药学学报

Name (Number)	Target	Chemical structure	IC₅₀/nmol·L^-1	Indication
NCB-0001 (1)	TNIK		8.6	CRC
KY-05009 (2)	TNIK		9	CRC
N5355	TNIK	NA	3	CRC
3, 4	TNIK		100, 200	CRC
TNK-002 (5)	TNIK		28	CRC
TNK-007 (6)	TNIK		40	CRC
9	TNIK		6	CRC
Mebendazole (10)	TNIK		NA	CRC, NSCLC
Dovitinib (11)	FGFR, VEGF, TNIK		K_i = 13 nmol·L^-1	MM
OBD9 (12)	TNIK		< 1 μmol·L^-1	CRC
PD407824 (13)	Chk1, Wee1A, TNIK		0.7	NA
NCB-0846 (14)	TNIK		21	CRC
NCB-0970 (15)	TNIK		272	CRC
16	TNIK		≤ 10	NA
17	TNIK		≤ 10	NA
18	TNIK		≤ 10	NA
19	TNIK		≤ 10	NA
ON 108600 (22)	CK2/TNIK		5	NA
23, 24	TNIK		48, 49	NA
27	TNIK		0.13	CRC
29	TNIK		26 ± 8	CRC
32	TNIK		50 ± 6	CRC
33	TNIK		30.12 ± 0.55	NA
Jatrorrhizin (34)	TNIK		NA	CRC

Name (Number)	Target	Chemical structure	IC₅₀/nmol·L^-1	Indication
NCB-0001 (1)	TNIK		8.6	CRC
KY-05009 (2)	TNIK		9	CRC
N5355	TNIK	NA	3	CRC
3, 4	TNIK		100, 200	CRC
TNK-002 (5)	TNIK		28	CRC
TNK-007 (6)	TNIK		40	CRC
9	TNIK		6	CRC
Mebendazole (10)	TNIK		NA	CRC, NSCLC
Dovitinib (11)	FGFR, VEGF, TNIK		K_i = 13 nmol·L^-1	MM
OBD9 (12)	TNIK		< 1 μmol·L^-1	CRC
PD407824 (13)	Chk1, Wee1A, TNIK		0.7	NA
NCB-0846 (14)	TNIK		21	CRC
NCB-0970 (15)	TNIK		272	CRC
16	TNIK		≤ 10	NA
17	TNIK		≤ 10	NA
18	TNIK		≤ 10	NA
19	TNIK		≤ 10	NA
ON 108600 (22)	CK2/TNIK		5	NA
23, 24	TNIK		48, 49	NA
27	TNIK		0.13	CRC
29	TNIK		26 ± 8	CRC
32	TNIK		50 ± 6	CRC
33	TNIK		30.12 ± 0.55	NA
Jatrorrhizin (34)	TNIK		NA	CRC

TNIK小分子抑制剂在抗肿瘤治疗中的研究进展

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陈梦销 ¹ , 何毅 ¹^,^* , 聂神有 ¹^,²^,^*

药学学报 | 综述 2024,59(5): 1151-1162

收起

药学学报 | 综述 2024, 59(5): 1151-1162

TNIK小分子抑制剂在抗肿瘤治疗中的研究进展

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陈梦销¹, 何毅¹^,^*, 聂神有¹^,²^,^*

作者信息

1.重庆医科大学生命科学研究院, 新靶标与化学干预教育部医药基础研究创新中心, 重庆 400016

2.重庆医科大学附属第二医院泌尿外科, 重庆 400010

通讯作者:

^*何毅, Tel: 15123805327, E-mail: heyisky@cqmu.edu.cn;

聂神有, Tel: 18602128026, E-mail: nieshenyou@cqmu.edu.cn

Research progress on small-molecule inhibitors targeting TNIK in cancer treatment

Meng-xiao CHEN¹, Yi HE¹^,^*, Shen-you NIE¹^,²^,^*

Affiliations

1. Basic Medicine Research and Innovation Center for Novel Target and Therapeutic Intervention, Ministry of Education, Institute of Life Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

2. Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China

出版时间: 2024-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1095

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摘要

收起

肿瘤坏死因子受体相关因子-2和Nck相互作用蛋白激酶(TNIK) 与肿瘤的发生、发展和预后密切关系, 参与了Wnt/β-catenin等重要的信号通路的调节, 是肿瘤治疗中的一个潜在的重要靶标。目前已经报道多种结构多样且体外酶活很高的TNIK抑制剂, 但是由于选择性差、毒性大和体内抗肿瘤治疗效果不显著等多方面原因, 限制了其进一步开发。截至目前, 尚没有一个TNIK抑制剂进入临床研究。本文将对近年来靶向TNIK的小分子抑制剂在抗肿瘤治疗中的最新研究进展进行综述, 以期为后续TNIK抑制剂的研究开发提供借鉴。

关键词

TNIK / Wnt/β-catenin / 小分子抑制剂 / 激酶 / 抗肿瘤

Abstract

收起

Traf2- and Nck-interacting kinase (TNIK) is closely related to the cancer occurrence, development, and prognosis. TNIK plays an important role in regulating Wnt/β-catenin pathway, thus becoming a potential target for cancer treatment. Various small-molecule TNIK inhibitors with diverse structures and potent in vitro activities have been developed to treat tumors. However, no TNIK inhibitor has entered clinical phase mainly due to poor selectivity, toxicity, and unsatisfied in vivo anti-tumor efficiency. This review summarizes the research progress of small molecule inhibitors targeting TNIK, with the aim of giving some guidance for future research and development of small-molecule inhibitors.

Key words

Traf2- and Nck-interacting kinase / wnt/β-catenin / small molecule inhibitor / kinase / anti-tumor

引用本文

陈梦销, 何毅, 聂神有. TNIK小分子抑制剂在抗肿瘤治疗中的研究进展. 药学学报, 2024 , 59 (5) : 1151 -1162 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1095

Meng-xiao CHEN, Yi HE, Shen-you NIE. Research progress on small-molecule inhibitors targeting TNIK in cancer treatment[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (5) : 1151 -1162 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1095

正文

收起

1999年, 肿瘤坏死因子受体相关因子-2 (Traf2) 和Nck相互作用蛋白激酶(Traf2- and Nck-interacting kinase, TNIK) 第一次在酵母双杂交筛选实验中被发现, 其很可能参与了细胞骨架的调控。随后, 研究发现TNIK在人体多种组织中广泛表达, 尤其在心脏、大脑和骨骼肌中检测到更高水平表达。TNIK最早被发现能够影响突触后信号传导^[1], 随后发现TNIK在神经系统中高表达, 并在谷氨酸能突触的突触后密度中积累^[2]。最近, 通过结合全甲基组的关联研究与先前的全基因组关联研究(GWASs), TNIK被重新定义为精神分裂症的易感基因^[3]。除了对神经系统的影响, TNIK与肿瘤的关系也非常密切。在肿瘤信号通路的研究中发现, TNIK参与了Wnt/β-catenin信号通路的调控^[4], 因此, TNIK成为了与Wnt/β-catenin信号通路异常激活相关肿瘤治疗的重要靶点。

1 TNIK作为抗肿瘤的潜力靶点

收起

从发现第一个抗肿瘤TNIK抑制剂PD407824以来^[5], 目前共报道了30多个靶向TNIK的抗肿瘤抑制剂。虽然之前有综述对TNIK的结构及其抗结直肠癌的抑制剂进行了报道^[6-8], 但是目前尚无综述对所有靶向TNIK的抗肿瘤抑制剂的构效关系研究和临床前研究状态进行全面总结。本文将对TNIK与肿瘤发生发展的关系进行总结, 对所有TNIK抑制剂按化学结构特点分类并进行构效分析, 以及简要概述这些抑制剂的临床前研究状态, 并对其抑制剂的未来发展进行展望。

1.1 TNIK的结构特征

TNIK是一种属于生发中心激酶(germinal center kinase, GCK) 的丝氨酸/苏氨酸激酶^[8]。就结构而言, TNIK由1 360个氨基酸组成, 包含一个N端激酶结构域(图 1), 一个中间结构域和一个C端末端区域(又称为citron同源结构域, CNH)。TNIK的中间结构域与Traf2的Traf结构域相互作用。TNIK的中间结构域可通过选择性地剪接, 使其分成了8个不同的亚型, 然而亚型之间的功能差异尚不清楚^[1]。与其他GCK激酶类似, CNH区域能激活c-Jun N-terminal kinase (JNK) 通路。CNH区域还能特异性与Rap2发生相互作用, 参与肌动蛋白细胞骨架的调节^[9]。与其他蛋白激酶相同, TNIK的激酶结构域含有ATP结合位点, 这个结合位点成为了小分子抑制剂作用位点。

迄今为止, 所有已报道的TNIK抑制剂都是靶向激酶结构域的ATP结合位点的竞争性抑制剂。对不同种抑制剂的晶体复合物结构进行分析发现, TNIK抑制剂与TNIK激酶区域的结合存在两种不同构象, 一种是闭合的活性构象, 另一种是开放的非活性构象^[8]。

1.2 TNIK与肿瘤

研究发现, TNIK的过度表达不仅参与了肌动蛋白细胞骨架的调节, 而且还激活了如Wnt、JNK、NF-κB等^{[4, 10, 11]}多种信号通路。TNIK不仅与多种肿瘤如结直肠癌、胃癌、胰腺癌等的发生发展具有密切的关系, 对肿瘤的预后也有一定的影响。与此同时, 在TNIK高表达的肺鳞癌LK2和NCI-H520细胞模型中, 靶向诱导TNIK shRNA后, 细胞在三维细胞培养基中显示出明显的生长抑制。因此, TNIK是肿瘤治疗的一个潜在重要靶点。

1.2.1 TNIK参与Wnt/β-catenin通路调控与肿瘤的关系

上皮细胞-间充质转化(EMT) 是上皮细胞在胚胎发生、发育、伤口愈合、器官纤维化和癌症转移过程中获得间充质细胞特征所经历的复杂变化过程。转化生长因子-β (TGF-β) 是癌细胞中触发EMT的最主要细胞因子。Smad与Wnt/β-catenin通路之间的相互依赖关系已经被证实, TGF-β通过Smad和Wnt/β-catenin信号通路之间的级联来触发EMT^[12]。通过对Wnt/β-catenin通路的关键因子TNIK的抑制来调控肿瘤细胞EMT的相关研究已有报道^{[13, 14]}。

Wnt信号通路异常是驱动结直肠癌发生发展的主要因素^[15]。2009年, Mahmoudi等^[4]发现TNIK是TCF-4和β-catenin组成的转录复合物的重要共激活因子。Wnt通路未激活时, 细胞内的β-catenin将被由膜表面受体蛋白Frizzled (FZD) 和LRP5/6, 以及Axin、APC、糖原合成酶激酶3 (GSK3) 和酪蛋白激酶1α (CK1α) 等组成的β-catenin降解复合物通过泛素蛋白酶体系统降解(图 2, 左)。Wnt信号与膜表面受体蛋白Frizzled (FZD) 和LRP5/6结合激活通路, 引起降解复合物破坏, 进而β-catenin积累并移位进入细胞核, 此时TNIK以β-catenin依赖的方式被招募, 与TCF-4和β-catenin组成的转录复合物直接结合, 并磷酸化TCF-4的154位丝氨酸, 进而诱导Wnt靶基因的转录。90%的结直肠癌细胞中存在两个主要的突变基因: 腺瘤性结肠息肉病基因(APC) 和CTNNB1基因^[16], 其中APC基因突变占80%^[17]。当APC发生突变失活后, 降解复合体无法形成, β-catenin移位至细胞核内产生堆积, 进一步与转录因子-4 (TCF-4) 及一系列共激活因子(如CBP/P300, Brg1, Pygopus/Bcl9复合物等^[18-20]) 组成转录复合物激活下游基因的表达(图 2, 右)。由于APC的高频突变引起降解复合体无法形成, 造成信号截断并导致靶向APC上游靶点的治疗效果大大降低, 因此作为通路最下游的效应因子TNIK成为了结直肠癌最有潜力的治疗靶点^[21]。目前结直肠癌的治疗以手术和放化疗为主^[22], 靶向治疗仍然具有较大的挑战。研究发现, TNIK还对结直肠癌的预后有着较大的影响^[23]。TNIK蛋白表达与临床病理特征之间存在显著相关性, 高TNIK表达是Ⅱ期和Ⅲ期结直肠癌术后复发的重要预后因素。

滑膜肉瘤(synovial sarcomas, SS) 是一种罕见的侵袭性肿瘤, 占软组织肉瘤的10%~20%^[24], 该疾病经常对细胞毒性药物产生耐药性。研究证明, Wnt/β-catenin信号通路的失调与滑膜肉瘤发生发展密切相关^[25]。常见β-catenin在滑膜肉瘤细胞核积累, 并观察到细胞过表达Wnt通路靶基因的产物, 如AXIN2、DKK1、c-MYC和CyclinD1等^[26]。因此, 靶向Wnt/β-catenin信号通路具有治疗滑膜肉瘤的潜力。2020年, Sekita等^[27]在部分滑膜肉瘤细胞中检测到Wnt/β-catenin信号的激活, 而敲低TNIK对Wnt/β-catenin激活的滑膜肉瘤细胞产生了强烈的生长抑制, 并能诱导细胞凋亡, 通过对TNIK进行药理抑制同样得到了类似的结果, 这为滑膜肉瘤的靶向治疗提供了重要的指导。

1.2.2 TNIK参与JNK、PI3K等通路调控与肿瘤的关系

2014年, TNIK被鉴定为胃癌中的扩增基因。研究发现胃癌中扩增的TNIK独立于Wnt信号通路, 参与调控PI3K/AKT信号通路来促进胃癌细胞的增殖, 但TNIK抑制剂抑制AKT磷酸化的抑制机制尚不清楚, 同时还发现TNIK对细胞自噬具有保护作用^[28]。

2018年, Li等^[29]通过RNAi结合RNA-seq和MS分析研究发现, TNIK在三阴性乳腺癌细胞(triple negative breast cancer cells, TNBC) 中受转录辅激活因子WBP2的正调控。WBP2可上调TNIK和GPS1的表达从而启动Wnt信号通路, 通过整合JNK和Wnt信号, 促进TNBC细胞的生长。Sato等^[30]发现了一种多靶点的抑制剂108600, 可以同时对CK2/TNIK/DYRK1三种激酶产生抑制, 对TNBC干细胞的生长具有明显的抑制并且能克服其化疗耐药性, 这为改善患者的预后治疗提供了重要的参考意义。

肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma, LSCC) 占肺癌的30%左右, 由于肺鳞癌细胞缺乏如EGFR等敏感基因的突变(约5%), 目前LSCC没有靶向药物。2020年, Torres-Ayuso等^[31]报道, 约50%的肺鳞癌细胞中存在TNIK基因的扩增, 发现TNIK可对Merlin蛋白进行多个位点的磷酸化, 进而激活下游的粘着斑激酶(FAK)。通过对TNIK小分子抑制剂的研究发现, NCB-0846可显著抑制肿瘤生长, 并提出了TNIK的催化活性是维持LSCC细胞生长的必要条件。由此可见, TNIK是肺鳞癌的靶向治疗的一个极具前景的靶点。

2021年, Hirozane等^[32]报道了TNIK在骨肉瘤(osteosarcoma, OS) 细胞中高表达, 并通过对代谢组学的分析, 发现对TNIK进行药理抑制后诱导了OS肿瘤细胞明显的代谢变化, 肿瘤细胞由正常的有氧糖酵解转为偏向于氧化磷酸化的代谢重编程来促进脂质的生成。OS细胞经抑制剂处理后, 脂质生成相关的因子表达升高, 同时, TNIK和与脂肪细胞有关的PARPγ存在互作的关系。

2019年, Lee等^[33]开发了一个基于质谱的基因组分析平台确认了TNIK是前列腺癌的潜在治疗靶点。

尽管TNIK干预诸多肿瘤发生、发展和预后的具体机制目前尚不清楚, 但目前研究表明TNIK对肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用, 并对其预后产生负面影响, 而抑制TNIK能显著地抑制肿瘤的生长和改善预后。因此, 开发TNIK小分子抑制剂不仅能提供探索TNIK在肿瘤发生发展中的作用机制的工具化合物, 而且对TNIK相关肿瘤的靶向治疗具有深远的意义。

2 TNIK小分子抑制剂研究进展

收起

如前所述, TNIK成为诸多肿瘤治疗的一个具有潜力的新靶点, 吸引了药物化学家们的极大兴趣, 过去十年已有30多个小分子抑制剂报道, 均处于临床前研究阶段(表 1)。根据与TNIK的ATP结合位点的化合物母核结构特点, 可将抑制剂分为单杂环类、苯并杂环类和稠杂环类。本文将从小分子发现策略、构效分析等方面分析TNIK小分子抑制剂研发状况。

2.1 单杂环母核小分子抑制剂

2.1.1 五元杂环母核小分子抑制剂

2013年, Uno等^[34]对一个含有10 000个靶向激酶的化合物库进行高通量筛选, 针对人重组TNIK, 鉴定得到了一系列噻唑类TNIK抑制剂, 对这些化合物进行优化, 得到了苗头化合物NCB-0001 (1, IC₅₀ = 8.6 nmol·L^-1, 图 3, 表 1)。以NCB-0001的氨基噻唑结构为基础, 进一步优化得到了一个强效的先导化合物N1662, 随后优化得到了高选择性的TNIK抑制剂N5355 (结构暂未披露), IC₅₀ = 3 nmol·L^-1[35]。N5355通过抑制Wnt信号显著抑制结直肠癌细胞增殖, 下调Wnt靶基因AXIN2的表达且未改变非激活性Wnt癌细胞中AXIN2的表达水平。此外, 用N5355处理TGF-β1刺激的癌细胞可抑制肿瘤细胞迁移, 这表明N5355还具有抑制肿瘤转移的潜力。

2014年, Kim等^[36]在研究人肺腺癌A549细胞中TGF-β1介导的上皮-间充质转化(EMT) 过程中, 发现KY-05009 (2, IC₅₀ = 9 nmol·L^-1) 对TGF-β1介导的EMT具有良好的抑制作用(图 3)。分子对接显示, KY-05009噻唑母核上的氮和苯氨基上的氢与铰链区的Cys108存在两个氢键相互作用, 这种氢键作用是KY-05009抑制TNIK作用的关键因素; 噻唑和苯甲酰胺与Leu160和Val170具有CH/π相互作用; 苯环位于Val31和Gly111之间, 稳定了CH/π相互作用的结合模式(图 4)。KY-05009并不抑制核TNIK蛋白水平的增加, 但抑制了TNIK与TCF4的结合。由于EMT是多条信号通路作用的结果, 抑制参与EMT过程的分子的功能可以控制肿瘤的转移。因此, 推测KY-05009对TNIK的抑制可能是通过抑制下游Smad和非Smad信号通路, 包括Wnt、NF-κB和MAP激酶通路等。

2019年, Chang等^[37]在专利中报道了一系列含3-氨基-5-苯基吡唑的化合物, 其中代表性的化合物如3和4 (图 5), 对SW620细胞的抑制活性IC₅₀分别为100和200 nmol·L^-1。从结构上来说, 跟噻唑类TNIK抑制剂不同的是中间的核心结构由噻唑更换为吡唑, 同时保留了能与Cys108形成氢键的仲胺结构。

Van等^[38]于2022年在其专利中同样报道了一系列含有吡唑母核的衍生物, 如TNK-002 (5) 和TNK-007 (6) (图 5)。IC₅₀分别为28和40 nmol·L^-1。

2.1.2 六元杂环母核小分子抑制剂

六元杂环母核的TNIK抑制剂报道相对较少。2013年, Ho等^[39]通过高通量筛选得到的苗头化合物7 (IC₅₀ = 65 nmol·L^-1, S(50) = 56%) [S(50)表示在1 μmol·L^-1浓度下, 对118个激酶中抑制达50%及以上的激酶所占百分比]。为了提高选择性, 将嘧啶通过骨架跃迁获得吡啶衍生物8 (IC₅₀ = 290 nmol·L^-1), 尽管活性降低约80%, 但对TNIK的选择性却提高。进一步对氨基吡啶进行优化得到了化合物9, 其对TNIK的活性(IC₅₀ = 6 nmol·L^-1) 和选择性[S(50) = 5.1%] 均得到改善(图 6)。分子模拟发现, 化合物7和9的母核有共同的结合模式, 即氨基嘧啶和氨基吡啶都能跟铰链区Phe107酰胺键的NH和Cys108的羰基形成氢键。不同的是, 化合物9的氰基直接连在苯环上, 结构比较固定, 不会与TNIK催化位点的Lys154形成氢键。氰基的位置使得化合物9的吡啶环和苯环能够与氨基酸残基Met105、Val170和Ala83结合更紧密, 并产生额外的疏水相互作用(图 7)。因此, 化合物9的活性更强, 选择性更高。

在对细胞活性的测试中发现, 这一系列化合物虽然表现出对TNIK的强效抑制(IC₅₀为纳摩尔水平), 但是对TCF4/β-catenin复合物激活引起的Wnt信号靶基因的转录并没有出现理想的抑制效果。进一步研究发现, 相对于对Wnt信号通路的激酶活性, TNIK其他方面的功能可能更重要, 例如在稳定TCF4/β-catenin转录复合物中的作用。

2.2 苯并杂环母核小分子抑制剂

2.2.1 苯并五元杂环母核小分子抑制剂

2016年, Tan等^[40]采用比较分子相似因子分析(comparative molecular similarity indices analysis, CoMSIA) 和分子对接工具, 对Uno等^[34]报道的氨基噻唑TNIK抑制剂进行了药效团解析, 并对1 448种FDA已批准上市的小分子药物进行了筛选评估, 发现驱虫药甲苯达唑(mebendazole, 10, 图 8) 在10 μmol·L^-1的浓度下可以选择性抑制91.8%的TNIK。与其他激酶相比, 甲苯达唑对TNIK显示出较高的选择性。通过细胞实验发现, 甲苯达唑对β-catenin激活的结肠癌和非小细胞肺癌细胞系表现出强大的细胞毒性, 这可能为结直肠癌和非小细胞肺癌的治疗提供了新的选择。

2016年, Chon等^[41]发现酪氨酸激酶抑制剂多韦替尼(dovitinib, 11, 图 8) 能够显著抑制TNIK与ATP (K_i = 13 nmol·L^-1) 的相互作用以及Wnt信号通路的效应因子, 如β-catenin和TCF4的激活。研究还发现TNIK在多发性骨髓瘤IM-9细胞中高表达, 在其他的血液瘤细胞中表达量相对较低。分子对接显示, 多韦替尼在TNIK的铰链区与E106和C108有三种氢键相互作用, 这是其抑制TNIK的关键。进一步研究发现多韦替尼与TNIK的ATP口袋结合, 抑制其激酶活性, 进而影响IM-9细胞的增殖。该研究首次揭示了TNIK的内源性调控与多发性骨髓瘤细胞的增殖有关。2017年, Lee等^[42]通过进一步研究发现, TNIK小分子抑制剂KY-05009与多韦替尼联用, 协同抑制白介素-6 (IL-6) 诱导的多发性骨髓瘤(MM) 细胞的增殖, 诱导细胞凋亡。

OBD9 (12, 图 8) 是苯并咪唑类化合物甲苯达唑的环氧丙烷衍生物, OBD9是基于甲苯达唑筛选得到的强效抗结直肠癌小分子, 对HCT116和SW620两种细胞系在1 μmol·L^-1浓度时已展现出较强的细胞毒性(细胞活力 < 50%), 同时其改善了甲苯达唑溶解度较差的缺点, 溶解度增加了100倍。OBD9还展现了良好的药代动力学性质, 对小鼠进行口服给药(15 mg·kg^-1), 血浆浓度在1 h达到顶峰, 药物消除缓慢, 在8~24 h仍能检测到, 口服生物利用度为73.1%。在观察到OBD9对TNIK的催化活性并未产生强效抑制后, 进一步研究发现OBD9介导TNIK的自噬降解抑制结直肠癌, 在小鼠的肿瘤异种移植模型中, OBD9也表现出了良好的体内活性和安全性^[43]。

Masuda等^[6]发现化合物PD407824 (13, 图 8) 对TNIK具有很强的抑制活性(IC₅₀ = 0.7 nmol·L^-1)。对PD407824与TNIK的晶体复合物(PDB: 2X7F) 分析发现, 琥珀酰亚胺基团与铰链区的Cys108酰胺的N-H和Glu106的碳基O之间分别形成氢键。此外, 酚羟基与Cys108的主碳链上的羰基也存在氢键作用(图 9)。

2.2.2 苯并六元杂环母核小分子抑制剂

2016年, Masuda等^[44]通过筛选并进行结构优化得到的TNIK小分子抑制剂NCB-0846 (14, IC₅₀ = 21 nmol·L^-1) 与其对映体NCB-0970 (15, IC₅₀ = 272 nmol·L^-1), 两者活性相差10倍, 原因在于NCB-0846环己二醇的羟基能与Gln157主碳链上的羰基形成氢键, 而非对映异构体NCB-0970上的羟基却削弱了这种氢键作用(图 10和11)。对结合和未结合配体的TNIK激酶结构域研究发现, NCB-0846结合的TNIK处于非活性构象(DFG-out), 而具有4-苯基-2-苯氨基吡啶母核类化合物如化合物7~9结合的TNIK处于活性构象(DFG-in)。这解释了4-苯基-2-苯氨基吡啶母核类化合物能抑制TNIK的酶活性, 但是对Wnt信号通路的抑制却很弱的原因。因此, 简单通过一个小分子来占据ATP结构域不足以完全抑制TNIK的功能。通过用NCB-0846处理来源于原发性结直肠癌患者, 直接培养的肿瘤球状体, NCB-0846能显著抑制球状体的体外生长。NCB-0846在动物实验中所展现的抗肿瘤效果也十分理想。口服NCB-0846对人源的结直肠癌异种移植模型小鼠的肿瘤生长产生了强烈的抑制, 其抑制效果与TNIK的shRNA (small-hairpin RNA) 组相当。研究还发现NCB-0846的选择性较差, 能同时靶向多个激酶如FLT3、JAK3等, 因此开发高选择性TNIK抑制剂是一个重要的研究方向。

2021年, Buchl等^[45]发现TNIK作为抗肝纤维化的潜在靶点。采用NCB-0846处理四氯化碳诱导肝纤维化的小鼠, 对全肝mRNA的qPCR分析显示, NCB-0846处理后, 四氯化碳的诱导作用消失。数据表示, 抑制TNIK的激酶活性可以抑制小鼠肝纤维的生成。

2023年, Wang等^[46]报道了TNIK小分子抑制剂NCB-0846用于癫痫治疗的研究。研究发现, TNIK在颞叶性癫痫患者和癫痫大鼠模型中高表达。在癫痫大鼠模型中采用NCB-0846处理后, 可以明显延迟神经元的放电, 降低癫痫的危害程度。诸多数据表明, TNIK可能是癫痫治疗的潜力靶点, 但TNIK参与癫痫的发病机制有待进一步研究。

2019年, Coburn等^[47]在专利中报道了一系列对TNIK有较好的抑制活性的苯并嘧啶类衍生物, 代表化合物为16~19 (图 11)。其中18和19为环状化合物, 对TNIK的半数抑制浓度均在纳摩尔水平。专利还报道了一系列PROTAC分子(如20、21), 但未披露其对TNIK的降解活性。

2021年, Sato等^[30]报道了多激酶抑制剂ON108600 (22) 同时抑制CK2/TNIK/DYRK1 (TNIK IC₅₀ = 5 nmol·L^-1) 来抑制紫杉醇耐药的TNBC细胞的生长与存活。研究结果表明, ON108600的多重抑制可能是克服TNBC紫杉醇耐药的有效途径(图 12)。

2.3 稠杂环母核的小分子抑制剂

2.3.1 五元并五元杂环母核小分子抑制剂

2016年, Choi等^[48]对TNIK、IKKE和TBKI进行筛选时发现一系列吡唑衍生物, 如化合物23 (IC₅₀ = 48 nmol·L^-1) 和24 (IC₅₀ = 49 nmol·L^-1) 对TNIK具有很强的抑制活性(图 13)。同时, 这些化合物对激酶TBKI和IKKE也展现出较好的抑制活性(细胞抑制活性未披露)。

2.3.2 五元并六元杂环母核小分子抑制剂

2021年, Yang等^[49]通过对一个自建的蛋白激酶抑制剂化合物库进行筛选, 发现含1H-吡咯[2,3-b]吡啶骨架的化合物25对TNIK有很显著的抑制作用, IC₅₀为9.2 nmol·L^-1。分子对接结果表明, 两个芳香环Ar1 (左) 和Ar2 (右) 分别指向溶剂区和后口袋。后续修饰主要集中于两个芳香环。在Ar2间位引入氰基得到了化合物26, 其活性显著增加, 继续对化合物26进行对接研究, 氰基指向结构化的水分子, 进一步与Glu69和Phe172残基形成氢键作用。在另一个间位位点引入甲磺酰胺基团得到化合物27, 进一步增强了对TNIK的抑制(图 14A)。

2022年, Li等^[50]报道了一系列具有3,4-二氢-1,4-苯并氧氮杂卓-5(2H)-酮的新结构TNIK抑制剂。研究团队首先通过虚拟筛选得到了苗头化合物28, IC₅₀ = 1 337 nmol·L^-1。紧接着, 对该化合物的苯甲酰胺(区域I)、氮杂吲哚(区域Ⅱ) 和甲氧基苯(区域Ⅲ) 三个区域分别进行结构优化, 最终得到活性最好的化合物29 (IC₅₀ = 26 nmol·L^-1, 图 14B)。对化合物29和TNIK结合的结构进行分析发现, 其活性最佳的原因在于29的7-氮杂吲哚与铰链区残基Cys108和Glu106分别形成氢键作用。29中的羰基氧与Asp115形成另一个氢键。值得一提的是, 七元环也限制了4-氟苯基的取向, 使其延伸到由残基Ala110、Ile306和Leu116组成的疏水口袋中。随后采用小鼠HCT116异种移植模型进行体内活性测试, 发现当剂量为150 mg·kg^-1时, 肿瘤生长受到显著抑制, 在给药期间, 没有观察到明显的体重减轻。进一步的动物实验中发现29的半衰期(t_1/2) 为5.56 ± 2.92 h且具有良好的生物利用度, 为50.41% ± 18.13%, 这表明29具有良好的药代动力学特性, 是一个安全高选择性的TNIK小分子抑制剂。

随后, Luo等^[51]在虚拟筛选过程中还发现了一系列苯并[d]恶唑-2(3H)-酮衍生物类TNIK小分子抑制剂。苗头化合物30对TNIK的抑制活性为IC₅₀ = 610 nmol·L^-1。对苗头化合物30的铰链区和疏水区进行了进一步的结构优化, 发现1H-吡咯[2,3-b]吡啶为铰链区的最佳选择(31), 其次将4位取代的氟优化为3位取代的甲氧基苯基得到32, IC₅₀ = 50 ± 6 nmol·L^-1 (图 14C)。对接结果显示, 32占据了TNIK的ATP结合位点, 并且氮杂吲哚与TNIK上的Cys108和Glu106分别形成氢键。不同的是32上的苯并恶唑和氮杂吲哚分别跟Phe107形成了π-π相互作用。32上的3-甲氧苯基不仅占据了疏水口袋, 甲氧基还与Gly109、Glu163和Ile306形成了疏水相互作用。体外细胞实验发现32对结直肠癌细胞HCT116表现出一定的抑制活性, IC₅₀ = 4 997 nmol·L^-1, 且具有一定的选择性。32具有很强的抑制HCT116细胞体外迁移能力, 且以浓度依赖的方式抑制细胞核中β-catenin和TCF-4的蛋白水平, 即抑制Wnt信号通路。

2020年, Arokiaraj等^[52]通过高通量虚拟筛选TNIK的抑制剂, 发现了6个含吡唑并嘧啶或酰肼母核结构的潜在苗头化合物, 通过密度泛函理论(density functional theory, DFT) 和分子动力学(molecular dynamics, MD) 模拟等相关计算研究了6个分子的结合效果和结构稳定性。根据结果和评分发现, 苗头化合物33 (图 15) 对TNIK蛋白有很高的结合亲和力和相互作用模式, 其对TNIK的抑制均高于对照且效果良好, IC₅₀为30.12 ± 0.55 nmol·L^-1。

2.3.3 六元并六元杂环母核小分子抑制剂

中药活性成分药根碱(jatrorrhizin, 34) 于2019年被报道可以抑制TNIK从而达到抑制乳腺癌细胞的增殖(图 16)^[53]。研究结果表明, 药根碱靶向TNIK可以同时有效抑制乳腺癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路和EMT的表达, 从而达到抑制肿瘤细胞的扩增和转移, 可能为乳腺癌治疗提供了新方法。

3 总结与展望

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截至目前, 已经报道了30多个具有多种骨架结构的TNIK小分子抑制剂。从小分子抑制剂和TNIK结合的晶体结构来看, 小分子抑制剂主要结合在ATP结合口袋。从结构上, 要发挥显著的抑制活性, 小分子抑制剂中需具备这样的结构特性, 即能与TNIK铰链区中的关键氨基酸残基如Cys108、Glu106、Phe107等形成氢键或者π-π相互作用。此外, 结构中还应该具有合适的基团, 能够很好地占据TNIK的疏水口袋。已报道的各类化合物中活性最强的是PD407824, IC₅₀达到了亚纳摩尔级别, 但是尚没有化合物进入临床试验, 主要原因可能是由于严重的脱靶效应、选择性差和药代动力学性能不适合, 同时, 鉴于TNIK的生物学功能正在被不断探索拓展。因此, 提高化合物对TNIK的靶向选择性将是小分子抑制剂研发的重要方向。

虽然很多TNIK抑制剂在体外实验中显示出很好的抑制活性, 但对Wnt及相关通路却没有产生抑制。这也可能是TNIK小分子抑制剂在动物水平未观察到良好的抗肿瘤效果的一个主要原因。总的来说, TNIK的生物学功能还有很多未知的地方。

为了开发在临床上具有应用价值的TNIK抑制剂, 以下几个方向值得进行探索: ① TNIK的生物学功能以及在各种通路中具体的作用目前还不是很清楚, TNIK的生物学功能需进一步挖掘; ②以TNIK与ATP结合的位点作为小分子抑制剂的结合口袋还需进一步优化, 并发展以TNIK结构中其他未知的结合口袋(如变构位点) 为结合位点的抑制剂; ③目前肿瘤的临床治疗越来越多地趋向于多种不同治疗策略的联合使用, 联合TNIK小分子抑制剂的治疗探索目前几乎是空白, 未来可能需要更多的关注, 例如与免疫治疗的联合, 已有研究证明TNIK能增强免疫细胞的响应^[54]; ④新技术的应用方面, 蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera, PROTAC) 技术也是颇具潜力的抗肿瘤治疗方向, 尽管PROTAC存在分子量较大、透膜性较差等诸多缺点, 但其在TNIK上的应用价值仍然值得探索。目前已有专利报道相关PROTAC的合成, 但活性数据暂未披露, 相信在将来会有更多的PROTAC分子被研发, 以此验证PROTAC在TNIK领域内的应用前景。

不论是TNIK生物机制的探索, 还是小分子抑制剂或降解剂的开发, 都在不断推进人们对TNIK的认识, TNIK有望成为人类抗肿瘤的漫漫长路中的又一希望。

作者贡献: 陈梦销撰写全文及绘制图表; 何毅和聂神有提供综述的全文思路和结构; 所有作者共同参与了文章的撰写及修改。

利益冲突: 本文作者声明没有利益冲突。

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国家自然科学基金面上项目(22177017)
重庆市博士“直通车”项目(sl202100000610)

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2024年第59卷第5期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1095

接收时间：2023-09-22
首发时间：2025-11-27
出版时间：2024-05-12

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收稿日期：2023-09-22
修回日期：2024-02-19

基金

国家自然科学基金面上项目(22177017)

重庆市博士“直通车”项目(sl202100000610)

作者信息

1.重庆医科大学生命科学研究院, 新靶标与化学干预教育部医药基础研究创新中心, 重庆 400016

2.重庆医科大学附属第二医院泌尿外科, 重庆 400010

通讯作者:

^*何毅, Tel: 15123805327, E-mail: heyisky@cqmu.edu.cn;

聂神有, Tel: 18602128026, E-mail: nieshenyou@cqmu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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