药学学报


3	Me	-	220
4	cyc-Pro	-	182
5	tert-Bu	-	230
6	Ph	-	86
7	4-MeO-Ph	-	79
8	4-Me-Ph	-	87
9	4-CN-Ph	-	53
10	4-F-Ph	-	82
11	4-Cl-Ph	-	97
12	2-CN-Ph	-	17
13	2, 6-(Me)₂ -Ph	-	74
14	2, 6-(OMe)₂ -Ph	-	205
15	2, 6-(Cl)₂ -Ph	62 993	-
16	2, 6-(F)₂ -Ph	12 776	-
17	2-OH-4-Cl-Ph	11 525	-
18	2-F-4-CN-Ph	13 321	-

Compd.

SARS CoV-1 3C^pro FRET^a

k_obs/I /(mol·L^-1)^-1s^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

220

cyc-Pro

182

tert-Bu

230

4-MeO-Ph

4-Me-Ph

4-CN-Ph

4-F-Ph

4-Cl-Ph

2-CN-Ph

2, 6-(Me)₂ -Ph

2, 6-(OMe)₂ -Ph

205

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62 993

2, 6-(F)₂ -Ph

12 776

2-OH-4-Cl-Ph

11 525

2-F-4-CN-Ph

13 321


3	Me	-	220
4	cyc-Pro	-	182
5	tert-Bu	-	230
6	Ph	-	86
7	4-MeO-Ph	-	79
8	4-Me-Ph	-	87
9	4-CN-Ph	-	53
10	4-F-Ph	-	82
11	4-Cl-Ph	-	97
12	2-CN-Ph	-	17
13	2, 6-(Me)₂ -Ph	-	74
14	2, 6-(OMe)₂ -Ph	-	205
15	2, 6-(Cl)₂ -Ph	62 993	-
16	2, 6-(F)₂ -Ph	12 776	-
17	2-OH-4-Cl-Ph	11 525	-
18	2-F-4-CN-Ph	13 321	-

Compd.

SARS CoV-1 3C^pro FRET^a

k_obs/I /(mol·L^-1)^-1s^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

220

cyc-Pro

182

tert-Bu

230

4-MeO-Ph

4-Me-Ph

4-CN-Ph

4-F-Ph

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2-CN-Ph

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2, 6-(F)₂ -Ph

12 776

2-OH-4-Cl-Ph

11 525

2-F-4-CN-Ph

13 321


15		62 993	-
19		-	24% inhibition @ 1000
20	CH₃	-	1 028
21		30 287	-
22		5 834	-

Compd.

SARS CoV-1 3C^pro FRET

k_obs/I /(mol·L^-1)^-1s^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

62 993

24% inhibition @ 1000

CH₃

1 028

30 287

5 834


15		62 993	-
19		-	24% inhibition @ 1000
20	CH₃	-	1 028
21		30 287	-
22		5 834	-

Compd.

SARS CoV-1 3C^pro FRET

k_obs/I /(mol·L^-1)^-1s^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

62 993

24% inhibition @ 1000

CH₃

1 028

30 287

5 834


23	H	7	10
24	H	4	5
25	CH₃	83	19
26	H	20	10
27	H	34	44
28	H	44	14
29	H	103	47

Compd.

R₁

R₂

SARS CoV-1 3C^{pro a}
IC₅₀/nmol·L^-1

SARS CoV-1^a
EC₅₀/μmol·L^-1

CH₃

103


23	H	7	10
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26	H	20	10
27	H	34	44
28	H	44	14
29	H	103	47

Compd.

R₁

R₂

SARS CoV-1 3C^{pro a}
IC₅₀/nmol·L^-1

SARS CoV-1^a
EC₅₀/μmol·L^-1

CH₃

103

Compd.	SARS CoV-2 3C^pro K_i/nmol·L^-1	Vera E6 EC₅₀/nmol·L^-1	MDCK-LE^a P_app×10^-6 cm·s^-1	HLM CL_int^b /mL·min^-1·mg^-1	Rat oral bioavailability F/%	F_a×F_g /%
24	0.271	231	< 0.207	7.47	1.4	3.3
30	27.7	1 364	0.945	34.4	7.6	38
31	230	5 593	10.3	337	-	-
32	7.93	909	1.56	127	10	84
33	12.1	85.3	13.1	30.3	33	100
34	3.11	74.5	1.71	24.5	50	96

Compd.

Structure

SARS CoV-2 3C^pro
K_i/nmol·L^-1

Vera E6 EC₅₀/nmol·L^-1

MDCK-LE^a P_app×10^-6 cm·s^-1

HLM CL_int^b /mL·min^-1·mg^-1

Rat oral bioavailability F/%

F_a×F_g
/%

0.271

231

< 0.207

7.47

1.4

3.3

27.7

1 364

0.945

34.4

7.6

230

5 593

10.3

337

7.93

909

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12.1

85.3

13.1

30.3

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3.11

74.5

1.71

24.5

Compd.	SARS CoV-2 3C^pro K_i/nmol·L^-1	Vera E6 EC₅₀/nmol·L^-1	MDCK-LE^a P_app×10^-6 cm·s^-1	HLM CL_int^b /mL·min^-1·mg^-1	Rat oral bioavailability F/%	F_a×F_g /%
24	0.271	231	< 0.207	7.47	1.4	3.3
30	27.7	1 364	0.945	34.4	7.6	38
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34	3.11	74.5	1.71	24.5	50	96

Compd.

Structure

SARS CoV-2 3C^pro
K_i/nmol·L^-1

Vera E6 EC₅₀/nmol·L^-1

MDCK-LE^a P_app×10^-6 cm·s^-1

HLM CL_int^b /mL·min^-1·mg^-1

Rat oral bioavailability F/%

F_a×F_g
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0.271

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< 0.207

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1.4

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337

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85.3

13.1

30.3

100

3.11

74.5

1.71

24.5


1	Activity: All coronavirus types known to infect humans, including β-coronaviruses (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, HKU1, OC43, and MERS-CoV) as well as α-coronaviruses (229E and NL63)
2	Selectivity: No inhibitory effects were noted against mammalian cysteine (caspase 2, cathepsin B, and cathepsin L), serine (chymotrypsin, elastase, and thrombin) and aspartyl (cathepsin D) proteases at the highest concentration tested (100 μmol·L^-1)
3	Potency for COVID-19 virus-infected mice: Significant reduction of lung viral titers
4	Histopathological analysis and immunostaining of lungs: From COVID-19 virus infected mice showed that 34 limits cellular infiltration and protects lung tissue from damage caused by virus replication
5	Immunohistochemical analysis: Using a viral nucleocapsid antibody to detect viral antigen levels in the lungs revealed that 34 inhibits virus replication in a dose-dependent manner
6	Plasma clearance (CL_p): CL_p exhibited moderate in rats and monkeys, with elimination half-lives (t_1/2) of 5 h and < 1 h, respectively, after intravenous dosing
7	Metabolic stability: In NADPH-supplemented HLMs, 34 demonstrated moderate CL_int (24.5 μL·min^-1·mg^-1), which was significantly inhibited (≥ 82%) by the selective CYP3A4/5 inhibitor ketoconazole
8	Favorable off-target selectivity profile: In a broad panel of G protein-coupled receptors, kinases, transporters, and phosphodiesterase enzyme inhibitor screens, and was devoid of activity against the cardiac ion channels K_v1.1, Ca_v1.2, and Na_v1.5
9	Genetic toxicity: 34 is not mutagenic or clastogenic and is negative in an in vivo rat micronucleus assay
10	Regulatory toxicity: Repeat oral dosing of 34 in 2-week regulatory toxicity studies in monkeys (60 to 600 mg·kg^-1) and rats (40 to 1 000 mg·kg^-1) led to dose-dependent increases in both maximal plasma concentrations (C_max) and area-under-the-plasma concentration versus time curves (AUCs)

No.

Description

Activity: All coronavirus types known to infect humans, including β-coronaviruses (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, HKU1, OC43, and MERS-CoV) as well as α-coronaviruses (229E and NL63)

Selectivity: No inhibitory effects were noted against mammalian cysteine (caspase 2, cathepsin B, and cathepsin L), serine (chymotrypsin, elastase, and thrombin) and aspartyl (cathepsin D) proteases at the highest concentration tested (100 μmol·L^-1)

Potency for COVID-19 virus-infected mice: Significant reduction of lung viral titers

Histopathological analysis and immunostaining of lungs: From COVID-19 virus infected mice showed that 34 limits cellular infiltration and protects lung tissue from damage caused by virus replication

Immunohistochemical analysis: Using a viral nucleocapsid antibody to detect viral antigen levels in the lungs revealed that 34 inhibits virus replication in a dose-dependent manner

Plasma clearance (CL_p): CL_p exhibited moderate in rats and monkeys, with elimination half-lives (t_1/2) of 5 h and < 1 h, respectively, after intravenous dosing

Metabolic stability: In NADPH-supplemented HLMs, 34 demonstrated moderate CL_int (24.5 μL·min^-1·mg^-1), which was significantly inhibited (≥ 82%) by the selective CYP3A4/5 inhibitor ketoconazole

Favorable off-target selectivity profile: In a broad panel of G protein-coupled receptors, kinases, transporters, and phosphodiesterase enzyme inhibitor screens, and was devoid of activity against the cardiac ion channels K_v1.1, Ca_v1.2, and Na_v1.5

Genetic toxicity: 34 is not mutagenic or clastogenic and is negative in an in vivo rat micronucleus assay

Regulatory toxicity: Repeat oral dosing of 34 in 2-week regulatory toxicity studies in monkeys (60 to 600 mg·kg^-1) and rats (40 to 1 000 mg·kg^-1) led to dose-dependent increases in both maximal plasma concentrations (C_max) and area-under-the-plasma concentration versus time curves (AUCs)


1	Activity: All coronavirus types known to infect humans, including β-coronaviruses (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, HKU1, OC43, and MERS-CoV) as well as α-coronaviruses (229E and NL63)
2	Selectivity: No inhibitory effects were noted against mammalian cysteine (caspase 2, cathepsin B, and cathepsin L), serine (chymotrypsin, elastase, and thrombin) and aspartyl (cathepsin D) proteases at the highest concentration tested (100 μmol·L^-1)
3	Potency for COVID-19 virus-infected mice: Significant reduction of lung viral titers
4	Histopathological analysis and immunostaining of lungs: From COVID-19 virus infected mice showed that 34 limits cellular infiltration and protects lung tissue from damage caused by virus replication
5	Immunohistochemical analysis: Using a viral nucleocapsid antibody to detect viral antigen levels in the lungs revealed that 34 inhibits virus replication in a dose-dependent manner
6	Plasma clearance (CL_p): CL_p exhibited moderate in rats and monkeys, with elimination half-lives (t_1/2) of 5 h and < 1 h, respectively, after intravenous dosing
7	Metabolic stability: In NADPH-supplemented HLMs, 34 demonstrated moderate CL_int (24.5 μL·min^-1·mg^-1), which was significantly inhibited (≥ 82%) by the selective CYP3A4/5 inhibitor ketoconazole
8	Favorable off-target selectivity profile: In a broad panel of G protein-coupled receptors, kinases, transporters, and phosphodiesterase enzyme inhibitor screens, and was devoid of activity against the cardiac ion channels K_v1.1, Ca_v1.2, and Na_v1.5
9	Genetic toxicity: 34 is not mutagenic or clastogenic and is negative in an in vivo rat micronucleus assay
10	Regulatory toxicity: Repeat oral dosing of 34 in 2-week regulatory toxicity studies in monkeys (60 to 600 mg·kg^-1) and rats (40 to 1 000 mg·kg^-1) led to dose-dependent increases in both maximal plasma concentrations (C_max) and area-under-the-plasma concentration versus time curves (AUCs)

No.

Description

Activity: All coronavirus types known to infect humans, including β-coronaviruses (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, HKU1, OC43, and MERS-CoV) as well as α-coronaviruses (229E and NL63)

Potency for COVID-19 virus-infected mice: Significant reduction of lung viral titers

Histopathological analysis and immunostaining of lungs: From COVID-19 virus infected mice showed that 34 limits cellular infiltration and protects lung tissue from damage caused by virus replication

Immunohistochemical analysis: Using a viral nucleocapsid antibody to detect viral antigen levels in the lungs revealed that 34 inhibits virus replication in a dose-dependent manner

Plasma clearance (CL_p): CL_p exhibited moderate in rats and monkeys, with elimination half-lives (t_1/2) of 5 h and < 1 h, respectively, after intravenous dosing

Genetic toxicity: 34 is not mutagenic or clastogenic and is negative in an in vivo rat micronucleus assay

尼马曲韦的研制和首创的抗COVID-19药物

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郭宗儒

药学学报 | 新药发现与研究实例简析 2022,57(2): 541-546

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药学学报 | 新药发现与研究实例简析 2022, 57(2): 541-546

尼马曲韦的研制和首创的抗COVID-19药物

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郭宗儒

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

Affiliations

出版时间: 2022-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0011

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引用本文

郭宗儒. 尼马曲韦的研制和首创的抗COVID-19药物. 药学学报, 2022 , 57 (2) : 541 -546 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0011

. Acta Pharmaceutica Sinica, 2022 , 57 (2) : 541 -546 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0011

正文

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新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。

本刊在2020年2月发表了瑞德西韦的案例, 当时处于疫情暴发初期, 由同情用药进行了III期临床研究, 实属应急之需。结果表明, 瑞德西韦对防治新冠肺炎的效果并不理想, 本品Paxlovid是FDA批准的第一个治疗COVID-19感染的药剂, Paxlovid是由首创药物尼马曲韦和已上市的药物利托那韦的复方药, 尼马曲韦是辉瑞公司用不到两年时间创制出针对COVID-19的特异性靶标SARS COV-2 3C^pro蛋白酶的抑制剂, 得益于十多年前研制SARS药物积累的成果和经验, 针对新冠病毒的特征量体裁衣式地演化出全新作用机制的口服药物, 并与小剂量的CYP450抑制剂利托那韦配伍, 提高了治疗效果。丰富的研发经验和娴熟的技术运用, 得以在短时间内创制出全球亟需的口服用药。(编者按)

1 引言

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1.1 SARS CoV-1和SARS CoV-2

2020年开始的全球性呼吸道传染病, 病原体为冠状病毒。基因组分析表明, 该病毒与2002~2003年流行的严重急性呼吸道症候(SARS) 病原体SARS CoV-1的基因有高度的相似, 称作SARS CoV-2。SARS CoV-1和SARS CoV-2基因组编码都有两个多聚蛋白(PP1a和PP1ab) 和4个结构蛋白, 含有3C样的半胱氨酸蛋白酶(3C^pro), 3C^pro催化裂解PP1a和PP1ab成较短的功能性蛋白, 后者对病毒复制至关重要。所以, 抑制3C^pro功能成为研制抗SARS CoV-1/2的靶标。由于SARS CoV-1和SARS CoV-2的3C^pro活性中心的构成相同, 因而辉瑞公司研制抗SARS CoV-2药物沿用了当初研究SARS CoV-1抑制剂的积累和技术。

1.2 3C^pro蛋白酶活性中心的特征

所有冠状病毒的3C^pro活性部位具有高度保守性, 与底物结合是由4个位点构成: S₁、S₂、S₁′和S₂′, 如图1所示。酶的剪切位点是S₁′处的Cys145的肽键。半胱氨酸的巯基具有较强的亲核性, 可作为研制3^pro抑制剂的把手, 与具有适度亲电性基团的抑制剂作共价结合, 项目的研究依此作为出发点 (Dai WH, Zhang B, Jiang XM, et al. Structure-based design of antiviral drug candidates targrting the SARS-CoV-2 main protease. Science, 2020, 368: 1331-1335)。

1.3 与巯基发生共价结合的基团和片段

与巯基生成可逆(或不可逆) 共价结合的基团或片段有醛基、硫代或氧甲基酮、胺酰基甲基酮、氰基以及1, 2-二羰基结构等, 共价结合的牢固性取决于这些基团所处的化学环境。图 2是与巯基作共价结合的常用基团。

2 先导物的产生

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2003年暴发SARS疫情, 辉瑞为研究SARS CoV-1 3C^pro抑制剂, 借鉴了1997年默克研制的对人鼻病毒(HRV) 3C^pro有选择性不可逆抑制作用的芦平曲韦(1, rupintrivir, 未上市), 分析1与另一种冠状病毒传染性胃肠炎病毒(TGEV) 的3C^pro复合物的晶体结构, 用来同源建模SARS CoV-1 3C^pro蛋白酶的三维结构。虽然SARS CoV-1 3C^pro与HRV-3C^pro的同源性较低, 但两个底物蛋白的序列有共性。推论1有可能成为设计SARS CoV-1 3C^pro抑制剂的起始物, 然而实验结果表明芦平曲韦对SARS CoV-1 3C^pro蛋白酶活性很低, 需要进行较大的结构改造。为此, 保留了1中的迈克尔亲电基团, 将对应于S1和S1′的P1和P1′结构部分加以变换, 对应于S2和S2′的P2和P2′作较大的结构删除以降低分子尺寸, 经构效关系分析得到了活性化合物2 (代号PF-00835231), 是具有中等强度的不可逆抑制剂[k_obs/I = 586 (mol·L^-1)^-1s^-1]。图 3是化合物2与SARS CoV-13C^pro复合物晶体结构图(Anand K, Ziebuhr J, Wadhwani P, et al. Coronavirus main proteinase (3CLpro) structure: basis for design of anti-SARS drugs. Science, 2003, 300: 1763-1767)。

分析图 3的结合信息, P2′域甲氧基吲哚(帽基) 结合于S2′, 环上NH与酶的Glu189形成氢键结合; P1处的内酰胺环替换底物谷氨酰胺环仍能很好地适配于S1腔穴。迈克尔基团(丙烯酸乙酯) 与巯基发生加成反应, 生成的两个sp³杂化的α, β-碳原子呈重叠式构象, 这种较高能量的构象对活性不利。羰基氧的孤电子对与3C^pro蛋白氧阴离子穴的氢键给体之间的空间排布未成180° (不利于氢键结合), 而且其他一些氢键键长明显超过最适的2.8Å, 这些都需要进一步提高。

下面叙述的是对SARS CoV-1 3C^pro靶标活性的结构优化, 虽然优化出高活性的候选物, 因SARS疫情结束而未作临床研究, 却为2020年COVID-19的流行, 研制针对SARS CoV-2 3C^pro靶标的药物打下了坚实的基础。

3 先导物的优化

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以化合物2作为先导物继续优化对SARS CoV-1 3C^pro的抑制作用, 变换结构考虑两个方面, 一是不同的迈克尔亲电基团的反应性能, 另一是分子结构对酶的亲和力, 二者良好的匹配是兼具高活性和高选择性的保障。

首先是变换迈克尔基团, 由于Cys145是蛋白剪切的位点, 裂解过程的过渡态形成碳四面体结构, 为模拟过渡态的结构特征, 选择用O-酰化羟甲基酮作为亲电基团, 羰基和酰氧基的拉电子效应, 提高了中间的亚甲基亲电性, 以与巯基发生亲电取代, 导致可逆或不可逆性共价结合(Krantz A, Copp LJ, Coles PJ, et al. Peptidyl (acyloxy) methyl ketones and the quiescent affinity label concept: the departing group as a variable structural element in the design of inactivators of cysteine proteinases. Biochemistry, 1991, 30: 4678-4687)。

3.1 迈克尔亲电基团的变换

首轮变换的结构部分是P1′处的迈克尔亲电基团, 设计合成的化合物列于表 1。活性测定是用连续荧光共振能量转移实验评价对SARS CoV-1 3C^pro的抑制。k_obs为一级速率常数, 代表SARS CoV-1 3C酶失活的速率, k_obs与化合物浓度[I] 作图(k_obs/I) 的斜率代表化合物对酶反应不可逆的抑制程度, 数值越大活性越强。IC₅₀表示酶的活性被可逆性抑制50%时化合物的摩尔浓度, 数值越小活性越强。

结果表明, 脂肪酸酯的化合物3~5的烷基由于电性相近, 对亚甲基的亲电效应变化不大, 因而活性相近。化合物6~12为单(或无) 取代苯甲酸酯, 与活性部位的结合是可逆性抑制, 其中2-氰基苯基(12) 的活性最高, IC₅₀达到17 nmol·L^-1。15~18是在苯环上有两个吸电子基团, 亲电性强, 与酶的亲核中心发生不可逆的共价结合, 其中二氯代的15活性最强。15对SARS CoV-1感染Vero 76细胞的活性EC₅₀ = 0.29 μmol·L^-1, 是个很强的化合物, 因为Vero 76细胞对外源性物质的外排作用很强。15还显示较高的选择性, 对谷胱甘肽和在血浆中都有很高的稳定性。然而15的溶解性太差, 不宜深入临床研究。苯环上双取代化合物13和14是推电子基团, 是可逆性抑制剂。

3.2 变换化合物15的P2'片段

为了克服15溶解度低的缺点, 固定P1、P1′和P2的结构不变, 改变P2′帽基4-甲氧基吲哚片段为水溶性或极性片段, 例如表 2列出的叔丁氧基(19) 或甲基(20), 结果是显著降低了活性; 苯并咪唑(21) 仍保持不可逆抑制活性(略低), 但没有改善溶解性。四氢呋喃化合物22活性虽然比15降低了10倍, 但溶解度提高了20倍, 对病毒感染Vero 76细胞的EC₅₀为2.4 μmol·L^-1。

病毒生物学分析表明, 不可逆抑制剂虽然具有良好的药效学表现, 但如果病毒蛋白的再合成速率低于药物的清除率, 那么对3C^pro蛋白的抑制不一定拘泥于不可逆抑制的机制。新表达的病毒多聚蛋白经3C^pro催化裂解固然对病毒复制至关重要, 但它呈现活性只是在细胞被感染后病毒生命周期的单个环节, 病毒颗粒本身并不依赖3C^pro蛋白的活性, 其他环节也不受控制, 因为细胞每当被感染后就启动重新合成3C^pro蛋白。由于这个动力学过程尚不完全清楚, 所以辉瑞研究者决定同时研发可逆的和不可逆的抑制剂, 不局限于不可逆抑制剂。

3.3 含有羟甲基酮片段的可逆性抑制剂

基于化合物18与SARS CoV-1 3C^pro的共晶结构的分析, 氰基苯甲酰基已不复存在, 是由于亚甲基碳与Cys135的巯基形成C-S共价键结合时氰基苯甲酰基为离去基团, 酮基与酶骨架的Gly143和Cys145 NH形成氢键网络, 起催化作用的His41经咪唑环上的N-H与结构水形成氢键, 水分子又同时与Asp187的侧链和Asp176骨架上的羰基形成氢键网络将抑制剂固定在活性部位。然而根据组织蛋白酶(cathepsin) 与含有羟甲基酮片段的抑制剂的晶体结构特征, 巯基并没有与亚甲基形成共价键(羟基的亲电子性弱于氰基苯甲酰氧基), 羟基只是与His41形成氢键。此外, P2处的亲脂性有利于同底部的疏水腔结合。分子模拟显示, S2部位(R₁) 可容纳直链、叉链或环状的烷基, 例如表 3列出的化合物23、26~28显示有较好的抑酶活性, 但平面性的苯环(29) 活性弱。25的R₂为甲基, 比相应的R₂为氢原子的24活性弱20倍, 这是由于失去了NH参与同S2处Gln189发生氢键结合的缘故, 同时N-CH₃也改变了帽基4-甲氧基吲哚的空间取向。

表 3中24的活性最强, 对酶抑制活性IC₅₀ = 4 nmol·L^-1, 抗病毒感染细胞的活性EC₅₀ = 5 μmol·L^-1。酶与细胞活性之差上千倍, 提示24的过膜性较差, 是由于分子中极性基团和氢键因素多, 以及感染的细胞外排作用强的缘故。

3.4 化合物24与SARS CoV-1 3C^pro的结合特征

化合物24是抑酶活性最强的化合物, 24与SARS CoV-1 3C^pro的共晶结构分析, 以及后来测定的24与SARS CoV-2 3C^pro的共晶结构(这是本文最关注的) 表明, 二者的结合方式是相同的, 原因是这两个蛋白酶与底物蛋白的结合位点是相同的(底物被裂解的部位的氨基酸序列相同)。图 4a是24与SARS CoV-1 3C^pro晶体结构的X-射线衍射图, 图 4b是24与CoV-2蛋白酶结合的模式图。

24中的亲电基团羟甲基酮的羰基与3C^pro的Cys145的巯基发生亲电加成形成四面体的甲醇(carbinol) 结构, 该羟基与Cys145骨架上的NH形成氢键, 醇基还通过结构水分子与Gly143的NH形成氢键。P1′的亚甲羟基与催化中心的二元体(dyad) 之一His41形成氢键。P1处的内酰胺环进入S1的疏水腔中。24的两个酰胺的NH作为氢键给体与His164和Gln189形成氢键, P2处吲哚环上的NH与Glu166形成氢键, 异丁基与疏水腔发生疏水相互作用。

3.5 里程碑化合物PF-00835231

化合物24对SARS CoV-1 3C^pro的抑制活性IC₅₀ = 4 nmol·L^-1, 对SARS CoV-2 3C^pro的活性更强, IC₅₀ = 0.27 nmol·L^-1, 后者对于研制抗COVID-19病毒药物是个里程碑分子。24对包括组织蛋白酶在内的多种蛋白酶的活性很弱, IC₅₀大于10 μmol·L^-1 (数据从略), 提示对SARS CoV病毒具有高选择性, 在血浆内是稳定的, 体内清除率很低, 溶解性尚可, 遂以代号PF-00835231拟进入临床研究, 后因SARS疫情消失而终止了研发。然而, PF-00835231却成为研制COVID-19的新冠肺炎药物的开端(Hoffman RB, Kania RS, Brothers MA, et al. Discovery of ketone-based covalent inhibitors of coronavirus 3CL proteases for the potential therapeutic treatment of COVID-19. J Med Chem, 2020, 63: 12725-12747)。

4 化合物24的优化

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化合物24有较高的抗病毒活性, 对SARS CoV-2 3C^pro蛋白酶的结合常数K_i = 0.271 nmol·L^-1, 对COVID-19病毒感染的Vera 76细胞的半数最大有效浓度EC₅₀ = 231 nmol·L^-1。然而药代动力学的过膜吸收性很差(P_app < 0.207×10^-6 cm·s^-1); 动物口服生物利用度F值仅为1.4%, 口服剂量在胃肠道的吸收率(F_a × F_g) 只有3.3%。因而下一步结构优化的方向是保持或提高抗COVID-19病毒活性的前提下, 改善化合物的过膜性和生物利用度。优化的切入点是减少氢键结合的数量, 降低分子的极性。

4.1 变换α-羟甲基酮片段

分子中氢键给体的数量越多, 口服生物利用度越小(Veber DF, Johnson SR, Cheng HY, et al. Molecular properties that influence the oral bioavailability of drug candidates. J Med Chem, 2002, 45: 2615-2623)。α-羟甲基酮作为半胱氨酸蛋白酶的共价结合的基团(巯基的迈克尔亲电基团) 可以变换为其他非氢键的弱亲电性基团, 例如前述的氰基(Chuck CP, Chen C, Ke ZH, et al. Design, synthesis and crystallographic analysis of nitrile-based broad-spectrum peptidomimetic inhibitors for coronavirus 3C-like proteases. Eur J Med Chem, 2013, 59: 1-6)。合成的化合物30 (表 4) 活性略有损失, 但大鼠口服生物利用度提高到F = 7.6%, 在胃肠道的吸收率F_a × F_g = 38%, 药代有了明显的提升。综合药效和药代的效果, 30未达到预期的标准。

4.2 羟甲基变换成苯并噻唑和减少骨架上的氢键

苯并噻唑的2-位酮基具有亲电性, 可与巯基发生迈克尔加成, 以此替换羟甲基酮减少氢键给体, 此外, 还用6, 6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷作为环状亮氨酸的模拟物, 可进入S2处的疏水腔中, 并减少了24中骨架上的肽键。设计合成的化合物31改善了过膜性, 但清除率很高, 加之抑制酶和感染细胞的活性显著降低, 实不可取。

4.3 帽基4-甲氧基吲哚的变换

化合物24的4-甲氧基吲哚环没有进入S2腔穴内, 这是活性低的原因之一。31的二甲基氮杂双环[3.1.0]己烷虽然进入了S2腔, 但缺少与Gln189形成氢键的因素, 为此将甲氧基吲哚换成带有甲磺酰胺和叉链烷基的片段(兼有形成氢键和疏水结合的因素), 化合物32的磺酰胺NH与Glu189形成氢键, 酶与细胞活性明显提高, 虽然过膜性降低但代谢稳定性和口服生物利用度有所提高, 尤其是提高了胃肠道的吸收率(F_a × F_g = 84%)。

或许磺酰胺的极性过强, 不利于过膜, 将甲磺酰基换成三氟甲基, 化合物33的抗感染细胞活性和过膜性、代谢稳定性和生物利用度以及胃肠道吸收率(F = 10%, F_a × F_g = 100%) 都超越了32。

4.4 候选化合物的确定

基于药物化学的拼合原理, 再用氰基替换P1′处的苯并噻吩片段, 得到化合物34, 34抑制SARS-CoV-2 3C^pro蛋白和抗病毒感染细胞的活性都强于33。34的分子量M_W = 499.53, 33的分子量M_W = 621.67, 降低了120 Da, 34除过膜性略逊于33外(因为分子整体的亲脂性降低了), 药代动力学的其他行为都优于33。遂将34确定为候选化合物定名为尼马曲韦(nirmatrevir)。

为了确定34与酶的结合方式, 将SARS-CoV-2 3C^pro酶蛋白分别与34和前述的不可逆抑制剂22 (K_i = 2 nmol·L^-1) 温孵30 min, 培养液稀释后测定酶活性显示, 34仍保持 > 50%的酶活性, 而22的活性全无, 证明34的氰基与Cys145发生的共价结合是可逆性的加成反应。图 5显示了34与SARS CoV-1 3C^pro的活性中心结合的方式(Owen DR, Allerton CMN, Anderson AS, et al. An oral SARS-CoV-2 Mpro inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19. Science, 2021, 374: 1586-1593)。

4.5 尼马曲韦的生物学特征

为了进入临床试验, 对34进行了广泛深入的生物学研究, 内容列入表 5。

5 尼马曲韦的批准和帕洛韦的上市

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COVID-19引起的新冠肺炎持续流行到2022年, 由阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、德尔塔(delta) 数度变异成奥密克戎(omicron) 多位点突变株, 两年来疫情持续不断, 除预防性接种疫苗外, 患者亟需特异性治疗药。辉瑞在十多年前研究SARS治疗药的基础上, 针对新冠病毒的SARS-CoV-2 3C^pro酶蛋白进行深入研究, 在不到两年的时间完成了临床试验和规模制备。为了降低34在体内被CYP3A4的氧化代谢, 以延长尼马曲韦在体内的抗病毒时程, 将低剂量(100 mg) 的CYP3A4抑制剂利托那韦(35, ritonavir) 与本品(2×150 mg) 复合口服用药, 取名为帕洛韦(paxlovid), 每日服用两次, 持续5天, 用于治疗非住院、具有发展成重度疾病的高风险成人COVID-19的病毒感染。2021年12月美国FDA批准辉瑞对帕洛韦的紧急授权申请, 成为治疗COVID-19新冠肺炎的首创性药物。

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2022年第57卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0011

首发时间：2025-12-22
出版时间：2022-02-12

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中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT


3	Me	-	220
4	cyc-Pro	-	182
5	tert-Bu	-	230
6	Ph	-	86
7	4-MeO-Ph	-	79
8	4-Me-Ph	-	87
9	4-CN-Ph	-	53
10	4-F-Ph	-	82
11	4-Cl-Ph	-	97
12	2-CN-Ph	-	17
13	2, 6-(Me)₂ -Ph	-	74
14	2, 6-(OMe)₂ -Ph	-	205
15	2, 6-(Cl)₂ -Ph	62 993	-
16	2, 6-(F)₂ -Ph	12 776	-
17	2-OH-4-Cl-Ph	11 525	-
18	2-F-4-CN-Ph	13 321	-

Compd.

SARS CoV-1 3C^pro FRET^a

k_obs/I /(mol·L^-1)^-1s^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

220

cyc-Pro

182

tert-Bu

230

4-MeO-Ph

4-Me-Ph

4-CN-Ph

4-F-Ph

4-Cl-Ph

2-CN-Ph

2, 6-(Me)₂ -Ph

2, 6-(OMe)₂ -Ph

205

2, 6-(Cl)₂ -Ph

62 993

2, 6-(F)₂ -Ph

12 776

2-OH-4-Cl-Ph

11 525

2-F-4-CN-Ph

13 321


15		62 993	-
19		-	24% inhibition @ 1000
20	CH₃	-	1 028
21		30 287	-
22		5 834	-

Compd.

SARS CoV-1 3C^pro FRET

k_obs/I /(mol·L^-1)^-1s^-1

IC₅₀/nmol·L^-1

62 993

24% inhibition @ 1000

CH₃

1 028

30 287

5 834


23	H	7	10
24	H	4	5
25	CH₃	83	19
26	H	20	10
27	H	34	44
28	H	44	14
29	H	103	47

Compd.

R₁

R₂

SARS CoV-1 3C^{pro a}
IC₅₀/nmol·L^-1

SARS CoV-1^a
EC₅₀/μmol·L^-1

CH₃

103

Compd.	SARS CoV-2 3C^pro K_i/nmol·L^-1	Vera E6 EC₅₀/nmol·L^-1	MDCK-LE^a P_app×10^-6 cm·s^-1	HLM CL_int^b /mL·min^-1·mg^-1	Rat oral bioavailability F/%	F_a×F_g /%
24	0.271	231	< 0.207	7.47	1.4	3.3
30	27.7	1 364	0.945	34.4	7.6	38
31	230	5 593	10.3	337	-	-
32	7.93	909	1.56	127	10	84
33	12.1	85.3	13.1	30.3	33	100
34	3.11	74.5	1.71	24.5	50	96

Compd.

Structure

SARS CoV-2 3C^pro
K_i/nmol·L^-1

Vera E6 EC₅₀/nmol·L^-1

MDCK-LE^a P_app×10^-6 cm·s^-1

HLM CL_int^b /mL·min^-1·mg^-1

Rat oral bioavailability F/%

F_a×F_g
/%

0.271

231

< 0.207

7.47

1.4

3.3

27.7

1 364

0.945

34.4

7.6

230

5 593

10.3

337

7.93

909

1.56

127

12.1

85.3

13.1

30.3

100

3.11

74.5

1.71

24.5


1	Activity: All coronavirus types known to infect humans, including β-coronaviruses (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, HKU1, OC43, and MERS-CoV) as well as α-coronaviruses (229E and NL63)
2	Selectivity: No inhibitory effects were noted against mammalian cysteine (caspase 2, cathepsin B, and cathepsin L), serine (chymotrypsin, elastase, and thrombin) and aspartyl (cathepsin D) proteases at the highest concentration tested (100 μmol·L^-1)
3	Potency for COVID-19 virus-infected mice: Significant reduction of lung viral titers
4	Histopathological analysis and immunostaining of lungs: From COVID-19 virus infected mice showed that 34 limits cellular infiltration and protects lung tissue from damage caused by virus replication
5	Immunohistochemical analysis: Using a viral nucleocapsid antibody to detect viral antigen levels in the lungs revealed that 34 inhibits virus replication in a dose-dependent manner
6	Plasma clearance (CL_p): CL_p exhibited moderate in rats and monkeys, with elimination half-lives (t_1/2) of 5 h and < 1 h, respectively, after intravenous dosing
7	Metabolic stability: In NADPH-supplemented HLMs, 34 demonstrated moderate CL_int (24.5 μL·min^-1·mg^-1), which was significantly inhibited (≥ 82%) by the selective CYP3A4/5 inhibitor ketoconazole
8	Favorable off-target selectivity profile: In a broad panel of G protein-coupled receptors, kinases, transporters, and phosphodiesterase enzyme inhibitor screens, and was devoid of activity against the cardiac ion channels K_v1.1, Ca_v1.2, and Na_v1.5
9	Genetic toxicity: 34 is not mutagenic or clastogenic and is negative in an in vivo rat micronucleus assay
10	Regulatory toxicity: Repeat oral dosing of 34 in 2-week regulatory toxicity studies in monkeys (60 to 600 mg·kg^-1) and rats (40 to 1 000 mg·kg^-1) led to dose-dependent increases in both maximal plasma concentrations (C_max) and area-under-the-plasma concentration versus time curves (AUCs)

No.

Description

Activity: All coronavirus types known to infect humans, including β-coronaviruses (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, HKU1, OC43, and MERS-CoV) as well as α-coronaviruses (229E and NL63)

Potency for COVID-19 virus-infected mice: Significant reduction of lung viral titers

Histopathological analysis and immunostaining of lungs: From COVID-19 virus infected mice showed that 34 limits cellular infiltration and protects lung tissue from damage caused by virus replication

Immunohistochemical analysis: Using a viral nucleocapsid antibody to detect viral antigen levels in the lungs revealed that 34 inhibits virus replication in a dose-dependent manner

Plasma clearance (CL_p): CL_p exhibited moderate in rats and monkeys, with elimination half-lives (t_1/2) of 5 h and < 1 h, respectively, after intravenous dosing

Genetic toxicity: 34 is not mutagenic or clastogenic and is negative in an in vivo rat micronucleus assay