药学学报

Gene	Forward sequence (5'-3')	Reverse sequence (5'-3')
ASC	CTCAAGAAGTTCAAGCTGAAGC	TAGGTCTCCAGGTAGAAGCTG
NLRP3	TGTCGGGAGGTGAGCCTTGTG	GATCTTGTGGATGGGTGGGTTTGG
Caspase-1	CACACCGCCCAGAGCACAAG	TCCCACAAATGCCTTCCCGAATAC
IL-1β	GCCAGTGAAATGATGGCTTATT	AGGAGCACTTCATCTGTTTAGG
GAPDH	GGCAAATTCAACGGCACAGT	AGATGGTGATGGGCTTCCC

Gene	Forward sequence (5'-3')	Reverse sequence (5'-3')
ASC	CTCAAGAAGTTCAAGCTGAAGC	TAGGTCTCCAGGTAGAAGCTG
NLRP3	TGTCGGGAGGTGAGCCTTGTG	GATCTTGTGGATGGGTGGGTTTGG
Caspase-1	CACACCGCCCAGAGCACAAG	TCCCACAAATGCCTTCCCGAATAC
IL-1β	GCCAGTGAAATGATGGCTTATT	AGGAGCACTTCATCTGTTTAGG
GAPDH	GGCAAATTCAACGGCACAGT	AGATGGTGATGGGCTTCCC

基于复合细胞模型的顺式和反式二苯乙烯苷特异质肝损伤评价

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潘韵铮 , 李庆菊 , 张琦 , 蒋宝平 , 张良 , 许立 ^*

药学学报 | 研究论文 2021,56(3): 808-815

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药学学报 | 研究论文 2021, 56(3): 808-815

基于复合细胞模型的顺式和反式二苯乙烯苷特异质肝损伤评价

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潘韵铮, 李庆菊, 张琦, 蒋宝平, 张良, 许立^*

作者信息

南京中医药大学药学院, 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室, 江苏南京 210023

通讯作者:

*许立, Tel: 13851572203, E-mail: xuli64@163.com

The compound cell model-based evaluation for idiosyncratic liver injury of Cis-SG and Trans-SG

Yun-zheng PAN, Qing-ju LI, Qi ZHANG, Bao-ping JIANG, Liang ZHANG, Li XU^*

Affiliations

Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

出版时间: 2021-03-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-1741

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摘要

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本研究从免疫炎症角度建立一种体外评价特异质型药物性肝损伤（idiosyncratic drug-induced liver injury，IDILI）的复合细胞模型，并应用此模型对顺式二苯乙烯苷（2，3，5，4'-tetrahydroxy-cis-stilbene-2-O-β-glucoside，Cis-SG）和反式二苯乙烯苷（2，3，5，4'-tetrahydroxy-trans-stilbene-2-O-β-glucoside，Trans-SG）的IDILI风险进行评价。CellTiter-Glo^® 3D Cell Viability Assay法测定Cis-SG和Trans-SG对三维（three-dimension，3D）培养下HepG2细胞活力的影响；MTT法测定Cis-SG和Trans-SG对THP-1巨噬细胞活力的影响，确定低、中、高给药剂量。分别给予THP-1巨噬细胞1、5和25 μmol·L^-1的Cis-SG和Trans-SG或其经3D HepG2细胞孵育的上清液，酶联免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测THP-1巨噬细胞上清液中白细胞介素（interleukin，IL）-1β的水平；免疫印迹（Western blot）法和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）分别检测THP-1巨噬细胞中凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）和IL-1β的表达。结果显示，1、5和25 μmol·L^-1的Cis-SG和Trans-SG对THP-1巨噬细胞分泌IL-1β的水平无明显影响，而1、5和25 μmol·L^-1的Cis-SG和25 μmol·L^-1的Trans-SG经肝细胞孵育后的上清液能显著提高THP-1巨噬细胞分泌IL-1β的水平，并能明显提高ASC、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白和mRNA的表达。综上，本研究建立的体外IDILI复合细胞评价模型在测试Cis-SG和Trans-SG上成功应用，此模型有助于在体外初步评价和筛选具有IDILI风险的药物，为药物的特异质肝毒性预测与解决提供方法。

关键词

特异质型药物性肝损伤 / 何首乌 / 二苯乙烯苷 / NLRP3炎症小体 / 评价模型

Abstract

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In this study, a composite cell model for evaluation of idiosyncratic drug-induced liver injury (IDILI) was established in vitro from the perspective of immune inflammation. And this model was used to evaluate the risk of IDILI for 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxy-cis-stilbene-2-O-β-glucoside (Cis-SG) and 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxy-trans-stilbene-2-O-β-glucoside (Trans-SG). To determine the low, medium, and high dosage of Cis-SG and Trans-SG, CellTiter-Glo^® 3D Cell Viability Assay was used to detect the effects of Cis-SG and Trans-SG on cell viability of HepG2 cells in three dimensional (3D) culture, and MTT assay was used to detect the effects of Cis-SG and Trans-SG on cell viability of THP-1 derived macrophages. THP-1 derived macrophages were incubated by Cis-SG and Trans-SG directly or supernatants from HepG2 cells incubated with them. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the levels of interleukin-1β (IL-1β) in the supernatants of the THP-1 derived macrophages. Western blot and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to determine the expression of apoptosis-associated speck-like protein (ASC), Nod-like receptor protein 3 (NLRP3), cysteinyl aspartate specific proteinase-1 (caspase-1), and IL-1β in THP-1 derived macrophages. The results showed that there was no effect on the secretion of IL-1β in THP-1 derived macrophages incubated by Cis-SG and Trans-SG directly. However, the secretion of IL-1β, the protein and mRNA expression of ASC, NLRP3, caspase-1, and IL-1β significantly increased in THP-1 derived macrophages incubated by supernatants from HepG2 cells incubated with 1, 5, and 25 μmol·L^-1 Cis-SG or 25 μmol·L^-1 Trans-SG. In summary, the composite cell model for evaluation of IDILI established in vitro has been successfully applied in testing Cis-SG and Trans-SG. This composite cell model is helpful to evaluate and screen drugs with IDILI risk in vitro preliminarily, which provides methods for predicting and solving the idiosyncratic liver toxicity of drugs.

Key words

idiosyncratic drug-induced liver injury / Polygonum multiflorum Thunb. / stibene glucoside / NLRP3 inflammasome / evaluation model

引用本文

潘韵铮, 李庆菊, 张琦, 蒋宝平, 张良, 许立. 基于复合细胞模型的顺式和反式二苯乙烯苷特异质肝损伤评价. 药学学报, 2021 , 56 (3) : 808 -815 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-1741

Yun-zheng PAN, Qing-ju LI, Qi ZHANG, Bao-ping JIANG, Liang ZHANG, Li XU. The compound cell model-based evaluation for idiosyncratic liver injury of Cis-SG and Trans-SG[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2021 , 56 (3) : 808 -815 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-1741

正文

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特异质型药物性肝损伤(idiosyncratic drug-induced liver injury, IDILI) 是一种仅发生在少数易感人群中的药物不良反应, 它可能与患者的性别、年龄、基因和基础疾病等存在某种关系, 具有发病率低、难以预测和无明显剂量依赖性等特点^[1]。虽然IDILI的发生机制尚不明确, 但目前研究已经从代谢和免疫角度提出了一些机制假说, 主要包括肝脏代谢功能障碍假说、炎症应激假说、半抗原假说、危险因子假说、免疫稳态失衡假说和基因多态性假说^[2]。越来越多的证据表明, IDILI的发生是由免疫介导的, 而强烈的免疫反应仅靠T细胞受体(T cell receptor, TCR) 介导的MHC (major histocompatibility complex, MHC)-肽段抗原识别通路很难诱发, 其需要免疫系统进一步识别到危险因子介导的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APCs) 活化信号通路^[3]。APCs活化的常见机制是胞内炎症小体的激活。Nod样受体蛋白3 (nod-like receptor protein 3, NLRP3) 炎症小体作为固有免疫系统的重要组成部分, 是由胞内固有免疫受体NLRP3、凋亡相关点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC) 和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1) 组成的多蛋白复合体^[4]。目前研究发现, 卡马西平^[5]和淫羊藿^[6]等引起的IDILI与NLRP3炎症小体的活化密切相关。

何首乌为蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.) 的干燥块根, 是我国临床上常用的传统补益类中药, 具有补肝肾益精血和乌须发强筋骨的功效^[7]。然而, 近年来关于何首乌及其制剂导致肝损伤的病例报道逐渐增多^[8], 引起了广泛重视。肖小河课题组^[9]研究发现何首乌在免疫应激大鼠上可以诱导IDILI, 通过对何首乌不同提取部位的筛选与分析确定了与IDILI相关的成分是二苯乙烯苷类, 并在整体模型上进一步研究证实顺式二苯乙烯苷(2, 3, 5, 4'-tetrahydroxy-cis-stilbene-2-O-β-glucoside, Cis-SG) 能通过抑制过氧化物酶体增殖物活化受体-γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ) 诱导免疫应激介导的特异质肝损伤^[10]。反式二苯乙烯苷(2, 3, 5, 4'-tetrahydroxy-trans-stilbene-2-O-β-glucoside, Trans-SG) 不能直接诱导免疫应激介导的肝损伤, 但当机体处于过度免疫活化状态时, 会进一步促进免疫反应, 增强肝脏对Cis-SG的敏感性, 从而导致IDILI^[11]。由于IDILI较难预测且发生机制错综复杂, 目前评价IDILI风险药物仅集中在体内模型, 体外评价模型报道较少。为此, 本研究从免疫炎症角度建立一种体外评价IDILI的复合细胞模型, 并应用此模型对Cis-SG和Trans-SG (图 1) 的IDILI风险进行评价。

材料与方法

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药物与试剂 Cis-SG和Trans-SG (成都普菲德生物技术有限公司, 纯度≥ 98%); 佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA, 美国Sigma公司, 纯度≥ 99%); caspase-1抑制剂Z-VAD-FMK (ZVAD) (大连美仑生物技术有限公司, 纯度≥ 98%); DMEM高糖不完全培养基和RPMI1640不完全培养基(江苏凯基生物技术有限公司); 胎牛血清(BI公司); 0.25%胰酶细胞消化液(上海碧云天生物技术公司); CellTiter-Glo^®3D细胞活力检测试剂(美国Promega公司); 白介素1β (interleukin 1β, IL-1β) 酶联免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司); 96孔超低吸附培养板(美国Corning公司); 普通96孔、24孔和6孔细胞培养板(NEST公司); IL-1β抗体(武汉三鹰生物技术有限公司); caspase-1 p20抗体(Abclonal生物技术公司); ASC抗体和NLRP3抗体(Cell Signaling生物技术公司); ASC、NLRP3、caspase-1和IL-1β引物合成于上海生工生物技术有限公司。

主要仪器 超净工作台(苏州净化公司); CO₂培养箱(美国Thermo Scientific公司); Synergy2多功能酶标仪(美国Bioteck公司); EnSpire荧光紫外分析器(美国PerkinElmer公司); Allegra 64 R型超速冷冻离心机(美国Beckman公司); Nanodrop检测仪(美国Thermo Scientific公司); Bio-Rad电泳仪及凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司); 7500型实时定量荧光PCR仪(美国ABI公司), 倒置显微镜(德国ZEISS公司)。

细胞培养和药物配制 HepG2和THP-1细胞均购自江苏凯基生物技术公司。HepG2细胞生长在含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基中, 于37 ℃、5% CO₂普通培养箱常规培养, 每隔2天传代一次; THP-1细胞生长在含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中, 于37 ℃、5% CO₂普通培养箱常规培养, 每隔2~3天传代一次。药物配制过程在无菌条件下进行, 精密称取适量的Cis-SG和Trans-SG, 用PBS (phosphate buffer saline) 分别将其配成5 mmol·L^-1储液, 分装后置于-20 ℃冰箱保存, 实验前用完全培养基稀释到相应浓度。用细胞级DMSO分别将诱导剂PMA和抑制剂ZVAD配制成0.2和1 mg·mL^-1的母液, 分装后置于-20 ℃冰箱保存, 实验前用完全培养基稀释, PMA和ZVAD的终浓度分别为50 ng·mL^-1和10 μg·mL^-1。

MTT法检测药物对THP-1巨噬细胞存活率的影响 将THP-1细胞接种于普通96孔板(150 μL, 2×10⁴个/孔), 给予50 ng·mL^-1的PMA诱导72 h使其分化为THP-1巨噬细胞, 用PBS清洗2次, 再给予每孔150 μL完全培养基培养24 h, 弃去培养基, 每孔加入不同浓度含Cis-SG或Trans-SG的完全培养基, 对照组加入等量完全培养基, 放入细胞培养箱孵育24 h, 取出培养板每孔加入20 μL的MTT, 再于培养箱中孵育4 h, 取出培养板吸弃培养基, 每孔加入150 μL的DMSO, 振荡摇匀10 min, 使用酶标仪读取波长570 nm处的吸光度值(A₅₇₀), 计算细胞存活率= (各给药组A₅₇₀值-空白孔A₅₇₀值)/(对照组A₅₇₀值-空白孔A₅₇₀值)×100%。

CellTiter-Glo^® 3D Cell Viability Assay检测药物对3D HepG2细胞存活率的影响 将HepG2细胞悬液(100 μL, 500个细胞/孔) 与等体积不同浓度的含药培养基接种于超低吸附96孔U型板中, 静置10 min, 置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养7天, 使细胞形成3D微球结构。7天后将细胞培养板取出, 室温下静置30 min, 每孔加入100 μL的CellTiter-Glo试剂, 避光振荡5 min促使细胞完全裂解, 室温下静置25 min稳定发光信号, 取反应液于全白不透明的96孔板中, 使用荧光紫外分析器读取各孔化学发光值, 计算细胞存活率= (给药组发光值/对照组发光值)×100%。

药物与肝细胞共孵育上清液的制备 将处于对数生长期的HepG2细胞以500个细胞/孔的密度接种于底面超低吸附的96孔U型板中, 静置10 min, 每孔给予100 μL不同浓度的含Cis-SG或Trans-SG的完全培养基, 使两种药物的终浓度为1、5和25 μmol·L^-1, 对照组给予等量的DMEM完全培养基, 置于37 ℃、5% CO₂恒湿培养箱中孵育7天。7天后, 收集各组上清液, 4 ℃、2 000 r·min^-1离心10 min去除细胞碎片后备用。

ELISA法检测THP-1巨噬细胞上清液中IL-1β水平 将处于对数生长期的THP-1细胞以每孔4×10⁵个细胞的密度接种于24孔板, 给予50 ng·mL^-1的PMA诱导72 h使其贴壁分化为THP-1巨噬细胞, PBS洗1~2次, 每孔加入1 mL完全培养基孵育24 h使巨噬细胞成熟, 弃去培养基, 设置对照组、给药组和抑制剂组, 给药组分别给予1、5和25 μmol·L^-1的Cis-SG和Trans-SG经肝细胞孵育的上清液或含药培养基, 抑制剂组给予10 μg·mL^-1的ZVAD预处理后再给予25 μmol·L^-1的Cis-SG和Trans-SG经肝细胞孵育的上清液, 将细胞培养板置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育18 h, 使用ELISA试剂盒检测THP-1巨噬细胞上清液中IL-1β的水平。

Western blot法检测蛋白的表达 将处于对数生长期的THP-1细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板, 给予50 ng·mL^-1的PMA诱导72 h使其贴壁分化为THP-1巨噬细胞, 用PBS洗1~2次, 每孔加入2 mL完全培养基孵育24 h使THP-1巨噬细胞成熟, 设置对照组、给药组和抑制剂组, 给药组分别给予1、5和25 μmol·L^-1的Cis-SG和Trans-SG经肝细胞孵育的上清液, 抑制剂组给予10 μg·mL^-1的ZVAD预处理后再给予25 μmol·L^-1的Cis-SG和Trans-SG经肝细胞孵育的上清液, 将细胞培养板置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育18 h。之后提取各组细胞裂解物总蛋白, 用Thermo Scientific Nanodrop检测仪测定蛋白浓度, 用PBS将各组蛋白稀释到同一水平并加入1/4体积的上样缓冲液。每孔加入6 μL蛋白样本进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 将凝胶中充分分离的蛋白转移至活化后的PVDF (polyvinylidene fluoride) 膜上, 室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h并用TBST (tris-buffered saline tween-20) 溶液洗3次, 每次10 min, 之后分别加入ASC、NLRP3、caspase-1 p20、IL-1β和β-actin的一抗溶液于4 ℃孵育过夜, 次日用TBST溶液洗涤后加入带有辣根过氧化物酶标记的二抗于摇床上孵育2 h, TBST溶液洗膜3次, 加入化学发光试剂并用Bio-Rad凝胶成像仪显影。以β-actin为内参, 使用Image Lab软件对蛋白条带进行半定量分析。

实时荧光定量PCR检测基因的表达 实验分组及处理方法同上, 采用Trizol法提取THP-1巨噬细胞总RNA, 用Thermo Scientific Nanodrop检测仪测定RNA纯度和含量并用DEPC (diethyl pyrocarbonate) 水将其稀释到同一浓度水平, 按照逆转录试剂盒使用说明将RNA逆转录为cDNA。取各组cDNA上机进行实时荧光定量PCR检测, 反应程序为预处理95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s → 60 ℃ 1 min进行40个循环数。以GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 为内参, 采用2^-ΔΔ^C^t法测定ASC、NLRP3、caspase-1和IL-1β相对基因表达情况。具体引物序列见表 1。

统计学分析 采用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计学分析, 所有结果均用x±s表示, 对两组数据之间比较采用t检验, 对多组数据采用单因素方差分析, P < 0.05被认为差异具有统计学意义。

结果

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1 普通二维培养和三维类器官培养的HepG2细胞形态观察

采用液滴重叠法构建类器官3D培养的HepG2细胞^[12], 将HepG2细胞以每孔500个细胞的密度接种于超低吸附的96板中。结果显示(图 2), 培养1天后, 细胞开始聚团生长(图 2B); 培养3天后, 细胞开始形成3D微球结构(图 2C); 培养5天后, 微球直径变大(图 2D); 培养7天后, 形成致密的3D微球结构(图 2E)。普通2D培养的HepG2细胞呈多边不规则形(图 2A)。

2 Cis-SG和Trans-SG对THP-1巨噬细胞和3D HepG2细胞活力的影响

MTT法测定250、500、1 000、2 000和4 000 μmol·L^-1的Cis-SG和Trans-SG对THP-1巨噬细胞活力的影响。Cis-SG在0~1 000 μmol·L^-1剂量范围内对于THP-1巨噬细胞活力无明显影响, Trans-SG在0~500 μmol·L^-1剂量范围内对于THP-1巨噬细胞活力无明显影响(图 3A、B); CellTiter-Glo ^® 3D细胞活力试剂测定1、2、5、10、25、50、100和200 μmol·L^-1的Cis-SG和Trans-SG对3D培养的HepG2细胞活力的影响。Cis-SG和Trans-SG在0~50 μmol·L^-1范围内对于3D培养的HepG2细胞活力无明显影响(图 3C、D)。综合细胞存活率的测定和显微镜下对于细胞形态的观察, 本实验选择1、5、25 μmol·L^-1作为Cis-SG和Trans-SG的低、中、高给药剂量。

3 Cis-SG和Trans-SG及其经肝细胞孵育的上清液对THP-1巨噬细胞分泌IL-1β的影响

ELISA实验结果表明, 与对照组相比, 低、中、高剂量的Cis-SG和Trans-SG对THP-1巨噬细胞分泌的IL-1β水平均无明显影响(图 4A、B)。低、中、高剂量的Cis-SG经肝细胞孵育的上清液均使THP-1巨噬细胞分泌的IL-1β水平显著升高; 给予低、中、高剂量的Trans-SG经肝细胞孵育的上清液后, 仅高剂量组THP-1巨噬细胞分泌的IL-1β水平显著升高, 低、中剂量组巨噬细胞分泌的IL-1β水平与对照组相比无明显差异(图 4C、D)。为了排除肝细胞上清液带来的干扰, 进一步验证IL-1β是由THP-1巨噬细胞分泌的, 在给予高剂量的Cis-SG和Trans-SG经肝细胞孵育的上清液之前用caspase-1抑制剂ZVAD预处理THP-1巨噬细胞, 结果其分泌的IL-1β水平与高剂量组相比显著下降。

4 Cis-SG和Trans-SG经肝细胞孵育的上清液对THP-1巨噬细胞ASC、NLRP3、caspase-1 p20和IL-1β蛋白表达的影响

Western blot实验结果表明, 与对照组相比, 给予低、中、高剂量的Cis-SG经肝细胞孵育的上清液后, THP-1巨噬细胞中ASC、NLRP3、caspase-1 p20和IL-1β蛋白表达水平均显著升高。给予低剂量和中剂量的Trans-SG经肝细胞孵育的上清液后, THP-1巨噬细胞中ASC、NLRP3、caspase-1 p20和IL-1β蛋白表达水平无明显变化, 仅高剂量的Trans-SG经肝细胞孵育的上清液具有显著促进THP-1巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的作用。在给予高剂量的Cis-SG和Trans-SG经肝细胞孵育的上清液前用caspase-1抑制剂ZVAD预处理THP-1巨噬细胞, 其ASC、NLRP3、caspase-1 p20和IL-1β蛋白表达水平均不同程度的降低(图 5)。

5 Cis-SG和Trans-SG经肝细胞孵育的上清液对THP-1巨噬细胞ASC、NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA表达的影响

RT-PCR实验结果表明, 与对照组相比, 给予低、中、高剂量的Cis-SG经肝细胞孵育的上清液后, THP-1巨噬细胞中ASC、NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA的表达水平均显著提高。给予Trans-SG经肝细胞孵育的上清液后, 仅高剂量组的THP-1巨噬细胞中ASC、NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA表达水平显著提高, 低、中剂量组无明显变化。给予caspase-1抑制剂ZVAD预处理后, THP-1巨噬细胞中ASC、NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA表达水平均不同程度的降低(图 6)。这与Western blot实验结果相互印证。

讨论

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IDILI是一种罕见且潜在的严重药物不良反应。近年来, 不少已经获得批准的药物因IDILI从市场上撤回或受到“黑框”警告, 这不仅提高了制药企业研发新药的成本, 还增加了临床用药的风险^[13]。目前研究人员基于IDILI发生机制的假说尝试建立了一些动物评价模型, 主要包括炎症应激模型和免疫耐受抑制模型, 它们在评价IDILI风险药物上取得了一定进展^{[14, 15]}。然而由于缺乏对IDILI发生机制的全面了解, 使用动物评价模型仍然具有一定挑战性^[16]。因此, 深入了解IDILI的发生机制, 建立高效、准确的IDILI体外评价模型显得尤为重要。

在IDILI发生机制中占主导地位的是半抗原和危险因子假说, 前者认为一般药物单独作用不会诱导强烈的免疫反应, 需要与细胞内源性蛋白结合形成半抗原; 后者认为由APCs提供的共刺激分子介导的第二信号是免疫反应的必要条件^[17]。因此, 药物的活性代谢产物可能与内源性蛋白结合导致细胞损伤, 进而产生激活炎症小体的危险信号^[18]。经典的NLRP3炎症小体激活过程是由启动和活化两个阶段共同完成的^[19]。在启动阶段, 损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs) 或病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) 作为危险因子通过Toll样受体(toll like receptor, TLR) 激活核转录因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB), 进而介导pro-IL-1β和pro-IL-18的产生^{[20, 21]}; 活化阶段通常由ATP、成孔毒素或颗粒物等引起, 介导NLRP3/ASC/pro-caspsae-1蛋白复合体的组装, 促使pro-caspase-1自剪切成活化的caspase-1, 进而剪切pro-IL-1β和pro-IL-18并分泌成熟的IL-1β和IL-18到细胞外^[22-24]。

目前研究表明, NLRP3炎症小体的过度激活可能是导致某些患者肝脏疾病的免疫应答的重要机制^{[25, 26]}, 一些具有IDILI风险的药物可以诱导肝细胞释放DAMPs, 从而激活THP-1巨噬细胞NLRP3炎性小体^{[27, 28]}。因此, 本研究试图从免疫炎症角度去建立一种体外评价IDILI药物的复合细胞模型, 即用药物与类器官3D培养的HepG2细胞共孵育后的上清液来刺激THP-1巨噬细胞, 通过THP-1巨噬细胞NLRP3炎症小体的激活情况来评价药物潜在的IDILI风险。本课题组在预实验中使用能够诱导IDILI的阳性药物奈韦拉平对此复合模型进行了测试, 初步验证了其可靠性。在此, 作者应用这一复合细胞模型对何首乌中两种互为光学异构体的单体成分Cis-SG和Trans-SG的IDILI风险进行了评价。由于关于何首乌诱发的特异质肝损伤均是在正常剂量下发现的^[29], 因此选择了Cis-SG和Trans-SG对细胞存活率无影响的剂量进行实验。结果发现, Cis-SG和Trans-SG直接作用于THP-1巨噬细胞均不能激活NLRP3炎症小体, 而经过3D培养的HepG2细胞孵育后, 1、5、25 μmol·L^-1 的Cis-SG和25 μmol·L^-1 的Trans-SG均具有一定的激活THP-1巨噬细胞NLRP3炎症小体的作用。并且在低、中剂量下, 能够诱导IDILI的Cis-SG经肝细胞孵育后即可产生较强的促炎作用, 而不能诱导IDILI的Trans-SG经肝细胞孵育后则无明显促炎作用。结果表明Cis-SG和Trans-SG经过肝细胞孵育后可能形成了活性代谢产物, 这种活性代谢产物可能与内源性蛋白结合或直接引起肝细胞释放DAMPs, 而DAMPs可以刺激THP-1巨噬细胞引起NLRP3炎症小体的激活, 进而导致促炎因子IL-1β的释放。另外, 这也提示NLRP3炎症小体的活化可能是Cis-SG诱导IDILI的一种机制。但本实验对Cis-SG和Trans-SG经肝细胞孵育的上清液未做进一步研究, 后续将从代谢组学角度探究Cis-SG和Trans-SG在肝细胞代谢中的差异, 寻找可能导致促炎作用的代谢途径及相关代谢酶。

综上, 本研究建立的体外IDILI复合细胞评价模型在测试Cis-SG和Trans-SG上成功应用, 利用3D培养的HepG2细胞与THP-1巨噬细胞相结合是测试药物激活炎症小体能力的便捷方法, 这可能有助于筛选具有IDILI风险的药物, 为药物的特异质肝毒性预测与解决提供方法。

作者贡献: 潘韵铮负责整个实验的设计、操作及论文的撰写; 李庆菊、张琦和蒋宝平参与了数据分析及文献检索; 张良和许立负责论文的指导及审阅。

利益冲突: 所有作者均声明不存在任何利益冲突。

基金

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江苏省中药药效与安全性评价重点实验室资助项目(JKLPSE201810)
江苏省高校中药学优势学科建设工程资助项目(PAPD)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Fontana

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https://doi.org/10.1053/j.gastro.2013.12.032

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Cho

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2021年第56卷第3期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-1741

接收时间：2020-11-17
首发时间：2025-12-18
出版时间：2021-03-12

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作者

出版历史

收稿日期：2020-11-17
修回日期：2020-12-30

基金

江苏省中药药效与安全性评价重点实验室资助项目(JKLPSE201810)

江苏省高校中药学优势学科建设工程资助项目(PAPD)

作者信息

南京中医药大学药学院, 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室, 江苏南京 210023

通讯作者:

*许立, Tel: 13851572203, E-mail: xuli64@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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