药学学报

褪黑激素抑制心室肌细胞晚钠电流增大所诱发的心律失常

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文杰 ¹ , 刘汗峰 ² , 杨岩岩 ² , 张泽夫 ¹ , 罗岸涛 ¹ , 曹珍珍 ¹ , 马季骅 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(1): 143-151

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(1): 143-151

褪黑激素抑制心室肌细胞晚钠电流增大所诱发的心律失常

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文杰¹, 刘汗峰², 杨岩岩², 张泽夫¹, 罗岸涛¹, 曹珍珍¹, 马季骅¹^,²^,^*

作者信息

1.武汉科技大学医学院, 湖北武汉 430070

2.武汉科技大学生命科学与健康学院, 湖北武汉 430070

通讯作者:

^*马季骅, Tel: 15697188050, E-mail: mjhua@wust.edu.cn

Melatonin inhibits arrhythmias induced by increased late sodium currents in ventricular myocytes

Jie WEN¹, Han-feng LIU², Yan-yan YANG², Ze-fu ZHANG¹, An-tao LUO¹, Zhen-zhen CAO¹, Ji-hua MA¹^,²^,^*

Affiliations

1. Medical College of Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430070, China

2. College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430070, China

出版时间: 2024-01-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0601

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摘要

收起

褪黑激素(melatonin, Mel) 已有研究表明其具有心脏保护作用, 但对离子通道作用尚不清楚。本实验探究了Mel对小鼠心室肌细胞晚钠电流(late-sodium current, I_Na.L) 的抑制作用、在器官水平上的抗心律失常作用及其机制。采用膜片钳技术全细胞模式记录离子电流和动作电位(action potential, AP), 利用多通道采集分析系统同步记录小鼠心电图(electrocardiogram, ECG) 和单相动作电位(monophasic action potential, MAP)。结果显示, Mel抑制瞬时钠电流(transient-sodium current, I_Na.T) 和特异性I_Na.L开放剂2 nmol·L^-1海葵毒素Ⅱ (anemone toxins Ⅱ, ATX Ⅱ) 诱导增大的I_Na.L, 其IC₅₀值分别为686.615和7.37 μmol·L^-1, 且Mel不影响L型钙电流(L-type calcium current, I_Ca.L)、瞬时外向钾电流(transient outward current, I_to) 和AP。此外, 16 μmol·L^-1 Mel可缩短ATX Ⅱ延长的动作电位时程(action potential duration, APD), 并消除了由ATX Ⅱ诱导的早发后除极(early afterdepolarizations, EADs)。在Langendorff灌流的小鼠心脏上, 16 μmol·L^-1 Mel显著降低了室速(ventricular tachycardia, VT) 和室颤(ventricular fibrillation, VF) 的发生率。综上所述, Mel主要通过阻断I_Na.L发挥抗心律失常作用, 为Mel的临床新应用提供了重要的理论基础。本研究动物福利和实验过程均遵循武汉科技大学实验动物伦理委员会的规定(批准号: 2023130)。

关键词

褪黑激素 / 晚钠电流 / 动作电位 / 心律失常 / 膜片钳

Abstract

收起

Melatonin (Mel) has been shown to have cardioprotective effects, but its action on ion channels is unclear. In this experiment, we investigated the inhibitory effect of Mel on late sodium currents (I_Na.L) in mouse ventricular myocytes and the anti-arrhythmic effect at the organ level as well as its mechanism. The whole-cell patch clamp technique was applied to record the ionic currents and action potential (AP) in mouse ventricular myocytes while the electrocardiogram (ECG) and monophasic action potential (MAP) were recorded simultaneously in mouse hearts using a multichannel acquisition and analysis system. The results demonstrated that the half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) values of Mel on transient sodium current (I_Na.T) and specific I_Na.L opener 2 nmol·L^-1 sea anemone toxins Ⅱ (ATX Ⅱ) increased I_Na.L were 686.615 and 7.37 μmol·L^-1, respectively. Mel did not affect L-type calcium current (I_Ca.L), transient outward current (I_to), and AP. In addition, 16 μmol·L^-1 Mel shortened ATX Ⅱ-prolonged action potential duration (APD), suppressed ATX Ⅱ-induced early afterdepolarizations (EADs), and significantly reduced the incidence of ventricular tachycardia (VT) and ventricular fibrillation (VF) in Langendorff-perfused mouse hearts. In conclusion, Mel exerted its antiarrhythmic effects principally by blocking I_Na.L, thus providing a significant theoretical basis for new clinical applications of Mel. Animal welfare and experimental process are in accordance with the regulations of the Experimental Animal Ethics Committee of Wuhan University of Science and Technology (2023130).

Key words

melatonin / late sodium current / action potential / arrhythmia / patch-clamp

引用本文

文杰, 刘汗峰, 杨岩岩, 张泽夫, 罗岸涛, 曹珍珍, 马季骅. 褪黑激素抑制心室肌细胞晚钠电流增大所诱发的心律失常. 药学学报, 2024 , 59 (1) : 143 -151 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0601

Jie WEN, Han-feng LIU, Yan-yan YANG, Ze-fu ZHANG, An-tao LUO, Zhen-zhen CAO, Ji-hua MA. Melatonin inhibits arrhythmias induced by increased late sodium currents in ventricular myocytes[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (1) : 143 -151 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0601

正文

收起

近两年, 中国的心血管疾病(cardiovascular diseases, CVDs) 患病率处于持续上升阶段, 2019年农村、城市的心血管疾病分别占死亡原因的46.74%和44.26%, 由于我国人口老龄化问题日趋明显且代谢危险因素持续流行, 心血管疾病的医疗负担仍将持续增加^[1]。心血管疾病主要包括心力衰竭(heart failure, HF)、冠状动脉疾病和心律失常等, 其中心律失常是由冲动产生或心脏冲动传导不规则或两者兼而有之引起的, 恶性的室性心律失常会导致心源性猝死, 后果十分严重。室性心律失常包括从完全无症状的室性早搏或非持续性室性心动过速(ventricular tachycardia, VT)、前心律失常的症状表现、症状轻微的持续性室速到伴有血流动力学衰竭的持续VT或室颤(ventricular fibrillation, VF)^[2]。尽管近年来在射频消融和植入型心律转复除颤器等介入治疗方面取得了重大进展, 但药物干预仍然是治疗心律失常的主要手段^[3]。

目前, 更新的抗心律失常药物主要通过调节Na⁺、K⁺和Ca²⁺通道功能来发挥作用。传统的抗心律失常药物根据其对心脏动作电位的不同成分的作用进行了分类^[4]。I类药物通过阻断Na⁺通道从而降低了0期斜率和超射, 增加、减少或维持了动作电位时程(action potential duration, APD) 和有效不应期^[5]。此类代表药物有利多卡因、奎尼丁等。这些药物对钠电流具有较好的抑制作用, 并能够有效发挥抗心律失常作用。然而, 此类药物也可过度抑制瞬时钠电流(transient-sodium current, I_Na.T) 而导致心肌细胞动作电位(action potential, AP) 的0期幅度变小且上升变慢, 从而使兴奋传导速率减慢, 造成兴奋传导阻滞, 最终导致心律失常的发生。由于I类药物具有不可避免的不良反应, 目前临床上仍需要发现一种抑制晚钠(late-sodium current, I_Na.L) 效果优于I_Na.T的药物, 即新型、高选择性、安全的I_Na.L抑制剂。已有研究表明, 心肌缺血缺氧^[6]、NO增多^[7]、过氧化氢^[8]及心肌肥大和心力衰竭等多种伤害性因素均可引起心室肌细胞I_Na.L增大, 而增大的I_Na..L可造成细胞内钠超载, 随之通过反向Na⁺-Ca²⁺交换导致细胞内Ca²⁺超载, 进而引起心律失常、细胞收缩功能异常和细胞损伤。此外, 已有研究发现I_Na.L在3型长QT综合征(long QT syndrome, LQTS3) 中具有重要作用^[3], 因此阻断I_Na.L已成为药物治疗心律失常的重要新靶点。

褪黑激素(melatonin, Mel) 是松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素, 其化学名为N-乙酰-5-甲氧基色胺。已知其能从坚果、蘑菇、谷物和发芽的豆类或种子等多种天然食物中获得。目前Mel补充剂每日剂量范围为2~10 mg, 尚未有研究报道外源性Mel可造成严重不良反应, 安全性较高。由于受体分布广泛^[9], Mel可影响多种生物学过程, 包括昼夜节律、神经内分泌、心血管和免疫功能及抗炎抗肿瘤作用^{[7, 10]}。越来越多的证据表明, Mel具有心脏保护作用, 如调节细胞内钙信号, 减轻心肌缺血再灌注损伤。在某些情况下, Mel可防止心肌肥厚, 从而减轻HF的发展。Mel作为抗氧化剂可以有效抑制药物介导的心脏损伤^[11]。目前, 国内外关于Mel对小鼠心室肌细胞动作电位及离子通道作用的影响研究甚少, 本研究利用海葵毒素Ⅱ (anemone toxins Ⅱ, ATX Ⅱ) 建立细胞水平和器官水平病理模型, 在此基础上以期更加全面地了解Mel对心肌细胞电生理的作用, 并为Mel用于治疗心律失常的临床应用及有关的新型药物开发提供新的思路及理论基础。

材料与方法

收起

动物本研究中的所有动物实验均按照国家卫生研究院出版《实验动物的护理和使用指南》 (出版号: 85-23 1996年修正版) 进行, 由武汉科技大学动物实验中心所提供, 生产许可证编号为SCXK (鄂) 2020-0018, 并经武汉科技大学动物管理和使用委员会的批准, 饲养于武汉科技大学医学院心血管研究所, 实验单位使用许可证编号为SYXK (鄂) 2018-0045, 实验动物为SPF级, 采用成年雄性昆明小鼠, 体重范围为28~30 g。

小鼠心室肌细胞制备 小鼠腹腔注射肝素(180 U) 抗凝5~10 min后用氨基甲酸乙酯(0.1 mL·g^-1) 麻醉。迅速开胸后取出心脏, 置于37 ℃左右无钙台氏液中逆行插管, 固定于Langendorff灌流装置上。先用无钙台氏液灌流冲洗心脏直至无淤血, 然后用含1 mg·mL^-1 Ⅱ型胶原酶和1 mg·mL^-1牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 的无钙台氏液消化12 min左右后取下心脏, 剪下左心室并置于含有1 mg·mL^-1 BSA的KB液中用眼科镊撕碎, 一次性胶头滴管吹散细胞后用尼龙网过滤静置1 h, 待使用的细胞置于4 ℃环境中以保持活性。

全细胞膜片钳记录准备 使用EPC9膜片钳放大器(德国HEKA公司) 对单个心室肌细胞进行记录。使用微电极拉制仪(PP-100, 日本Narishige集团) 采用两步拉制法先拉制玻璃微电极。选取贴壁稳定、横纹清晰、折光指数高、无收缩迹象的单个心室肌细胞用于实验记录。通过三维显微操作(MP285, 美国Sutter公司) 控制玻璃微电极。负压吸引使尖端与细胞膜之间形成Giga-Ohm (GO) 封接, 然后使用脉冲式负压抽吸使细胞膜破裂, 从而获得串联电阻为2~5 MΩ的全细胞膜片钳模式。在电压钳设置模式下记录电流时, 需要常规补偿慢电容, 并对串联电阻进行至少60%~80%的补偿。

溶液配置

无钙台式液(mmol·L^-1) 135 NaCl、5.4 KCl、1 MgCl₂、0.33 NaH₂PO₄、10 HEPES、10 glucose (使用NaOH将pH调至7.4)。

有钙台式液(mmol·L^-1) 在无钙台式液的基础上加入1.8 CaCl₂, 其他成分不变。

细胞保存液(KB液, mmol·L^-1) 85 KOH、30 KCl、15 KH₂PO₄、6 MgSO₄、20 taurine、10 glucose、0.5 EGTA、10 HEPES、50 L-glutamic acid (使用KOH将pH调至7.4)。

AP电极内液(mmol·L^-1) 5 NaCl、30 KCl、110 K-aspartate、5 Mg-ATP、1 EGTA、10 HEPES、5 creatine phosphate、0.5 CAMP (使用KOH将pH调至7.4)。

AP细胞外液(mmol·L^-1) 145 NaCl、5.6 KCl、1.8 CaCl₂、1.2 MgCl₂、5 HEPES、10 glucose (使用NaOH将pH调至7.4)。

I_Ca.L电极内液(mmol·L^-1) 135 NaCl、5.4 CsCl、1 MgCl₂、10 glucose、0.33 NaH₂PO₄、0.3 BaCl₂、10 HEPES、1.8 CaCl₂ (使用NaOH将pH调至7.4)。

I_Ca.L细胞外液(mmol·L^-1) 135 NaCl、5.4 CsCl、1 MgCl₂、10 glucose、0.33 NaH₂PO₄、0.3 BaCl₂、10 HEPES、1.8 CaCl₂ (使用NaOH将pH调至7.4)。

I_Na.T电极内液、I_Na.L电极内液(mmol·L^-1) 3 NaCl、133 CsCl、2 MgCl₂、2 Na₂ATP、2 TEACl、2 EGTA、5 HEPES (使用CsOH将pH调至7.4)。

I_Na.T细胞外液(mmol·L^-1) 15 NaCl、1 CaCl₂、125 CsCl、1.2 MgCl₂、5 HEPES、11 glucose、1.8 CaCl₂ (使用CsOH将pH调至7.4)。

I_Na.L细胞外液(mmol·L^-1) 在I_Ca.L灌流液的基础上加入10 μmol·L^-1 nifedipine以阻断I_Ca.L, 其他成分不变。

I_to电极内液(mmol·L^-1) 20 KCl、110 K-aspartate、5 Na₂-phosphocreatine、5 Mg₂ATP、0.1 GTP、5 EGTA、10 HEPES、1 MgCl₂ (使用KOH将pH调至7.2)。

I_to细胞外液(mmol·L^-1) 137 NaCl、5.4 KCl、1.8 CaCl₂、1 MgCl₂、0.33 NaH₂PO₄、10 HEPES、10 glucose (使用NaOH将pH调至7.4)。

除此之外, 为保证实验中电流记录的准确性, 在I_to细胞外液中加入10 μmol·L^-1硝苯地平(I_Ca.L阻滞剂)、0.2 mmol·L^-1 BaCl₂ (内向整流钾电流阻滞剂)、1 μmol·L^-1阿托品(乙酰胆碱敏感性钾电流阻断剂) 以减小其他电流的参与引起的测量误差。

褪黑激素(纯度≥ 98%) 溶于乙醇, 购买自成都德思特生物技术有限公司。ATX Ⅱ和河豚毒素(tetrodotoxin, TTX) 购买自以色列Alomone公司。Ⅱ型胶原酶购买自美国Worthington Biochemical公司。CsCl和KH₂PO₄购买自美国Amresco公司。EGTA和HEPES购买自合肥白鲨生物科技有限公司。N-(2-羟乙基)-4-甲氧基苯磺酰胺磷酸盐(KN-93) 等其他药品均购买自美国Sigma-Aldrich公司。为排除溶剂影响, 本实验中的有机溶剂在细胞外液中浓度均控制在1‰以内, 未经特殊说明溶剂的药品均由“三蒸水”溶解, 药物配置至目标浓度待用。

脉冲设置 记录AP时, 在形成全细胞模式后, 需要将电压钳设置模式切换至电流钳设置模式。通过超过阈强度1.2~1.5倍、持续7 ms、频率为1 Hz的电流脉冲经Ag-AgCl电极丝连续刺激细胞以诱导AP的产生。记录I_Ca.L时, 将钳制电位保持在-40 mV。单根I_Ca.L的记录由从-40 mV至0 mV, 持续300 ms的去极化脉冲引出。电流-电压(I-V) 关系曲线中I_Ca.L的记录从-40 mV至+60 mV、以5 mV的阶跃(两次刺激之间膜电位的变化值)、持续300 ms的去极化脉冲引出。记录I_Na.T和I_Na.L时, 将钳制电位保持在-90 mV。单根I_Na.T和I_Na.L的记录分别由-90 mV至-30 mV和至-20 mV、持续300 ms的去极化脉冲引出。记录I_Na.T I-V关系曲线时, 钳制电压为-90 mV, 通过从-70 mV至+40 mV, 以5 mV为阶跃、持续2 s的去极化脉冲引出。记录I_Na.L I-V曲线关系时, 通过从-80 mV至+60 mV、以10 mV的阶跃、持续2 s的去极化脉冲引出。记录I_to时, 将钳制电位保持在-80 mV, 去极化至-40 mV, 持续100 ms, 再由-40 mV阶跃至+50 mV。

离体小鼠心电图(electrocardiogram, ECG) 和单相动作电位(monophasic action potential, MAP) 记录 将小鼠心脏取出, 置于有钙台式液中。行主动脉逆行插管固定于Langendorff灌流装置上冲洗干净, 然后将心脏置于自制心脏池中, 加入25 mL台式液后打开恒流泵(D 100B, 上海青浦泸仪器厂) 使液体循环。使用多通道信息采集分析系统(BL-420F, 成都泰盟软件有限公司) 进行ECG的记录。通过连接3个铂电极, 分别置于心尖部、右心房和主动脉根部附近以记录离体心脏ECG。连接弹簧负载铂头段电极, 将电极置于心室上方以记录MAP。本实验中的ECG和MAP记录分为两组: ATX Ⅱ组和ATX Ⅱ + Mel组, 两组均记录60 min。ATX Ⅱ组将62.5 μL浓度为2 μmol·L^-1 ATX Ⅱ加入定容的25 mL台式液中, 使终浓度为5 nmol·L^-1, 然后灌流心脏, ECG与MAP同步记录60 min。ATX Ⅱ + Mel组ECG与MAP先同步记录10 min后, 往25 mL台式液中同时加入62.5 μL浓度为2 μmol·L^-1 ATX Ⅱ和8 μL浓度为50 mmol·L^-1 Mel, 使终浓度分别为5 nmol·L^-1和16 μmol·L^-1, 将液体混匀并使液体充分灌注心脏, 然后ECG与MAP继续进行同步记录50 min。

统计学分析 通过使用Fitmaster、Excel、Origin2021软件分别对实验记录进行数据测量、整理分析和图形拟合。实验所测电流数据通过标准化(电流/电容) 处理后均用电流密度表示。两组间参数检验通过t检验进行两组间Bonferroni比较法, 多组间参数检验使用单因素方差分析(ANOVA) 进行多重比较, 实验数据以均数±标准差表示。非参数检验使用Fisher确切概率法进行比较, P < 0.05被认为差异具有统计学意义。使用Hill方程拟合浓度效应曲线

$ Y={B}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}/\left[\right(\mathrm{I}{\mathrm{C}}_{50}/D) $

ⁿ

$ ] $

, 式中Y为电流抑制率, n为Hill系数, B_max为电流最大抑制率, D为Mel浓度, IC₅₀为半数抑制浓度。

结果

收起

1 Mel对小鼠心室肌细胞I_Na.T、ATX Ⅱ诱导增大的I_Na.L的影响

在250、500、750、1 000 μmol·L^-1不同浓度Mel下, Mel使I_Na.T分别下降了12.5%、35.3%、54.1%、67.7% (图 1A) 且其对I_Na.T的抑制作用随浓度增加而增强(图 1B)。如图 1C、D所示, Mel的抑制作用呈浓度依赖性, 通过Hill方程拟合浓度-效应关系曲线计算得出I_Na.T的IC₅₀值为686.615 μmol·L^-1。用I_Na.T细胞外液灌流, I_Na.T恢复至药物干预前水平的79.5%, 这表明Mel对I_Na.T的抑制作用是可逆的(图 1E)。

在本实验中, 结果显示在2、4、8 μmol·L^-1不同浓度下, Mel使由ATX Ⅱ增大的I_Na.L减小, 且抑制作用随浓度增加而增强(图 2A), 拟合得出的I-V曲线关系图显示Mel对I_Na.L的抑制作用呈浓度依赖性(图 2B)。利用Hill方程拟合浓度-效应关系曲线计算得出I_Na.L的IC₅₀值为7.37 μmol·L^-1 (图 2C)。2、4、8、16 μmol·L^-1不同浓度的Mel使ATX Ⅱ增大的I_Na.L分别减小了10.3%、27.8%、63.6%、77.8% (图 2D)。2 μmol·L^-1 TTX可有效抑制ATX Ⅱ诱导增大的I_Na.L, 使I_Na.L的幅度降低了68.2% (图 2E、F)。16 μmol·L^-1 Mel可使ATX Ⅱ诱导增大的I_Na.L幅度降低65.6%。在用浓度为2 nmol·L^-1 ATX Ⅱ复灌后, 被Mel抑制的I_Na.L恢复至其干预前的89.8% (图 2G、H)。

综上所述, Mel对I_Na.L的IC₅₀明显低于对I_Na.T的IC₅₀, Mel作用于I_Na.T和I_Na.L的IC₅₀比值为93.16, 即表明Mel对I_Na.L的抑制效果更佳, 其效果为I_Na.T的93.16倍。

2 Mel对小鼠心室肌细胞I_Ca.L、I_to、AP的影响

在给予浓度为50 μmol·L^-1 Mel前后, 与对照组相比, I_Ca.L、I_to电流未发生明显改变(图 3A、B)。分别给予20、50 μmol·L^-1 Mel后, 动作电位轨迹图几乎完全重合(图 3C), 在不同浓度Mel下, 小鼠心室肌细胞动作电位复极50%时程(action potential duration at 50%, APD₅₀) 和电位复极90%时程(action potential duration at 90%, APD₉₀) 均未产生显著影响(图 3D、E)。

3 Mel对ATX Ⅱ诱导的早期后除极(early afterdepolarizations, EADs) 的影响

在本实验中, 给予2 nmol·L^-1 ATX Ⅱ诱导APD的延长和EADs的发生。如图 4A、B所示, 2 nmol·L^-1 ATX Ⅱ能有效延长APD和引发EADs。结果显示, 给予16 μmol·L^-1 Mel能有效缩短由ATX Ⅱ延长的APD并使EADs消失(图 4C)。此外, 再用2 nmol·L^-1 ATX Ⅱ的细胞外液充分复灌, 如图 4D所示, APD重新延长且EADs再次发生, 结果显示Mel对产生EADs的拮抗作用是可逆的。16 μmol·L^-1 Mel可使APD₉₀缩短95.1%且消除EADs。在复灌2 nmol·L^-1 ATX Ⅱ后, 恢复至给药前的71.5%, EADs重新出现(图 4E、F)。

4 Mel对ATX Ⅱ诱导的小鼠离体心脏心律失常的影响

将小鼠分为两组, 分别为ATX Ⅱ组和ATX Ⅱ + Mel组, 每组各10只。在ATX Ⅱ组中(图 5A), 小鼠心脏首先出现节律不齐, 然后出现传导阻滞, 随后频繁出现早搏, 演变为VT后迅速发生了VF。在ATX Ⅱ + Mel组中, 小鼠心脏仅出现节律减缓(图 5B)。在10例ATX Ⅱ离体心脏中, 所有心脏均出现VT和VF。在ATX Ⅱ + Mel组中(图 5C), 有5例发生VT, 3例发生VF。通过比较两组VT和VF的平均首发时间, 与ATX Ⅱ组相比, ATX Ⅱ + Mel组使首次发作时间延后(图 5D)。

5 Mel通过抑制CaMKII的活性降低[Ca²⁺]_i升高引起的I_Na.L增强

在全细胞记录模式中, 将钙调蛋白激酶Ⅱ (calmodulin-dependent protein kinases Ⅱ, CaMKII) 抑制剂(10 μmol·L^-1 KN-93) 加入细胞外液中。在同一个细胞中先给予16 μmol·L^-1 Mel, 电流稳定后灌流给予10 μmol·L^-1 KN-93和16 μmol·L^-1 Mel。如图 6A、C所示, 给予Mel后, I_Na.L降低了55.37%, 灌流给予10 μmol·L^-1 KN-93和16 μmol·L^-1 Mel后, I_Na.L无显著性改变。在同一个细胞中先灌流加入KN-93, 待电流稳定后给予16 μmol·L^-1 Mel。如图 6B、D所示, 给予10 μmol·L^-1 KN-93后, I_Na.L降低了61.81%, 而再给予16 μmol·L^-1 Mel后, I_Na.L无明显变化。

讨论

收起

I_Na.L是在心脏动作电位平台期观察到的一种持续的小的内向电流, 由于心脏AP的平台期是由微小的内向和外向电流流量之间的微妙平衡形成的^[12], 因此, 即使I_Na.L的微小变化也可能显著改变AP的持续时间。I_Na.L在正常心肌细胞中相对较小(在平台电位下约为30 pA), 但在病理条件下会显著增加^[13], 具有潜在的促心律失常作用^[14]。实验和临床研究表明, I_Na.L抑制剂可以预防和治疗心律失常, 改善心室泵功能, I_Na.L抑制剂可能为心脏缺血和心律失常的治疗提供一个有前途的新靶点^[15]。在本研究中, Mel对ATX Ⅱ诱导增大的I_Na.L有明显的抑制作用, 可能为心律失常的治疗提供新的思路。TTX作为I_Na.L抑制剂, 确有研究报道其可降低衰老相关的应激性室性心律失常发生^[13]。本实验也发现2 μmol·L^-1 TTX可使I_Na.L幅度下降68.2%, 但TTX微剂量即可致死, 具有强烈毒性, 其安全性远远不如Mel。目前, 在临床上使用最广泛的I_Na.L抑制剂是雷诺嗪, 但它对I_Na.L与I_Na.T的IC₅₀比值仅为4.499^[16]。在本文对Mel的研究中, 其I_Na.L与I_Na.T的IC₅₀比值为93.16, 说明Mel对I_Na.L的抑制作用是I_Na.T的93.16倍。I_Na.L与I_Na.T的IC₅₀比值远高于雷诺嗪。同时, 本实验表明在高浓度Mel作用下, I_Ca..L和I_to均未受到Mel影响。综上所述, 在心脏电生理方面, Mel作为一种优先抑制I_Na.L的Na⁺通道阻滞剂对心律失常的治疗具有重要意义, 且其对I_Na.L的阻断作用具有较高的特异性, 比起以上提及的I类Na⁺通道阻滞剂和雷诺嗪可能是一种更加有效且选择性更高的安全的Na⁺通道阻滞剂。

EADs主要发生在AP平台期和复极阶段, 其会导致多种疾病, 包括LQTS、儿茶酚胺能多形性室性心动过速和HF。众所周知, 心肌细胞内Ca²⁺的正常循环对心脏的正常电、机械功能至关重要, 细胞内Na⁺浓度([Na⁺]_i) 又与Ca²⁺稳态密切相关^[17]。细胞内Na⁺和Ca²⁺浓度之间的直接偶联是通过钠-钙交换器(Na⁺-Ca²⁺ exchanger, NCX) 来调节的^[18], 当细胞内Na⁺浓度增高时(如I_Na.L增大时), 反向Na⁺-Ca²⁺交换模式增强使心肌细胞Ca²⁺内流增多导致细胞内钙超载最终诱发多种心律失常。EADs的诱发就与上述的Na⁺、Ca²⁺通道及反向Na⁺-Ca²⁺交换电流有关。I_Na.L异常增大会引起细胞内Na⁺内流加剧, 细胞内钠超载不仅会导致APD平台期延长诱发EADs的发生, 还会引起反向Na⁺-Ca²⁺交换增强, 最终导致胞内钙超载诱发DADs。因此, I_Na.L的增加对EADs的发生和发展有着重要的影响^[19]。本实验结果表明, Mel能够缩短APD并且对ATX Ⅱ诱导的EADs产生拮抗作用。由此可见, Mel对I_Na.L的抑制作用对于细胞水平上抗心律失常作用扮演着重要角色, 具有较强的抑制EADs样心律失常活动的作用, 而这种作用可能与对I_Na.L的抑制作用相关, 为抗心律失常新药物的研发提供了潜在的可能性。

VT和VF是心源性猝死最重要的因素, 多种心血管疾病可导致这两种严重的恶性心律失常, 如布鲁格达综合征、长QT综合征等^[20]。已有研究表明, LQTS3患者出现I_Na.L升高, 则患者发生室性心律失常和心房颤动的风险都很高^[21], 这说明I_Na.L可能在心律失常和机械功能障碍的发生中起重要作用^[14]。因此, 本课题组推测Mel对离体心脏的抗心律失常作用与其对I_Na.L的抑制有关。本实验提示, Mel对恶性心律失常的发生可能具有一定的拮抗作用, 这种拮抗作用与其对I_Na.L的抑制密切相关, 可能是其抗心律失常作用的基础。

CaMKII能够磷酸化多种心肌离子通道和钙转蛋白, 所导致的细胞电生理和ECG改变可导致HF中的心律失常发生和收缩功能障碍。心脏钠通道也可通过CaMKII来调节, 且其倾向于增加向内的Ca²⁺和晚期I_Na^[22]。已有研究结果表明, CaMKII参与了[Ca²⁺]_i的增加从而导致I_Na.L的增加。负责Ca²⁺超载诱导I_Na.L增加的通路抑制剂可能有助于减轻与Ca²⁺超载和I_Na.L增强相关的心律失常发生和机械功能障碍^[23]。本文结果提示, Mel与KN-93对晚钠电流的抑制作用不能相加, 表明KN-93与Mel抑制晚钠电流的作用可能是相同的, 且KN-93为CaMKII抑制剂, 即Mel抑制I_Na.L与其对CaMKII的抑制作用相关。

Mel也具有局限性, 其具备光敏性^[24], 易受到环境光照影响, 作用效果可能不稳定。关于Mel的安全性分析仅限于特定的临床适应症或低剂量Mel情况, 并未纳入所有临床条件和考虑高剂量的影响^[25], 对于高浓度治疗剂量下对全身器官的影响仍需进一步研究和探讨。

当前, Mel已经作为一种常见补剂用于治疗睡眠相关疾病^[6]。本实验结果说明, Mel对ATXII诱导的心律失常具有较好的抑制作用, 且这种抑制作用与其对I_Na.L的作用有关。已有实验研究表明, Mel与其他药物联合使用可降低心血管毒性^[26], 因此本文的研究为将来Mel是否可以成为治疗心血管疾病的辅助药物提供了理论基础。

作者贡献: 文杰、刘汗峰、杨岩岩、张泽夫负责构思、设计、完成本实验、统计数据及撰写文章; 罗岸涛、曹珍珍进行论文修改; 马季骅负责论文监督。

利益冲突: 本研究内容无任何利益冲突。

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国家自然科学基金资助项目(81670302)

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2024年第59卷第1期

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183

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0601

接收时间：2023-05-10
首发时间：2025-11-28
出版时间：2024-01-12

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作者

出版历史

收稿日期：2023-05-10
修回日期：2023-06-19

基金

国家自然科学基金资助项目(81670302)

作者信息

1.武汉科技大学医学院, 湖北武汉 430070

2.武汉科技大学生命科学与健康学院, 湖北武汉 430070

通讯作者:

^*马季骅, Tel: 15697188050, E-mail: mjhua@wust.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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