药学学报

Sample number	Description	FPKM
1	Low oil	15.599 053
2	High oil	42.951 454

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薏苡3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆和生物信息学分析

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魏小艳 ¹^,² , 李勇 ² , 郭娟 ² , 王雅南 ^*^,² , 黄璐琦 ^*^,¹^,²

药学学报 | 研究论文 2021,56(2): 610-617

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药学学报 | 研究论文 2021, 56(2): 610-617

薏苡3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆和生物信息学分析

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魏小艳¹^,², 李勇², 郭娟², 王雅南^*^,², 黄璐琦^*^,¹^,²

作者信息

1.江西中医药大学院士工作站, 江西南昌 330004

2.中国中医科学院中药资源中心, 道地药材国家重点实验室培育基地, 北京 100700

通讯作者:

*王雅南, Tel: 86-10-64087469, E-mail: wyn19870127@126.com

黄璐琦, Tel: 86-10-84044340, E-mail: huangluqi01@126.com

Cloning and bioinformatic analysis of the 3-ketoacyl-CoA synthase gene in Coix lacryma-jobi L.

Xiao-yan WEI¹^,², Yong LI², Juan GUO², Ya-nan WANG^*^,², Lu-qi HUANG^*^,¹^,²

Affiliations

1. Academician Workstation, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

2. State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

出版时间: 2021-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-1407

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摘要

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3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase, KCS) 基因是调控长链脂肪酸生物合成过程中的关键基因, 在薏苡的生长发育过程中起着重要的调控作用。本文以薏苡(Coix lacryma-jobi L.) 作为实验材料, 根据转录组测序数据, 从薏苡的cDNA中克隆出KCS基因, 并对其进行生物信息学分析。结果表明, 薏苡KCS基因的cDNA全长序列为1 548 bp, 编码515个氨基酸, 生物信息学预测结果显示该基因编码蛋白质为碱性亲水不稳定蛋白, 分子质量为58 608.12 Da, 等电点为9.20, 含有2个跨膜螺旋结构域, 不含信号肽剪切位点, 亚细胞定位主要在质体膜。多序列比对和进化树分析结果显示薏苡KCS与玉米、水稻、节节麦、高粱和小米等单子叶植物的同种基因具有3个相同的保守位点, 而且亲缘关系更近, 由此证明该基因在这些同科植物间的进化是保守的。此外, 基因的表达分析结果显示KCS基因在不同油脂含量的薏苡资源中有明显的差异变化。本实验对KCS基因的克隆及其结构、性质等的研究有利于深入研究该蛋白在脂肪酸合成过程中的调控机制。

关键词

薏苡 / 3-酮酯酰-CoA合酶 / 基因克隆 / 生物信息学分析

Abstract

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As a key gene in the regulation of long-chain fatty acid biosynthesis, 3-ketoacyl-CoA synthase (KCS) plays an important role in the growth and development of Coix lacryma-jobi L. In this study, the KCS gene was cloned from cDNA of Coix lachryma-Jobi L. and bioinformatics analysis was performed. Results showed that the full length KCS gene was 1 548 bp encoding 515 amino acids. Bioinformatics analysis indicated that the gene encoded a 58 608.12 Da protein with an isoelectric point of 9.20 containing two transmembrane helical structure domains and lacking a signal peptide, with a likely subcellular localization in main plastid membranes. The results of multiple sequence comparisons and evolutionary tree analysis revealed that KCS had three identical conserved sequences and was closely related to KCS from monocotyledons such as Sorghum bicolor, Zea mays, Setaria italica, Panicum miliaceum, Oryza brachyantha, Hordeum vulgare, Aegilops tauschii subsp. Tauschii. We speculated that the evolution of the gene was similar among these plants of the same family. In addition, gene expression analysis showed that the KCS gene was significantly different in Coix lacryma-jobi L. isolates having different lipid content. This work will facilitate further study of the regulatory mechanism of this enzyme in fatty acid synthesis.

Key words

Coix lacryma-jobi L. / 3-ketoacyl-CoA synthase / gene cloning / bioinformatics analysis

引用本文

魏小艳, 李勇, 郭娟, 王雅南, 黄璐琦. 薏苡3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆和生物信息学分析. 药学学报, 2021 , 56 (2) : 610 -617 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-1407

Xiao-yan WEI, Yong LI, Juan GUO, Ya-nan WANG, Lu-qi HUANG. Cloning and bioinformatic analysis of the 3-ketoacyl-CoA synthase gene in Coix lacryma-jobi L.[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2021 , 56 (2) : 610 -617 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-1407

正文

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薏苡(Coix lacryma-jobi L.) 俗称薏米、薏苡仁等^[1], 为禾本科蜀黍族薏苡属一年生或多年生草本植物^{[2, 3]}, 在贵州、广西、福建、安徽、四川等地均有种植^[4], 是我国传统的药食和谷物资源, 被称为“禾本科植物之王”和“生命健康之禾”^{[5, 6]}。薏苡中含有多糖、油脂、蛋白质以及维生素等多种活性成分^[7], 营养价值和药用价值极高, 被广泛地应用于医药、食品和化妆品等领域^[8], 其油脂类提取物被证实具有多种生物功能特性, 主要包括抗肿瘤^{[9, 10]}、抗炎消肿^[11]、镇痛止血^[12]、抑菌^[13]以及抑制酪氨酸酶^{[14, 15]}等药理活性。

薏苡仁油脂中含有丰富的脂肪酸, 其中超长链脂肪酸可以保护薏苡受到非生物胁迫和生物胁迫作用, 但是近年来环境气候等因素的影响导致薏苡仁的质量参差不齐, 因此研究超长链脂肪酸的生物合成过程对提高其含量具有重要意义。超长链脂肪酸的延长过程通常是在内质网中以叶绿体内产生的16碳或18碳的脂肪酸为底物, 通过CoA延长酶复合体进行碳链的延伸而合成的^[16], 这个延长过程受到4种复合体酶的催化和调控, 包括3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase, KCS)、3-酮酯酰-CoA还原酶(3-ketoacyl-CoA reductase, KCR)、3-羟酯酰-CoA脱水酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrase, HCD) 和羟酯酰-CoA还原酶(enoyl-CoA reductase, ECR), 其中3-酮酯酰-CoA合酶(KCS) 在油脂的生物合成过程中起着极其重要的调控作用, 是控制超长链脂肪酸合成途径的关键酶基因^{[17, 18]}。目前, 已有大量关于3-酮酯酰-CoA合酶的研究报道, 其中从油菜(B. napus cv.)^[19]、辣椒(Capsicum annuum L.)^[20]、蒜头果(Malania oleifera)^[21]、刺齿报春苣苔(Primulina spinulosa)^[22]、滇牡丹(Paeonia delavayi)^[23]等植物中均克隆分离并研究了KCS基因, 并且脂肪酸合成通路中的其他3种脂肪酰-CoA延长酶也已有相关报道^[24-26], 但尚未见薏苡脂肪酸合成通路关键酶基因的克隆及生物信息学分析。

本实验以薏苡作为材料, 基于转录组测序数据获得薏苡3-酮酯酰-CoA合酶基因(KCS) 序列, 从薏苡中克隆KCS基因并通过生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质、跨膜结构域、信号肽、蛋白质结构及系统进化树等方面进行预测, 这些初步预测的结果有助于对该基因序列及其所编码蛋白的研究, 并为挖掘薏苡脂肪酸类物质生物合成途径的关键酶基因提供参考。

材料与方法

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植物实验所需薏苡材料生长于河北省安国市伊康药业有限公司的薏苡种植基地, 采集不同时期的纯种薏苡全株, 样品采集后经液氮速冻贮存于-80 ℃冰箱。

仪器和试剂 PCR扩增仪(Applied Biosystems, 美国), Vortex-genie漩涡震荡仪(Scientific Industries, 美国), 紫外凝胶成像分析仪(Gene, 中国), 低温冷冻离心机(Eppendorf, 德国), Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, 美国), 电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司, 中国); 植物RNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司), Gel Extraction Kit (OMEGA公司), TransScript^® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit和Trans T1感受态细胞(TransGen Biotech公司), Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase和DNA marker (Thermo Fisher Scientific公司), 所有引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

总RNA的提取及反转录 按照植物RNA小量提取试剂盒的操作步骤从薏苡叶中提取总RNA。使用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳并结合分光光度计以检测总RNA的提取浓度及其完整性。样品检测合格后, 将1 μg总RNA、4 μL 5×TransScript^® All-in-One SuperMix for qPCR和1 μL gDNA Remover混合均匀, 用无菌水补足至20 μL, 混合均匀后42 ℃反应15 min, 85 ℃加热5 s, 产物置于冰上冷却, 待冷却后将其储存于-20 ℃冰箱。

薏苡KCS基因的克隆 通过分析转录组测序结果获得薏苡KCS基因的全长序列, 利用Primer Premier 5软件设计该基因的特异性引物KCS-F (ATGGAGACGT CGGCGCC) 和KCS-R (GAAGGTTGGCAGCGCTTGA)。以薏苡叶cDNA为模板, 再以KCS-F和KCS-R为引物使用Phusion酶扩增KCS基因, 反应程序如下; 98 ℃预变性2 min; 98 ℃变性30 s, 70 ℃ (每个循环下降1 ℃) 退火15 s, 72 ℃延伸2 min, 15个循环; 98 ℃变性30 s, 55 ℃退火15 s, 72 ℃延伸2 min, 25个循环; 72 ℃延伸10 min, 4 ℃结束反应。经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后, 回收并纯化PCR产物。将2 μL扩增产物加入1 μL (30 ng) pEASY-Blunt Zero载体中, 加入无菌水补足至5 μL, 混合均匀后室温下孵育15 min, 反应结束后, 置于冰上。将连接产物全部加至50 μL的Trans T1感受态细胞中, 轻弹均匀, 冰浴30 min; 42 ℃热激30 s后冰浴2 min。于超净台中加入500 μL预热至室温的液体LB培养基, 37 ℃、200 r·min^-1摇床中培养1 h。取50 μL菌液均匀地涂布于含有氨苄霉素的LB固体培养基上, 37 ℃过夜培养。挑选白色单菌落进行菌落PCR检测, 筛选阳性克隆送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。应用DNA-MAN 8.0软件对扩增的KCS基因序列进行对比验证。

生物信息学分析 基于KCS基因的克隆结果, 应用NCBI的ORF finder工具对薏苡的KCS基因进行蛋白翻译后, 推导出其氨基酸序列。采用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam) 分析KCS蛋白的理化性质; 应用ProtScale (http://web.expasy.org/prots-cale/) 对KCS蛋白的亲水性进行预测; 利用TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0) 进行KCS蛋白质序列跨膜结构域分析; 使用Signal P 5.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 分析KCS蛋白信号肽; PSORT (http://psort.hgc.jp/) 预测蛋白质亚细胞定位; 通过MEGA 7.0构建Neighbor-joining系统进化树^[27-29]。

结果与分析

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1 总RNA的提取及检测

使用TaKaRa的植物RNA小量提取试剂盒进行总RNA提取, RNA的琼脂糖凝胶电泳结果显示: 28S rRNA的条带亮度约为18S rRNA的两倍, A_260/280值均处于1.8~2.0之间, 由此说明总RNA提取物的完整性较好且纯度较高, 可用于后续的反转录及KCS基因的扩增实验。

2 KCS基因的克隆与序列分析

为深入研究薏苡长链脂肪酸的生物合成过程, 利用Illumina Hiseq2000平台对薏苡进行转录组测序分析, 通过分析薏苡转录组数据库获得的KCS基因片段, 依据获得的基因片段设计扩增的特异性引物, 以cDNA为模板进行高保真PCR扩增获得基因片段, 将获得的基因片段连接到克隆载体中, 转化Trans T1后进行测序比对验证, 最终获得1 548 bp的薏苡KCS基因全长cDNA序列。为进一步确定序列的正确性, 利用NCBI ORF Finder在线工具和DNA-MAN 8.0软件对获得的KCS基因序列进行序列分析, 结果表明KCS基因片段包含完整的cDNA开放阅读框, 编码515个氨基酸残基的蛋白质, 起始密码子为ATG, 终止密码子TAG (图 1)。基于获得的薏苡KCS基因片段设计插入C端蛋白标签, 并设计含有蛋白标签的上下游特异性引物, 以cDNA为模板进行克隆获得基因片段, 并将PCR产物连接到克隆载体中, 置于-80 ℃冰箱进行永久保存。

3 KCS蛋白的生物信息学分析

3.1 理化性质分析

利用ProtParam在线工具对KCS蛋白理化性质分析结果显示, 该蛋白质带正电荷的氨基酸(Arg+Lys) 总数为65, 带负电荷的氨基酸(Asp+Glu) 总数为50; 其分子式为C₂₆₂₇H₄₁₆₄N₇₂₆O₇₃₅S₂₉, 相对分子质量(MW) 为58 608.12, 理论等电点(theoretical pI) 为9.20; 蛋白的不稳定指数(instability index) 为41.83, 说明其属于不稳定性蛋白; 脂肪酸系数(aliphatic index) 为92.26, 亲水性平均系数(GRAVY) 为-0.133, 推测该蛋白为碱性亲水不稳定蛋白(pI > 7, GRAVY为负值, 图 2)。利用TMHMM Server 2.0对KCS蛋白跨膜结构进行预测, 其中1~33和99~521为胞外区, 57~75为胞内区, 34~56和76~98为跨膜结构域位置, 由此推测该蛋白为跨膜蛋白。Signal P 5.0 server预测结果如图 3所示, 图中无峰值出现, 由此可推断KCS蛋白不含信号肽, 属于非分泌蛋白(图 4)。亚细胞定位结果显示KCS定位于质体膜。

3.2 KCS的结构预测

KCS蛋白二级结构预测结果如图 5所示, 黑色字体为氨基酸序列, 彩色字体为其对应的二级结构, 其中蓝色: h代表α-螺旋(alpha helix)、绿色: t代表β-折叠(beta turn)、黄色: c代表无规则卷曲(random coil)、红色: e代表延伸链(extended strand)。预测结果表明: KCS蛋白二级结构组分中, α-螺旋(h) 占44.66%, 无规则卷曲(c) 占35.73%, 延伸链(e) 占14.56%, β-折叠(t) 占5.05%。由此可知, α-螺旋和无规则卷曲是KCS的大量结构原件, 其他两种分布于整个KCS蛋白。

3.3 KCS序列比对及结构域分析

对克隆得到的KCS基因进行序列分析, 发现其编码515个氨基酸。Blastp结果显示薏苡中KCS基因编码的氨基酸与禾本科植物的同源性比较高, 其中与Saccharum hybrid cultivar甘蔗和Zea mays玉米的同源性最高(98.06%); 与Sorghum bicolor高粱的同源性为97.87%; 与Panicum miliaceum稷的同源性为96.81%; 与Setaria italica小米的同源性为95.56%; 与Oryza brachyantha水稻的同源性为94.81%; 与Hordeum vulgare青稞的同源性为89.78%; 与Aegilops tauschii subsp. Tauschii节节麦的同源性为89.24%。利用MEGA 7.0软件中的ClusterW和DNAMAN 8.0软件进行蛋白序列的多重比对。结果如图 6显示, 将KCS基因的氨基酸序列与其他8种植物中同类基因的序列信息进行比对, 结果表明此类蛋白质N端及中间区域的保守性比较高, 且不存在基因的缺失位点, 但是C端保守性较差, 部份基因存在缺失现象, 且基因的差异也比较大。此外, 通过比较可知该蛋白具有与已报道的KCS含有KCS家族的高度保守区“FGNTSSSS”和“GSGFKCNSAVW”, “GMGCSA”为其催化区域, 隶属KCS家族蛋白, 推测其催化位点可能为半胱氨酸cys^{[21, 23, 30]}。

3.4 系统进化树的构建

为了进一步研究薏苡KCS基因在不同科属间的进化关系, 从美国国立生物技术信息中心(NCBI) 中挑选出与KCS基因编码蛋白相似性比较高的15条植物蛋白序列。通过MEGA 7.0软件中的Neighbor-Joining (NJ) 算法绘制薏苡KCS氨基酸序列的进化树。结果如图 7所示, 薏苡KCS与同为禾本科植物的甘蔗、高粱、玉米、小米、黍、水稻、青稞和节节麦8种单子叶植物聚为一大类, 亲缘关系最近, 表明其可能具有相似的功能。其他科植物聚为一大类, 其中烟草(Nicotiana tabacum) 和辣椒(Capsicum baccatum) 聚为一支; 油棕(Elaeis guineensis) 和铁皮石斛(Dendrobium catenatum) 聚为一支; 罂粟(Papaver somniferum) 和芝麻(Sesamum indicum) 聚为一支; 可可(Theobroma cacao) 单独聚为一支; 表明其与其他科属的亲缘关系较远。进化树分析显示KCS序列在不同植物间的同源性都很高, 推测其在植物间的分布比较广泛。

4 KCS基因的表达分析

KCS基因是油脂生物合成途径中的延长酶, 本课题组保存了不同油脂含量的薏苡资源的转录组测序数据, 通过对KCS基因的转录水平进行分析, 结果发现不同油脂量的KCS基因的表达量存在显著的差异(表 1), 高油脂量的KCS基因的表达水平明显高于低油脂量的表达, 且达到近3倍的差异。此外, 该基因的表达量与油脂的含量呈正相关关系, 推测其可能参与油脂的生物合成。

讨论

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薏苡作为药食同源的绿色食品之一, 不仅具有丰富的营养价值且兼具重要的药理作用, 尤其是防癌抗癌的作用, 目前以薏苡仁油为原料的康莱特注射液在临床的应用最为广泛^{[31, 32]}。研究表明, 薏苡仁油的主要成分为中性油脂和甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯等酯类化合物, 其中组成酯类化合物的脂肪酸分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸, 饱和脂肪酸包括月桂酸(十二烷酸)、肉豆蔻酸(十四烷酸)、棕榈酸(十六烷酸)、硬脂酸(十八烷酸) 等, 不饱和脂肪酸包括油酸(十八碳一烯酸)、亚油酸(十八碳二烯酸)、亚麻酸(十八碳三烯酸) 及花生四烯酸(二十碳四烯酸) 等^[33], 其中碳原子数超过20的脂肪酸被称为超长链脂肪酸, 这类脂肪酸在植物的生长过程中通过合成角质层等来防止外界的各种胁迫作用, 因此受到了国内外学者地广泛关注。

近年来, 植物中超长链脂肪酸的生物合成途径分析逐渐成为一种比较热门研究, 主要是对其合成途径的关键酶KCS基因进行了生物信息学分析及功能验证的报道, 如Damián等^[34]报道了在向日葵中, 两种KCS基因的异源表达不仅改变了脂肪酸的组成, 而且增加了超长链脂肪酸的浓度, 由此推断这两种酶有助于葵花中C20~C24脂肪酸的合成; 夏凌峰等^[35]已将禾本科植物小麦的KCS基因进行克隆与酿酒酵母表达, 结果表明小麦中该基因编码的蛋白主要参与C₂₄以上的超长链脂肪酸的合成; 张芫晨等^[36]通过考察沙棘中不同器官脂肪酸的含量差异, 报道了沙棘果肉和种子中高富集不同脂肪酸是源于KCS等基因在果肉和种子中表达差异的原因, 这对改良植物油脂组成具有重要意义。虽然油脂在多种植物中普遍存在, 但是植物中超长链脂肪酸的含量均比较低。因此通过揭示植物超长链脂肪酸生物合成途径的关键酶基因, 可以为利用基因工程等手段研究脂肪酸合成途径关键酶基因的功能及获得更多脂肪酸奠定基础。故本研究开展薏苡中超长链脂肪酸生物合成途径关键酶KCS基因的克隆及生物信息学分析。

本实验开展薏苡脂肪酸生物合成途径的关键酶KCS基因的克隆及分析。从薏苡中克隆得到3-酮酯酰-CoA合酶(KCS), 生物信息学分析结果表明: KCS基因序列为1 548 bp, 编码515个氨基酸, 分子质量为58 608.12 Da, 等电点为9.20。该基因编码蛋白质为碱性亲水不稳定蛋白, 含有2个跨膜螺旋结构域, 不含信号肽, 亚细胞定位主要在质体膜, 属于非分泌蛋白。多序列比对发现薏苡KCS基因的核苷酸序列与已报道的KCS的相似性高达98.06%, 且含有KCS蛋白家族的保守结构域“GMGCSA”“FGNTSSSS”和“GSGFKCNSAVW”。进化树分析发现薏苡的KCS基因与玉米、水稻、节节麦、高粱、小米和节节麦等同科植物的KCS基因具有较近的亲缘关系, 与其他科属的关系较远, 由此表明该基因在同科植物间具有高度一致性, 且在单子叶植物的进化过程中是高度保守的。基因的表达分析结果显示, 薏苡在不同油脂含量中的KCS基因的转录水平有所差异, 且高油脂量薏苡KCS基因的表达量是明显高于低油脂量薏苡, 将近达到3倍。由此推测KCS基因在油脂的生物合成过程中具有极其重要的作用。本研究从薏苡中克隆得到KCS基因并进行生物信息学分析, 为进一步揭示薏苡的脂肪酸生物合成途径及获得优质薏苡油脂提供一定的参考价值。

作者贡献: 魏小艳是本研究的实验设计者和实验研究的执行人; 魏小艳和李勇完成数据分析, 论文初稿的写作; 魏小艳和李勇参与实验设计, 实验结果分析; 郭娟、王雅南、黄璐琦是项目的构思者及负责人, 指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。

利益冲突: 全体作者都阅读并同意最终的文本, 声明本文不存在利益冲突。

基金

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国家自然科学基金青年基金项目(81703657)
中央本级重大增减支项目(ZZXT201702)
中央本级重大增减支项目(ZZ13-YQ-085)
中央本级重大增减支项目(20160302)
中央本级重大增减支项目(2060302)

参考文献

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文献

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排序方式：

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2021年第56卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-1407

接收时间：2020-08-26
首发时间：2025-12-18
出版时间：2021-02-12

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收稿日期：2020-08-26
修回日期：2020-09-27

基金

国家自然科学基金青年基金项目(81703657)

中央本级重大增减支项目(ZZXT201702)

中央本级重大增减支项目(ZZ13-YQ-085)

中央本级重大增减支项目(20160302)

中央本级重大增减支项目(2060302)

作者信息

1.江西中医药大学院士工作站, 江西南昌 330004

2.中国中医科学院中药资源中心, 道地药材国家重点实验室培育基地, 北京 100700

通讯作者:

*王雅南, Tel: 86-10-64087469, E-mail: wyn19870127@126.com

黄璐琦, Tel: 86-10-84044340, E-mail: huangluqi01@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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