药学学报

CpG ODN联合肿瘤抗原致敏的树突状细胞疫苗抑制和预防小鼠黑色素瘤的研究

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曾佳昕 ¹^,²^,^# , 张文渊 ²^,^# , 刘二刚 ³^,^* , 刘凌云 ⁴ , 黄永焯 ²^,³ , 王慧媛 ²^,^*

药学学报 | 研究论文 2022,57(2): 385-391

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药学学报 | 研究论文 2022, 57(2): 385-391

CpG ODN联合肿瘤抗原致敏的树突状细胞疫苗抑制和预防小鼠黑色素瘤的研究

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曾佳昕¹^,²^,^#, 张文渊²^,^#, 刘二刚³^,^*, 刘凌云⁴, 黄永焯²^,³, 王慧媛²^,^*

作者信息

1.广州中医药大学第一附属医院, 广东广州 510405

2.中国科学院上海药物研究所, 上海 201203

3.中国科学院药物创新研究院中山研究院, 广东中山 528437

4.广州中医药大学基础医学院, 广东广州 510006

通讯作者:

*刘二刚, Tel: 13501639275, E-mail: liuergang@zidd.ac.cn;

王慧媛, Tel: 13661835307, E-mail: wanghuiyuan@simm.ac.cn

Effect of DC vaccine sensitized with CpG ODN combined with tumor antigen on murine melanoma

Jia-xin ZENG¹^,², Wen-yuan ZHANG², Er-gang LIU³^,^*, Ling-yun LIU⁴, Yong-zhuo HUANG²^,³, Hui-yuan WANG²^,^*

Affiliations

1. The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China

2. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China

3. Zhongshan Branch, the Institute of Drug Research and Development, Chinese Academy of Sciences, Zhongshan 528437, China

4. The Research Center of Basic Integrative Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

出版时间: 2022-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-0760

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摘要

收起

探讨非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）的脱氧寡核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）联合肿瘤抗原致敏树突状细胞（DC）治疗和预防黑色素瘤的作用。首先从小鼠骨髓中分离得到骨髓来源的树突状细胞（BMDC），并将小鼠黑色素瘤B16细胞来源的全抗原与DC共孵育，采用全硫代修饰的CpG ODN作DC免疫刺激剂，制备DC疫苗。通过测定T淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对靶细胞B16的杀伤作用来评价该疫苗的体外免疫活性。将疫苗经小鼠腹腔注射，观察其治疗和预防小鼠黑色素瘤的效果。所有动物实验均在中国科学院上海药物研究所实验动物管理委员会（IACUC）的指导和标准下进行。结果显示，CpG ODN和肿瘤抗原联用致敏的DC疫苗能够促进T淋巴细胞增殖，并提高活化的T淋巴细胞对靶细胞B16的杀伤活性。体内实验表明，无论是治疗实验还是预防实验，DC疫苗组的平均瘤重和瘤体积均低于PBS对照组。实验结果证明基于CpG ODN和黑色素瘤肿瘤抗原制备的DC疫苗对肿瘤具有较好的抑制作用，为恶性黑色素瘤治疗提供了一个潜在的方案。

关键词

树突状细胞 / 肿瘤疫苗 / CpG寡脱氧核苷酸 / 黑色素瘤 / 免疫治疗

Abstract

收起

The potential application of dendritic cells (DC) sensitized with cytosine-phosphoric acid-guanine (CpG) oligodeoxynucleotide (ODN) and tumor antigen as a vaccine against murine melanoma was investigated with freshly isolated mouse bone marrow-derived dendritic cells. For the DC vaccine preparation, DC were sensitized with the B16 tumor antigen and CpG ODN was used to promote further maturation of the DC. The immunogenic activity of the vaccine was evaluated in vitro by determining the proliferation of T lymphocytes and the killing effect of cytotoxic T lymphocytes (CTL) on B16 tumor cells. The DC vaccine was injected intraperitoneally and tumor inhibition in mice bearing B16 xenografts was examined. All mice were cared for under an approved SIMM Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocol. In vitro, this DC vaccine promoted the proliferation of T lymphocytes and showed a potent killing effect on the target B16 cells. In vivo experiments showed that after treatment or pre-immunization both the tumor volume and weight were significantly decreased. The DC vaccine with CpG ODN and tumor antigen exhibited an inhibitory effect against melanoma, providing a potential method for melanoma cancer treatment.

Key words

dendritic cell / tumor vaccine / CpG oligodeoxynucleotide / melanoma / immunotherapy

引用本文

曾佳昕, 张文渊, 刘二刚, 刘凌云, 黄永焯, 王慧媛. CpG ODN联合肿瘤抗原致敏的树突状细胞疫苗抑制和预防小鼠黑色素瘤的研究. 药学学报, 2022 , 57 (2) : 385 -391 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0760

Jia-xin ZENG, Wen-yuan ZHANG, Er-gang LIU, Ling-yun LIU, Yong-zhuo HUANG, Hui-yuan WANG. Effect of DC vaccine sensitized with CpG ODN combined with tumor antigen on murine melanoma[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2022 , 57 (2) : 385 -391 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0760

正文

收起

肿瘤与免疫功能密切相关, 免疫系统的抑制促进了肿瘤的进展^[1]。近年来, 肿瘤的免疫治疗进展很快, 已通过各种手段激活免疫系统来产生持久的杀伤肿瘤细胞的免疫效应^[2]。基于树突状细胞(dendritic cell, DC) 的疫苗在肿瘤治疗中显示出较好的前景^[3], 2010年自体前列腺癌疫苗Sipuleucel-T (Provenge) 获FDA批准上市^[4]。DC是起源于骨髓造血祖细胞或单核细胞分化而成的专职抗原提呈细胞(APCs), 起到抗原呈递和介导T细胞活化的功能, 能够激活免疫, 杀伤肿瘤细胞。然而, 与正常组织相比, 肿瘤部位浸润的DC明显减少, 且存在不同程度的功能缺陷, 无法有效提呈抗原、激发细胞毒性T淋巴细胞(CTL) 识别和杀伤肿瘤细胞, 导致免疫耐受^[5]。

由于DC的成熟度与功能直接相关, 因此DC的成熟和活化是机体抗肿瘤免疫中的重要环节。以肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原肽、肿瘤细胞裂解物或者凋亡的肿瘤细胞刺激DC, 均能使DC激活, 并且在体内展现较强的抗肿瘤免疫应答^{[6, 7]}。

黑色素瘤具有强免疫原性, 因此免疫治疗在黑色素瘤的治疗中有较多建树, 目前常见的针对黑色素瘤的免疫治疗方法是以免疫检查点抑制剂为主的抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4) 抗体和程序性死亡受体1 (PD-1) 抗体。然而临床试验发现, PD-1单抗在中国黑色素瘤患者中疗效低于西方人群且容易出现耐药。尤其是针对肢端、黏膜来源的黑色素瘤患者, 有效率更低。因此需要有新药物、新技术的发展。肿瘤患者的差异性是导致免疫疗法难以进行广泛治疗的原因之一。运用肿瘤患者自身肿瘤组织的抗原, 激活DC形成的是针对患者个人的定制型疫苗, 可以拥有患者癌细胞所携带的几乎所有的抗原信息, 能提呈多样的肿瘤抗原, 大大增强免疫系统识别肿瘤细胞的能力。

此外, 含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN) 可以被Toll样受体9 (TLR9) 识别并触发机体防御机制^[8]。CpG ODN作为免疫增强剂不仅能促进促炎性辅助性T细胞(Th) 分群1 (Th1) 细胞因子的产生, 还能促进DC等抗原提呈细胞的成熟和活化, 而且可以进一步增强肿瘤疫苗的功能^{[9, 10]}。

本研究采用黑色素瘤细胞来源的全抗原来刺激骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDC), 并联合CpG ODN作为DC的成熟刺激信号, 体外诱导DC成熟, 制备DC疫苗。通过体内外实验, 探讨DC疫苗治疗和预防小鼠黑色素瘤的作用, 为实现黑色素瘤DC疫苗的应用提供实验依据。

材料与方法

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细胞株及实验动物 B16 (小鼠黑色素瘤细胞株) 购于中国科学院细胞库; C57BL/6小鼠, 雄性, 4~5周龄, 体重20 ± 2 g, 购自上海斯莱克实验动物有限公司, 动物实验操作均遵循中国科学院上海药物研究所实验动物管理委员会(IACUC) 的规范和准则。实验动物使用许可证号: SYXK (沪) 2020-0042。

主要试剂 CpG-ODN由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成, 序列是CpG21798: 5'-T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G-3', 其中(*) 代表硫代磷酸酯键连接, (-) 代表磷酸二酯键连接^[11]; 重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF) 和白介素-4 (rmIL-4) 购于Sigma-Aldrich公司; PE标记的大鼠抗小鼠CD11c单克隆抗体、大鼠抗小鼠CD86单克隆抗体购于BD Pharmingen公司。

BMDC的获取和培养 按常规操作, 安乐死小鼠后, 无菌操作分离股骨和胫骨, 将骨两端剪去, 用注射器吸取无血清的培养基将骨髓冲出, 用移液枪吹打均匀, 然后用200目滤网过滤, 300 ×g离心5 min, 收集细胞, 再用红细胞裂解液裂解后重悬, 300 ×g离心两次去上清, 调节细胞浓度为每毫升1×10⁶个, 置于新鲜1640培养基(含10%胎牛血清、20 ng·mL^-1 GM-CSF和4 ng·mL^-1 IL-4) 中培养。于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养, 每2天换液1次。

T淋巴细胞的获取 取小鼠脾脏置于筛网中, 反复研磨脾脏, 用培养基充分吹下细胞至皿中。300 ×g离心5 min, 弃上清。红细胞裂解液裂解后重悬, 300 ×g离心两次去上清。按照尼龙毛柱法进行T细胞洗脱: PBS平衡尼龙毛柱子, 经过高压灭菌后垂直固定于生物安全柜内; 打开夹子, 调节流速为3~4 mL·min^-1; 先后加入3倍体积的无血清培养基和3倍体积的有血清培养基平衡柱子; 随后用培养基4 mL重悬细胞(每毫升5×10⁸个), 样品加入后, 再加少量培养液, 然后关闭弹簧夹, 在培养箱内37 ℃孵育1 h; 取出柱子, 置于生物安全柜内, 加入适当体积经37 ℃预热的培养基, 打开弹簧夹控制流速为3~4 mL·min^-1, 流出约5 mL之后, 流出的培养液不再透明, 此时流出液含有T细胞, 收集这部分培养基。流式细胞仪鉴定后备用。

BMDC疫苗的制备 如图 1A, 首先制备B16肿瘤细胞冻融粗提全抗原: 将处于对数生长期的B16小鼠黑色素瘤细胞消化, 计数并收集到离心管中, 在水浴(37 ℃) 和液氮中反复冻融5个循环, 获得具有全抗原的B16肿瘤细胞组分, 在-80 ℃保存。随后, 收获培养至第7天的未成熟的BMDC细胞, 调整浓度为每毫升1×10⁶个, 每孔按BMDC与抗原细胞的比例1∶10加入B16肿瘤细胞冻融抗原(计数按冻融前的细胞数量计数), 重悬于DC完全培养基, 在培养箱中继续培养48 h。最后加入CpG ODN使其终浓度为2 μmol·L^-1, 继续培养48 h后收获诱导成熟的BMDC细胞, 即得BMDC疫苗。收集BMDC细胞, 常规制样, 加入1∶100稀释的荧光标记相应单抗, 标记30 min (冰浴避光), PBS洗1次后再用PBS重悬细胞, 流式细胞仪检测表面分子CD11c和CD86的表达。

淋巴细胞增殖反应 分别采用CCK8法和CFSE法检测淋巴细胞的增殖反应。CCK8法: 按上述方法制成的T淋巴细胞悬液, 加入96孔平底板, 调整T细胞数目为1×10⁵个/孔。与BMDC疫苗共培养48 h后, CCK8法比较T细胞的增殖指数。共培养结束后, 每孔加入CCK8试剂, 置于培养箱内4 h, 450 nm波长下测量A值。增殖指数= (实验组A值/ 对照组A值- 1) × 100%。CFSE法: 将T细胞经可对活细胞进行荧光标记的染料CFSE (5, 6-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) 标记, 然后与BMDC疫苗共培养48 h, 流式检测T细胞荧光强度的变化。

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对B16靶细胞的杀伤作用以B16细胞为靶细胞测定CTL活性。靶细胞按1×10⁵个/孔加入24孔板, 培养24 h后, 加入用DC疫苗诱导的T淋巴细胞继续培养48 h。采用CFSE法观察CTL抑制B16细胞增殖的作用。同时以流式细胞仪(Annexin V/PI) 检测CTL对B16细胞的杀伤作用, Annexin V/PI双阳性细胞为经过CTL作用的处于晚期凋亡状态的B16细胞。

BMDC疫苗体内抗黑色素瘤的活性 荷瘤小鼠模型的建立: B16细胞于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养, 细胞生长至90%左右时, 台盼蓝染色, 细胞计数, 制备为每毫升1×10⁷个的细胞悬液。吸取200 μL注射到C57BL/6小鼠背部皮下, 医用胶水闭合注射针眼。待肿瘤生长至100 mm³, 随机分为两组, 一组为PBS对照组, 另一组以DC疫苗按照每只1×10⁶个/0.5 mL腹腔注射治疗小鼠, 每周1次, 以相同剂量加强免疫, 共免疫2次。治疗过程中测瘤体大小, 计算肿瘤体积(V = 1/2 ×长径×短径²), 绘制荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线。第2次免疫1周后处死小鼠, 称取瘤重, 计算抑瘤率。抑瘤率= (PBS对照组平均瘤重- 治疗组瘤重) / PBS对照组平均瘤重× 100%。

BMDC疫苗体内预防黑色素瘤诱导免疫的作用 先以BMDC疫苗腹腔注射免疫动物, 每只1×10⁶细胞/0.5 mL, 每周1次, 共2次。末次免疫3周后, 分别给免疫小鼠接种体外培养到对数生长期的B16黑色素瘤细胞(2×10⁶个/只)。观察生长情况, 21天后CO₂窒息法处死小鼠, 称取瘤重, 计算抑瘤率。

数据处理和分析 采用Originpro 9软件对实验数据进行处理分析。数据表示为$ \overline x $ ± s。统计学显著性差异定义为P < 0.05、P < 0.01。

结果

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1 CpG ODN和肿瘤抗原联用对DC的活化作用

为了观察CpG ODN和肿瘤抗原对DC疫苗的促进作用, 单独使用CpG或者CpG联合肿瘤抗原刺激体外培养的BMDC细胞, 然后用流式细胞仪检测CD11c和CD86的表达。如图 1C、D所示, 在显微镜下观察, BMDC经刺激后, 细胞表面形成了大量树突状的突起, 可见伪足突出, 胞质逐渐变大。

同时, 经过刺激的BMDC与未成熟BMDC组比较, 表面标志物CD11c、CD86的阳性细胞率均明显增加, 且平均荧光强度也明显增长。结果显示, 经刺激获得的BMDC为成熟的BMDC细胞(图 2), 且CpG ODN和肿瘤抗原联合刺激后致敏DC的效果更强。

2 BMDC疫苗致T淋巴细胞的增殖能力明显增强

CpG-ODN和肿瘤抗原致敏DC后, 活化T淋巴细胞的增殖能力有所增强。如图 3A所示, CFSE是活细胞染料, 能够轻易穿透细胞膜, 在活细胞内与胞内蛋白共价结合, 水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中, 每分裂一次, CFSE会平均分配至两个子代细胞中, 因此其荧光强度是亲代细胞的一半。由于CFSE的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级减弱, 因此荧光强度越弱, 说明存活的肿瘤细胞越多。且经过flow jo拟合可以看出, 加入CpG刺激的BMDC疫苗后, T细胞出现多个增殖峰; 如果加入CpG和肿瘤抗原联合刺激的BMDC疫苗, 则会进一步刺激T细胞增殖, 分裂指数明显增加。此外, 为防止过度免疫而导致自身免疫紊乱, 这一部分细化了BMDC的加入量, 寻找BMDC疫苗的最低有效剂量。随着所加入BMDC疫苗的增多, T细胞荧光强度逐渐减弱, 说明BMDC疫苗可促进T细胞增殖。随后用CCK8法观测T细胞增殖率, 图 3C显示, 随着BMDC疫苗加入量的增多, T细胞的增殖率也保持增长。同样的, CpG和肿瘤抗原联合刺激的BMDC疫苗促进T细胞增殖的能力更强。

3 致敏DC疫苗明显提高CTL杀伤黑色素瘤细胞B16的活性

考察BMDC疫苗体外诱导出的CTL对肿瘤细胞的抑制作用。RPMI 1640培养液培养DC所获得的未成熟BMDC诱导的T细胞, 对靶细胞B16无明显杀伤作用; CpG ODN和肿瘤抗原致敏的BMDC疫苗所诱导的CTL, 对靶细胞B16产生杀伤作用。如图 4A所示, 显微镜下可见细胞形态变化, 出现明显皱缩, CFSE荧光较强说明CTL抑制了B16细胞的增殖。图 4B的流式结果也体现CTL诱导了靶细胞的凋亡, Q2双染区域为晚期凋亡的肿瘤细胞。可见, BMDC疫苗成功诱导出了杀伤性T细胞。

4 BMDC疫苗对荷黑色素瘤小鼠肿瘤生长的作用

为探究融合BMDC疫苗的抗肿瘤效果, 本研究选择在C57BL/6雄性小鼠体内构建黑色素瘤模型。接种后第7天, 小鼠肿瘤平均直径达到100 mm³时给予第1次治疗。在第7、14、21天分别测定小鼠瘤体积并绘制曲线。于接种瘤细胞后第21天, 安乐死小鼠, 剥取肿瘤并称重, 如图 5所示, BMDC疫苗组平均瘤重及平均体积均显著小于PBS组(P < 0.05)。

5 BMDC疫苗对小鼠肿瘤发生的预防作用

对小鼠进行BMDC疫苗免疫两次后, 末次免疫的第3周, 将B16黑色素瘤细胞悬液接种于小鼠皮下, 并进行观测。21天后, 安乐死小鼠并对肿瘤质量和抑制效率进行分析。预防实验的结果表明, BMDC疫苗免疫小鼠后, 肿瘤发生和生长明显迟缓。到实验终点时, 小鼠所生长的肿瘤与PBS相比, 无论体积和质量都明显减小(P < 0.05), 说明BMDC疫苗使小鼠产生了特异性免疫记忆(图 6)。

讨论

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黑色素瘤是来源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤, 易发生局部和远处转移。随着免疫治疗的研究不断深入, 近年来发现黑色素瘤在所有实体瘤中对免疫治疗最为敏感^{[12, 13]}, 然而免疫治疗不应答及耐药等问题也亟待解决^[14]。因此, 进一步探索黑色素瘤发生发展, 寻求新的免疫疗法成为当前研究热点。

目前, 免疫相关细胞作为癌症疫苗的种类只有DC获批。DC是固有免疫和适应性免疫过程中的联系节点, 是目前已知的体内功能最强的APCs^[15], 实体瘤内浸润的DC数量多有利于患者预后, 但肿瘤患者体内DC的活性受到抑制。因此, 通过激活DC来对抗肿瘤免疫逃逸, 将DC疫苗应用于黑色素瘤的治疗正成为一种潜在的有效方案。

DC疫苗可以由特异性肿瘤相关抗原或全肿瘤抗原致敏, 也可由组织相容性复合体(MHC) 多肽分子和肿瘤抗原蛋白致敏。本研究通过反复冻融肿瘤细胞获得肿瘤细胞的完全抗原来致敏DC。为进一步增强肿瘤抗原致敏的DC疫苗的免疫功能, 选择自身无免疫原性CpG ODN为疫苗佐剂共同刺激DC。CpG ODN作为一种病原相关分子模式, 与TLR9受体结合, 激活TLR/IL-IR通路发挥作用^[16]。两者共同发挥作用, 增强APCs的捕获能力和效应细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力, 从而使得患者免疫系统能够直接杀伤肿瘤细胞, 以及具备清除潜伏转移病灶的作用。不但可以用于黑色素瘤的直接治疗, 还可以在进行黑色素瘤手术切除时, 同时制备个性化的肿瘤疫苗, 预防术后转移和复发。

实验结果显示, CpG ODN联合肿瘤抗原致敏DC组能大大促进DC成熟, 使DC表面CD11c和CD86的表达率明显升高, CD86能提供T细胞活化的共刺激信号。体外实验中, 致敏DC疫苗能提高T淋巴细胞增殖能力(P < 0.05), 活化的CTL对靶细胞B16产生杀伤作用。在体内研究中, 实验终点时CpG ODN和肿瘤抗原联合致敏的BMDC疫苗治疗组的荷瘤鼠平均瘤重和平均体积均显著低于PBS对照组; 同时预防实验提示BMDC疫苗可在小鼠体内产生长期特异性抗肿瘤免疫记忆细胞, 清除新生肿瘤细胞, 对肿瘤的发生有一定的预防效果。可能的机制包括: CpG ODN和肿瘤抗原诱导DC成熟, 随后成熟的DC高表达MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子和CD80/CD86等共刺激分子, 诱导T淋巴细胞增殖和活化, 产生大量效应T细胞, 随后启动效应T细胞迁移至肿瘤部位并保持效应T细胞在肿瘤部位的长期存在。同时CpG ODN还可以抑制DC的凋亡, 延长DC的生存期^[9], 从而逆转肿瘤微环境DC数量减少、功能受抑制的现状^[17]。

由于免疫相关细胞在体外和体内环境中存在一定的功能差异, 本课题组下一步将继续深入探究DC疫苗的应用, 如利用药剂学手段直接将DC疫苗运输到体内靶部位, 或是将DC疫苗和免疫检查点抑制剂联合应用, 结合我国患者肢端、黏膜来源黑色素瘤更为常见的特质, 获取更加完善的研究结果, 为建立更有效治疗黑色素瘤的符合中国患者特征的临床方法提供有效、合理的依据。

作者贡献: 曾佳昕、张文渊负责完成相关实验研究以及数据采集与处理分析工作; 刘二刚和刘凌云负责完成撰写论文工作; 黄永焯和王慧媛负责对本课题实验设计思路进行指导与修改论文工作。所有作者批阅并准许了最终稿件。

利益冲突: 所有作者均声明本论文与其他人或机构无任何利益冲突。

基金

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重点研发计划政府间国际科技创新合作/港澳台科技创新合作重点专项项目(2021YFE0103100)
广州市科技计划项目(201707010319)
上海市科委一带一路项目(18430740800)

参考文献

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文献

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2022年第57卷第2期

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174

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-0760

接收时间：2021-05-18
首发时间：2025-12-22
出版时间：2022-02-12

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出版历史

收稿日期：2021-05-18
修回日期：2021-07-02

基金

重点研发计划政府间国际科技创新合作/港澳台科技创新合作重点专项项目(2021YFE0103100)

广州市科技计划项目(201707010319)

上海市科委一带一路项目(18430740800)

作者信息

1.广州中医药大学第一附属医院, 广东广州 510405

2.中国科学院上海药物研究所, 上海 201203

3.中国科学院药物创新研究院中山研究院, 广东中山 528437

4.广州中医药大学基础医学院, 广东广州 510006

通讯作者:

*刘二刚, Tel: 13501639275, E-mail: liuergang@zidd.ac.cn;

王慧媛, Tel: 13661835307, E-mail: wanghuiyuan@simm.ac.cn

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2021-0760

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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