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绿原酸拮抗顺铂诱发的神经病理性疼痛的机制研究

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李娜 ¹^,^* , 张学会 ²

药学学报 | 研究论文 2024,59(3): 616-620

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(3): 616-620

绿原酸拮抗顺铂诱发的神经病理性疼痛的机制研究

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李娜¹^,^*, 张学会²

作者信息

1.新乡市中心医院 (新乡医学院第四临床学院) 药学部, 河南新乡 453000

2.南京医科大学附属江苏盛泽医院药学部, 江苏苏州 215228

通讯作者:

^*李娜, Tel: 86-373-2048924, E-mail: linaln861@163.com

The mechanism of chlorogenic acid against neuropathic pain induced by cisplatin

Na LI¹^,^*, Xue-hui ZHANG²

Affiliations

1. Department of Pharmacy, Xinxiang Central Hospital (the Fourth Clinical College, Xinxiang Medical College), Xinxiang 453000, China

2. Department of Pharmacy, the Affiliated Jiangsu Shengze Hospital of Nanjing Medical University, Suzhou 215228, China

出版时间: 2024-03-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1120

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摘要

收起

本研究评价绿原酸能否抑制顺铂所致的化疗痛, 并探讨其分子机制。实验方案遵循新乡市中心医院实验动物伦理委员会规定, 所有程序均按照动物使用和护理的伦理原则进行。实验采用von Frey hair和热辐仪测定大鼠的机械痛阈和热痛阈, 采用Western blot检测大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) 中辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid type-1, TRPV1) 的表达, 采用膜片钳记录大鼠DRG神经元中TRPV1电流。实验结果表明, 顺铂可诱导大鼠产生机械痛和热痛反应, 而TRPV1受体拮抗剂capsazepine和绿原酸均可抑制顺铂介导的痛觉敏化; Western blot实验表明, 顺铂可上调大鼠DRG中TRPV1蛋白的表达, 而绿原酸则可以抑制顺铂对TRPV1蛋白的上调作用; 膜片钳实验结果显示, 顺铂可增加TRPV1电流密度, 绿原酸可显著逆转顺铂的这种作用。以上结果表明, 绿原酸可通过抑制TRPV1的表达和功能进而缓解顺铂诱发的化疗痛。

关键词

绿原酸 / 顺铂 / 化疗痛 / 背根神经节 / 辣椒素受体

Abstract

收起

This study aimed to investigate the analgesic effect of chlorogenic acid on cisplatin-induced neuropathic pain and explored the underlying molecular mechanisms. The animal experimental protocol has been reviewed and approved by Laboratory Animal Ethics Committee of Xinxiang Central Hospital, in compliance with the Institutional Animal Care Guidelines. Von Frey hair and a radiant heat was employed to measure mechanical allodynia and thermal hyperalgesia; Western blot was used to examine transient receptor potential vanilloid type-1 (TRPV1) protein expression in the rat dorsal root ganglion (DRG); patch clamp was used to record TRPV1 currents in DRG neurons. The experimental results showed that chlorogenic acid could attenuate cisplatin-induce mechanical allodynia and thermal hyperalgesia in rats. The expression of TRPV1 protein in DRGs was increased in cisplatin-treated rats, while chlorogenic acid also could reverse cisplatin-induced the upregulation of TRPV1 protein. Forthermore, chlorogenic acid could attenuate cisplatin-mediated the upregulation of TRPV1 current density. These above results indicated that chlorogenic acid could alleviate cisplatin-induced pain hypersensitivity through inhibition of the expression and function of TRPV1 in rats.

Key words

chlorogenic acid / cisplatin / chemotherapy-induced pain / dorsal root ganglion / transient receptor potential vanilloid type-1

引用本文

李娜, 张学会. 绿原酸拮抗顺铂诱发的神经病理性疼痛的机制研究. 药学学报, 2024 , 59 (3) : 616 -620 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1120

Na LI, Xue-hui ZHANG. The mechanism of chlorogenic acid against neuropathic pain induced by cisplatin[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (3) : 616 -620 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1120

正文

收起

顺铂(cisplatin) 是一种通过与细胞内DNA结合并抑制其复制, 进而诱导肿瘤细胞死亡的广谱抗癌药物, 临床上主要用于治疗肺癌、睾丸癌等多种恶性肿瘤^[1]。然而, 神经毒性是顺铂化疗最常见的不良反应, 也是临床上限制顺铂应用的主要因素^[2]。顺铂所致神经毒性以外周感觉神经症状为主, 主要表现为肢端的疼痛和麻木感, 目前临床上有部分患者因为不能耐受疼痛而被迫停止治疗^[3]。辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid type-1, TRPV1) 是从外周初级感觉神经元中克隆出的一种非选择性的阳离子通道, 可介导炎症痛、神经痛和癌症痛的发生发展^[4]。尽管在顺铂诱发的小鼠神经病理痛模型中, 背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) 上TRPV1的表达显著上调^[3], 但其功能是否发生变化尚不清楚。

绿原酸(chlorogenic acid, CGA) 是一种广泛存在于杜仲、咖啡及金银花中的多酚类化合物, 具有抗炎、抗氧化、降血压、抗肿瘤等多种药理作用^{[5, 6]}。此外, 绿原酸还可缓解糖尿病大鼠的神经病理痛及前列腺素E₂ (prostaglandin E₂, PGE₂)诱发的炎症痛^{[7, 8]}。目前的研究表明, 绿原酸可通过抑制酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels, ASICs) 的表达或激活电压依赖性钾通道发挥镇痛作用^{[8, 9]}, 但绿原酸是否能够拮抗化疗药物引起的神经病理痛尚不清楚, 因而本研究将采用顺铂诱导的化疗痛模型评价绿原酸的镇痛作用, 并探讨其分子机制。

材料与方法

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实验动物 SPF级雄性SD大鼠, 5~6周龄, 体重(200 ± 20) g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司, 实验动物许可证编号: SCXK (京) 2021-0011。大鼠3~5只分笼饲养在(25 ± 2) ℃ SPF级动物房内, 自由饮水和饮食。实验方案经新乡市中心医院实验动物伦理委员会审查通过, 所有程序均按照动物使用和护理的伦理原则进行。

实验材料 绿原酸(C109404)、顺铂(C295225) 均购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 溶解于生理盐水中; 辣椒素(capsaicin, CAP, 211275) 和辣椒平(capsazepine, CPZ, 211280) 购于美国Sigma公司, 溶解于DMSO中。胎牛血清(SV30087.02) 购于Hyclone公司; DMEM培养基(12800017) 购于Gibco公司; 兔抗TRPV1受体多克隆抗体(SAB5700857) 购于美国Sigma公司, 小鼠抗β-actin单克隆抗体(TA09)、辣根酶标记山羊抗兔IgG (ZB-2301)、辣根酶标记兔抗小鼠IgG (ZB-5305) 均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

仪器热辐射测痛仪Model 390G (上海玉研科学仪器有限公司); von Frey hair测痛丝(美国Stoelting公司); 膜片钳放大器EPC10 (德国HEKA公司); real time PCR仪ABI 7500 (美国Applied Biosystems公司); Western blot凝胶成像系统FluorChem M (美国ProteinSimple公司)。

动物造模及分组 大鼠适应性饲养1周后随机进行分组。为了考察顺铂能否诱发神经痛, 将大鼠随机分为溶剂组和顺铂组, 溶剂组大鼠每天按照1 mL·kg^-1剂量腹腔注射生理盐水, 模型组大鼠每天腹腔注射1 mg·kg^-1顺铂, 每天1次, 连续注射7天。为了考察CPZ的镇痛效果, 首先对大鼠腹腔注射1 mg·kg^-1顺铂, 每天1次, 连续注射7天, 然后将其随机分为DMSO组和CPZ组, DMSO组大鼠腹腔注射0.1% DMSO, CPZ组大鼠腹腔注射30 mg·kg^-1 CPZ, 1 h后检测大鼠的机械痛和热痛行为。为了考察绿原酸对顺铂诱导的大鼠神经痛的影响, 将大鼠随机分为溶剂组、绿原酸低、中、高剂量治疗组。溶剂组大鼠每天腹腔注射1 mg·kg^-1顺铂前1 h先腹腔注射生理盐水, 绿原酸低、中、高剂量治疗组大鼠每天分别在腹腔注射1 mg·kg^-1顺铂前1 h先腹腔注射50、100和200 mg·kg^-1绿原酸, 上述大鼠连续给药7天。

大鼠痛行为的测定 机械痛测定: 大鼠置于透明18 cm × 8  cm× 8  cm有机玻璃罩内使其适应15~30 min, 当其安静后测定大鼠机械痛或热痛行为。对于机械痛, 采用不同强度的von Frey hair (0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和15.0 g) 按照“up and down”法测定大鼠左后肢的机械痛阈(paw withdrawal threshold, PWT)。热痛测定时, 首先将热辐射光源对准大鼠左后足垫, 开启光源, 当大鼠出现抬足反应后关闭光源, 记录该次大鼠的抬足潜伏期(paw withdraw latency, PWL)。为了保证测试结果的准确性, 每只大鼠至少重复测量3次, 每次测量间隔至少5 min, 然后取平均值记为大鼠的热辐射痛阈。

蛋白提取及Western blot实验 将各组大鼠处死后, 立即分离出左侧L4~L6 DRGs置于1.5 mL EP管中, 然后加入150 µL RIPA裂解液, 冰上超声破碎后裂解1 h提取组织总蛋白。在4 ℃、12 000 r·min^-1离心10 min, 取上清, 采用BCA法进行蛋白定量。将50 µg蛋白样品加入到10% SDS-PAGE凝胶泳道中进行电泳分离。采用电转移法将其转位到PVDF膜上, 5%脱脂奶室温封闭1 h后, 分别以1∶1 000和1∶2 000的比例配制TRPV1、β-actin抗体, 4 ℃孵育过夜, 经TBST洗涤3次后, 以1∶1 000的比例在室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗1 h, ECL试剂盒显色, 置于FluorChem E Alpha化学发光凝胶成像系统中曝光、拍照。采用Quantility One软件分析光密度值。

电生理记录大鼠DRG神经元中TRPV1电流 急性分离DRG神经元: 大鼠处死后, 迅速取出左侧L4~L6 DRG置于培养皿中。经预冷的DMEM培养基洗涤后加入3 mg·mL^-1胶原酶1.5 mL, 37 ℃消化上述DRG 45 min, 然后再用0.25%胰酶1.5 mL继续消化12 min。使用2 mL含10% FBS的DMEM培养基终止消化, 以1 000 r·min^-1的速度离心5 min后弃去上清, 加入新鲜的含10% FBS的DMEM培养基, 用巴斯德管吹打DRG, 分离出DRG神经元。最后将神经元接种在24孔板中的圆形盖玻片(直径12 mm) 上, 盖玻片提前1天给予多聚赖氨酸进行包被。将接种有神经元的24孔板置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养2 h后进行膜片钳实验。

电生理记录TRPV1电流 选取直径小于25 μm的DRG神经元, 在电压钳模式下, 将神经元的电压钳制在-70 mV, 执行TRPV1受体激动剂CAP灌流给药步骤(细胞外液2 s, 0.5 µmol·L^-1 CAP 3 s, 细胞外液20 s), 记录TRPV1电流。采用EPC-10膜片钳放大器和Patch master软件记录和分析TRPV1电流。

统计学分析 所有实验数据均以均值±标准误(mean ± SEM) 表示, 采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析, 两组间比较采用非配对t检验(unpaired t-test), 单因素多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 两因素多组间比较采用双因素方差分析(two-way ANOVA), 以P < 0.05为具有统计学意义。

结果

收起

1 顺铂通过上调TRPV1受体的表达和功能介导大鼠的痛敏反应

实验结果显示大鼠在第3次注射顺铂后, 与对照组相比出现显著的机械痛和热痛行为, 且随注射顺铂次数的增加其发生机械痛和热痛的强度也越强(图 1A、B)。

TRPV1是一种非选择性阳离子通道受体, 在炎症痛、神经痛中具有重要的作用^[4]。实验结果表明, 大鼠在第3次、第7次注射顺铂后, 其DRG中TRPV1蛋白的表达显著上调(图 2A); 急性分离第7次注射顺铂后的大鼠DRG神经元, 采用膜片钳记录TRPV1电流, 实验结果显示顺铂组大鼠TRPV1电流密度较溶剂组显著上调(图 2B)。

为了证明TRPV1介导了顺铂所致的痛觉敏化, 连续注射顺铂造模后腹腔注射TRPV1受体拮抗剂CPZ (30 mg·kg^-1) 或0.1% DMSO溶剂, 实验结果显示, 与DMSO相比, CPZ可显著上调顺铂处理后的大鼠的机械痛阈和热痛阈(图 3A、B)。

2 绿原酸通过抑制TRPV1的表达和功能缓解顺铂介导的痛敏反应

实验结果显示, 绿原酸可显著抑制顺铂诱发的机械痛和热痛, 并呈剂量依赖性(图 4A、B)。

大鼠连续注射顺铂1周后, 其DRG中TRPV1受体蛋白的表达显著上调, 而绿原酸则可显著抑制顺铂诱导的TRPV1蛋白表达的上调(图 5A)。此外, 膜片钳实验结果也显示绿原酸可抑制顺铂介导的TRPV1电流密度的上调(图 5B)。

讨论

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本研究发现, 顺铂可上调大鼠DRG中TRPV1蛋白的表达, 而绿原酸可通过抑制TRPV1的表达进而缓解顺铂所致的神经痛。作为一种非选择性配体门控离子通道受体, TRPV1参与了多种慢性痛的发生、发展^[4]。如在骨癌痛和神经痛动物模型中, TRPV1在DRG中的表达均显著上调, 抑制TRPV1的功能则可显著缓解动物的痛敏反应^{[10, 11]}。本实验发现在顺铂诱导的化疗痛中, 大鼠DRG上TRPV1的表达及功能均显著增强, TRPV1受体拮抗剂则可显著缓解大鼠的痛敏反应, 提示TRPV1介导了顺铂所致的化疗痛。

有研究表明绿原酸可通过激活GABA受体抑制大鼠神经病理痛^[12], 但目前尚无绿原酸可调控TRPV1受体的报道, 本研究发现绿原酸可以抑制TRPV1受体的表达和功能, 但是对于绿原酸是如何抑制TRPV1蛋白的表达尚不清楚。炎症因子IL-6和PGE2等均可以促进DRG中TRPV1蛋白的表达^[11], 并且顺铂可促进DRG中的胶质细胞释放IL-6、PGE2等炎症因子进而介导疼痛的发生^[13]; 而绿原酸则具有显著的抗炎活性, 可抑制机体产生IL-6、PGE2等因子^[14]。因此, 提示绿原酸可能通过抑制IL-6、PGE2的产生进而下调TRPV1的表达。

绿原酸属于一种苯丙素类物质, 也是双黄连注射液、清开灵注射液等中药注射液的活性成分之一^[15]。近年的研究表明, 绿原酸可通过调节机体的免疫系统或直接促进肿瘤细胞凋亡进而发挥抗肿瘤作用, 尤其对肺癌、脑胶质瘤、卵巢癌等恶性肿瘤具有显著的疗效^{[16, 17]}。此外, 绿原酸还可增强顺铂、多柔比星、5-氟尿嘧啶等化疗药物的抗肿瘤活性^[18-20]。考虑到绿原酸现已进入临床试验用于肿瘤的治疗, 因此提示顺铂联用绿原酸有可能在肿瘤的化疗中发挥增效减毒的作用。

作者贡献: 李娜负责实验设计、实验完成、数据分析和论文撰写; 张学会协助实验完成和论文修改。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第59卷第3期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1120

接收时间：2023-09-27
首发时间：2025-11-28
出版时间：2024-03-12

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收稿日期：2023-09-27
修回日期：2023-10-30

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1.新乡市中心医院 (新乡医学院第四临床学院) 药学部, 河南新乡 453000

2.南京医科大学附属江苏盛泽医院药学部, 江苏苏州 215228

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^*李娜, Tel: 86-373-2048924, E-mail: linaln861@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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