nAChRs活性偏弱。

4 芋螺毒素MIA和MIB与肌肉型nAChRs相互作用分析

MIA和MIB等属于α-3/5亚型芋螺毒素, 其结构与同属α-3/5亚型芋螺毒素GI同源性非常高, 本研究利用同源建模的方式构建了芋螺毒素MI、MIA和MIB结构, 在此基础上利用Rosetta软件中FlexPepDock进行分子对接, 选择打分最低的稳定结构(Supporting Information 1), 构建了MIA和MIB与α1(+)δ(-) 结合位点之间的复合物的分子模型(图 6), 对接结果显示2种芋螺毒素与α1(+)δ(-) 亚基形成的分子模型非常类似。芋螺毒素MIA与MIA结构中N-端和loop1与δ亚基中β-折叠相互作用紧密, 其中δ亚基中113位带正电荷精氨酸与N-氨基酸发生相互作用, 是影响MIA和MIB的活性差异的关键因素。芋螺毒素MIA与MIB的loop2区在体系外侧, 对结合作用影响相对较小, C-末端的半胱氨酸形成二硫键, 对芋螺毒素MIA和MIB三维结构维持十分重要, 且与α1亚基中C-loop相互作用, 表明Cys II-Cys IV形成的二硫键对芋螺毒素活性影响重大。

讨论

收起

海洋软体动物芋螺毒管中分泌上千种甚至更多的活性多肽, 这些芋螺毒素多肽分子都是通过长期进化形成, 扮演着重要生理功能, 主要麻痹被捕食的对象, 或是防御捕食者。食肉型芋螺幻芋螺是人们研究最为深入的芋螺种类, 根据芋螺毒素数据库Conoserver记载, 科学家已从幻芋螺毒液中发现了30多种芋螺毒素, 主要包括O1-超家族、A-超家族和I1-超家族, 其中最著名的是作用于Cav_2.2的芋螺毒素ω-MVIIA, 它于2004年被FDA批准, 开发为治疗神经痛的药物^[14-16]。α-芋螺毒素MII也是从幻芋螺中发现, 能够特异作用于神经性α3β2 nAChRs^[17]。此外, 人们还在幻芋螺中发现了多种α-3/5家族芋螺毒素, 如MI、MIA、MIB和MIC, 前期研究已证明能够特异作用于肌肉型nAChRs, 其中MI和MIC活性已经进行定量测试, 本研究进一步鉴定了芋螺毒素素MIA和MIB的活性。这些不同类型芋螺毒素, 能够协同作用于不同类型离子通道, 它们相互协同作用, 在幻芋螺捕食海洋中快速运动的鱼类发挥着重要作用。

科学家已经从芋螺毒液中发现了多个针对肌肉型nAChRs α-3/5型CTxs, 如表 2^{[11, 13, 18-22]}所示, 这些芋螺毒素中loop1区非常保守, 一般为组氨酸-脯氨酸-丙氨酸组合, 从已发现的α-3/5型芋螺毒素结构看, 这一结构形成的转角结构对维持芋螺毒素结构发挥重要作用。而loop2结构相对可变, 对芋螺毒素活性影响较小, 这也与本研究对接结果一致, loop2结构区域在芋螺毒素与受体α1/δ结合部位的外侧, 因此对芋螺毒素活性影响相对较小。本研究化学合成了MI、MIA、MIB和MIC 4种来源幻芋螺的3/5型芋螺毒素, 其序列差异主要在N-端和loop2区域, 对接结果显示N端可能在其活性差异中扮演着重要作用, N-端氨基酸残基与δ亚基中113位精氨酸间存在空间位阻和静电作用, 可通过精氨酸突变等方法进一步进行深入研究。除α-3/5型作用于肌肉型nAChRs的芋螺毒素, 还有一些α-4/7型芋螺毒素也能够阻断肌肉型nAChRs, 如α-Lo1a、α-EI, 但它们不仅对肌肉型nAChRs有活性, 也对其他神经型nAChRs有活性, 表明这些亚型的作用于肌肉型nAChRs的芋螺毒素选择性不高^{[23, 24]}。

肌肉型nAChRs的异常会引起横纹肌肉瘤、小儿软组织肿瘤、重症肌无力等疾病, 发现能特异作用于肌肉型nAChRs的配体对于诊断和治疗这些疾病尤为重要, 也对于肌肉型nAChRs相关分子探针的开发具有一定的指导意义。本实验研究的MIA、MIB对神经元受体(α4β2、α2β4、α4β4、α3β2、α6β4和α3β4) 几乎无活性, 仅对肌肉型nAChRs有强阻断活性, 所以它们具有较高的选择性。本研究对芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC进行系统研究比较, 为后续的多肽改造、突变等提供了基础, 也更深入认识了α3/5型芋螺毒素与肌肉型nAChRs相互作用的分子机制。

作者贡献: 吴茜茜、王柳珺、朱晓鹏和吴勇负责多肽的合成、活性测定与稿件撰写; 长孙东亭和罗素兰负责实验设计、过程指导、稿件撰写与修改。

利益冲突: 所有作者声明无任何利益冲突。

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2022年第57卷第3期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-1434

接收时间：2021-09-30
首发时间：2025-12-22
出版时间：2022-03-12

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出版历史

收稿日期：2021-09-30
修回日期：2021-11-02

基金

国家自然科学基金资助项目(31860246)

作者信息

1.海南大学热带生物资源教育部重点实验室, 海南大学药学院, 海南海口 570228

2.广西大学医学院, 广西南宁 530004

通讯作者:

*吴勇, Tel: 86-898-66289538, E-mail: wuyong@gux.edu.cn;

罗素兰, E-mail: luosulan2003@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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