药学学报


14a	36.9 ± 4.3	0.62 ± 0.01		16i		90.0 ± 8.7	58.9 ± 3.2
16a	148.6 ± 66.8	61.6 ± 14.9	16j		106.0 ± 16.3	23.7 ± 2.1
16b	255.0 ± 46.7	83.6 ± 1.7	16k		59.2 ± 12.4	35.4 ± 2.6
16c	18.2 ± 1.4	10.7 ± 23.6	16l		46.4 ± 7.1	0.11 ± 0.00
16d	43.3 ± 3.2	4.92 ± 2.4	16m		1.5 ± 0.1	3.1 ± 0.3
16e	14.9 ± 0.3	14.3 ± 0.3	16n		21.2 ± 2.5	27.3 ± 2.1
16f	10.5 ± 0.2	8.4 ± 0.8	16o		8.8 ± 0.1	10.5 ± 0.4
16g	572.0 ± 272.0	218.0 ± 191.0	16p		132.0 ± 27.1	280.0 ± 11.1
16h	373.0 ± 31.3	118.0 ± 2.6


14a	36.9 ± 4.3	0.62 ± 0.01		16i		90.0 ± 8.7	58.9 ± 3.2
16a	148.6 ± 66.8	61.6 ± 14.9	16j		106.0 ± 16.3	23.7 ± 2.1
16b	255.0 ± 46.7	83.6 ± 1.7	16k		59.2 ± 12.4	35.4 ± 2.6
16c	18.2 ± 1.4	10.7 ± 23.6	16l		46.4 ± 7.1	0.11 ± 0.00
16d	43.3 ± 3.2	4.92 ± 2.4	16m		1.5 ± 0.1	3.1 ± 0.3
16e	14.9 ± 0.3	14.3 ± 0.3	16n		21.2 ± 2.5	27.3 ± 2.1
16f	10.5 ± 0.2	8.4 ± 0.8	16o		8.8 ± 0.1	10.5 ± 0.4
16g	572.0 ± 272.0	218.0 ± 191.0	16p		132.0 ± 27.1	280.0 ± 11.1
16h	373.0 ± 31.3	118.0 ± 2.6

Parameter	i.v. (1 mg·kg^-1)	po (10 mg·kg^-1)
C_max /ng·mL^-1	1 060 ± 17	996 ± 361
t_max /h	0.03 ± 0.00	0.83 ± 0.29
AUC_0-∞ /h·ng·mL^-1	567 ± 76	4 465 ± 1 822
t_1/2 /h	0.51 ± 0.08	3.56 ± 1.58
CL /mL·h^-1·kg^-1	1 784 ± 223	2 620 ± 1 399
V_z /L·kg^-1	1.3 ± 0.15	12.78 ± 6.05
F /%	–	78.7 ± 32.1

Parameter	i.v. (1 mg·kg^-1)	po (10 mg·kg^-1)
C_max /ng·mL^-1	1 060 ± 17	996 ± 361
t_max /h	0.03 ± 0.00	0.83 ± 0.29
AUC_0-∞ /h·ng·mL^-1	567 ± 76	4 465 ± 1 822
t_1/2 /h	0.51 ± 0.08	3.56 ± 1.58
CL /mL·h^-1·kg^-1	1 784 ± 223	2 620 ± 1 399
V_z /L·kg^-1	1.3 ± 0.15	12.78 ± 6.05
F /%	–	78.7 ± 32.1

吡唑并嘧啶类PI3Kγ/δ抑制剂的合成及抗肿瘤活性研究

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邓茂青 ¹^,² , 邹凤鸣 ¹^,³ , 齐紫平 ¹^,³ , 王纯 ¹^,² , 龙凯丽 ¹^,² , 刘青旺 ¹^,³ , 王傲莉 ¹^,³ , 刘静 ¹^,²^,³^,^* , 梁小飞 ¹^,²^,³^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(7): 2041-2052

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(7): 2041-2052

吡唑并嘧啶类PI3Kγ/δ抑制剂的合成及抗肿瘤活性研究

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邓茂青¹^,², 邹凤鸣¹^,³, 齐紫平¹^,³, 王纯¹^,², 龙凯丽¹^,², 刘青旺¹^,³, 王傲莉¹^,³, 刘静¹^,²^,³^,^*, 梁小飞¹^,²^,³^,^*

作者信息

1.中国科学院, 合肥物质科学研究院健康与医学技术研究所, 安徽合肥 230031

2.中国科学技术大学, 安徽合肥 230026

3.中国科学院合肥肿瘤医院, 安徽合肥 230031

通讯作者:

^*刘静, E-mail: jingliu@hmfl.ac.cn;

梁小飞, E-mail: xiaofeiliang@hmfl.ac.cn

Synthesis and anti-tumor activity of pyrazole pyrimidine PI3Kγ/δ inhibitors

Mao-qing DENG¹^,², Feng-ming ZOU¹^,³, Zi-ping QI¹^,³, Chun WANG¹^,², Kai-li LONG¹^,², Qing-wang LIU¹^,³, Ao-li WANG¹^,³, Jing LIU¹^,²^,³^,^*, Xiao-fei LIANG¹^,²^,³^,^*

Affiliations

1. Institute of Health and Medical Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China

2. University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China

3. Hefei Cancer Hospital, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China

出版时间: 2024-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0112

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摘要

收起

PI3Kγ和PI3Kδ在免疫系统中有重要的调控作用, 靶向这两个亚型有助于重塑肿瘤微环境。PI3Kγ和PI3Kδ是肿瘤免疫治疗的潜在靶点, 本研究在前期工作的基础上, 设计合成了16个新型吡唑并嘧啶类化合物并发现了PI3Kγ/δ双重抑制剂16l。体外研究表明, 化合物16l在蛋白和细胞水平具有良好的活性和选择性。在蛋白层次16l对PI3Kγ和PI3Kδ的抑制活性分别为0.11和0.79 nmol·L^-1; 在细胞层次16l抑制PI3K Akt S473的磷酸化, 对PI3Kγ和PI3Kδ的抑制活性分别为3和7 nmol·L^-1。体内研究表明, 在Sprague-Dawley (SD) 大鼠上, 化合物16l具有良好的药代动力学性质。在MC38同种移植小鼠模型上, 化合物16l能够激活小鼠的免疫系统, 并显著抑制肿瘤生长。动物实验得到了中国科学院合肥物质科学研究院动物伦理委员会的批准(批准号: DWLL-2000-06)。同时, 人类ether-a-go-go相关基因(human ether-a-go-go-related gene, hERG) 实验表明16l没有明显的潜在心脏毒性。本研究为深入了解PI3Kγ/δ的病理和生理功能提供了工具分子, 为靶向PI3Kγ/δ的小分子免疫治疗药物的研发提供了苗头化合物。

关键词

PI3Kγ / PI3Kδ / 肿瘤微环境 / 吡唑并嘧啶 / 抗肿瘤

Abstract

收起

PI3Kγ and PI3Kδ have important regulatory roles in the immune system, and targeting these two subtypes helps to reshape the tumor microenvironment. PI3Kγ and PI3Kδ are potential targets for tumor immunotherapy. In this study, a series of new pyrazolopyrimidine derivatives were designed and synthesized on the basis of our previously reported PI3K inhibitors, resulting in the discovery of compound 16l as a potent and selective PI3Kγ/δ dual inhibitor. Compound 16l demonstrated strong biochemical potencies against PI3Kγ and PI3Kδ with IC₅₀ values of 0.11 and 0.79 nmol·L^-1. In cell-based assays, it potently inhibited the PI3Kγ and PI3Kδ mediated Akt S473 phosphorylation with EC₅₀ values of 3 and 7 nmol·L^-1. In vivo, compound 16l exhibited acceptable pharmacokinetic properties in Sprague-Dawley (SD) rats and suppressed the tumor growth in a MC38 syngeneic mouse model. The animal experiments were approved by the Animal Ethics Committee of Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences (approval number: DWLL-2000-06). In addition, no appreciable human ether-a-go-go-related gene (hERG) inhibition was observed for compound 16l even at 30 μmol·L^-1. These results suggested that compound 16l might be a potential research tool for studying the PI3Kγ/δ mediated signaling pathways.

Key words

PI3Kγ / PI3Kδ / tumor microenvironment / pyrazolo pyrimidine / anti-tumor

引用本文

邓茂青, 邹凤鸣, 齐紫平, 王纯, 龙凯丽, 刘青旺, 王傲莉, 刘静, 梁小飞. 吡唑并嘧啶类PI3Kγ/δ抑制剂的合成及抗肿瘤活性研究. 药学学报, 2024 , 59 (7) : 2041 -2052 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0112

Mao-qing DENG, Feng-ming ZOU, Zi-ping QI, Chun WANG, Kai-li LONG, Qing-wang LIU, Ao-li WANG, Jing LIU, Xiao-fei LIANG. Synthesis and anti-tumor activity of pyrazole pyrimidine PI3Kγ/δ inhibitors[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (7) : 2041 -2052 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0112

正文

收起

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3Ks) 属于脂质激酶家族, 是PI3K/蛋白激酶B (Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR) 信号通路的关键调节分子, 与人类癌症的发生发展密切相关^{[1, 2]}。PI3K能够使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2) 上的3′-羟基磷酸化形成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)。PIP3是第二信使, 可以继续激活Akt等下游一系列信号通路^[3]。根据底物差异和序列同源性PI3K分为三类(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类), 共八种亚型。人们对Ⅰ类PI3K的研究最为深入, 根据调控模式的差异, Ⅰ类PI3K进一步分为Ⅰ A类(PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ) 和Ⅰ B类(PI3Kγ)^[4]。PI3Kα在细胞中普遍表达, 是胰岛素信号的关键调节分子^[5]。PI3K抑制剂在临床上出现的高血糖、高胰岛素血症等不良反应与抑制PI3Kα有关^[6]。PI3Kδ主要在造血细胞和免疫细胞中表达, 是B细胞和T细胞功能的关键调节因子。PI3Kδ介导肿瘤内T细胞的活化, 抑制PI3Kδ能够发挥免疫激活作用^{[7, 8]}。PI3Kγ主要在T淋巴细胞和白细胞中表达, 是控制肿瘤微环境中巨噬细胞极化转换的关键分子^[9]。抑制PI3Kγ能够调节肿瘤微环境, 促进抗肿瘤免疫的激活, 从而使肿瘤消退^{[10, 11]}。PI3Kγ和PI3Kδ对肿瘤微环境的形成都有着重要作用, 联合抑制PI3Kγ和PI3Kδ可能比单独抑制任何一种亚型更加有效^{[12, 13]}。

IPI-145在2018年被美国FDA批准用于治疗复发/难治性慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤以及滤泡性淋巴瘤, 是目前唯一一款上市的PI3Kγ/δ双重抑制剂, 其对PI3Kγ和PI3Kδ的抑制活性(IC₅₀) 分别为27和2.5 nmol·L^-1^[14](图 1)。BR-101801是由Boryung公司研发的一款PI3Kγ/δ抑制剂, 目前正在进行适应症为B细胞慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤的Ⅰ期临床研究^[15]。此外, 还有多种PI3Kγ和PI3Kδ的小分子抑制剂正处于临床前或药物发现研究阶段。

研究表明, IPI-145在临床使用中出现了严重腹泻、肝毒性、结肠炎和肺部炎症等不良反应^[16]。因此, 在临床治疗中仍然需要高效和安全的PI3K抑制剂。前期研究发现, 吡唑并嘧啶类化合物14a对PI3Kγ和PI3Kδ具有较强的抑制活性(IC₅₀值分别为0.62和4.63 nmol·L^-1), 但同时其对PI3Kα也具有较强的活性(IC₅₀值为36.9 nmol·L^-1)^[17]。14a的结构由吡唑并嘧啶母核、二甲氧基取代的吡啶基和邻位氨基取代的吡啶基构成。邻位氨基取代的吡啶基靠近PI3K激酶ATP结合口袋的疏水区域Ⅱ, 该位置对于选择性PI3K抑制剂的研发至关重要^[18]。因此, 本研究在14a的结构基础上, 主要针对吡啶基侧链的邻位进行结构优化, 旨在为靶向PI3Kγ/δ的肿瘤免疫治疗药物研发提供苗头化合物。

结果与讨论

收起

1 抑制剂合成

各中间体的合成如路线1所示。2-溴-6-溴甲基吡啶通过亲电取代反应与NaN₃反应生成中间体2; 中间体2通过点击化学与炔基化合物反应生成中间体3。中间体5是由2, 6-二溴吡啶与硼酸酯发生Suzuki-Miyaura偶联反应得到。中间体7是由2-溴-6-乙炔基吡啶与叠氮化合物通过点击化学反应生成。中间体9是由6-溴-2-吡啶甲酸8与胺类化合物通过酰胺化缩合生成。

目标化合物16a~16p的合成参考已报道路线^[17] (路线2)。以1H-吡唑-3,5-二胺(10) 为起始原料, 与1,3-二甲基脲嘧啶环化生成2-氨基吡唑[1,5-a]嘧啶- 5(4H)-酮 (11)。化合物11经乙酸酐保护后得到化合物12, 12与POCl₃进行氯化反应得到N-(5-氯吡唑[1,5-a]嘧啶-2-基)乙酰胺(13), 13用4 mol·L^-1盐酸的乙酸乙酯溶液脱乙酰基得到5-氯吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(14)。化合物14经Suzuki-Miyaura偶联反应得到5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(15)。15与中间体3、5、7、9经Buchwald-Hartwig交叉偶联反应得到目标化合物16。目标化合物经¹H NMR、¹³C NMR和ESI-MS确证其结构。

2 生物活性研究

在前期研究中, 当这系列化合物吡啶基侧链的邻位引入不同取代基时, 获得的化合物大都对PI3Kδ具有较强的抑制活性, 而对PI3Kα和PI3Kγ的抑制活性变化显著。因此, 本研究在初步评价中首先通过ADP-Glo激酶检测试剂盒考察了新合成的化合物16a~16p对于PI3Kα和PI3Kγ亚型的抑制活性(表 1)。在化合物14a的吡啶邻位引入取代的吡咯烷基后, 化合物16a、16b对PI3Kα和PI3Kγ的抑制活性明显下降。在化合物14a的吡啶邻位引入取代的五元杂环, 比如取代的吡唑(16c、16d) 和三氮唑(16e、16f), 对于PI3Kα的抑制活性有所提升, 但对PI3Kγ的抑制活性有所减弱。当三氮唑上有较大的基团时(16g), 会导致其对PI3Kα和PI3Kγ的抑制活性大幅降低。此外, 在化合物14a的吡啶邻位引入取代的六元杂环(16h、16i) 也会导致对PI3Kα和PI3Kγ的抑制活性大幅降低。这说明PI3K与小分子结合部位的空间大小有限, 尽管该结合部位的空间能较好地容纳五元杂环, 但是当取代基过长或过大时会影响对PI3K的抑制活性。在化合物14a的吡啶邻位引入较大的酰胺基团(16j、16k) 会明显降低新化合物对PI3Kα和PI3Kγ的抑制活性, 但在引入链状酰胺时, 化合物16l对PI3Kγ的抑制活性和对PI3Kα的选择性均有显著提升。在取代的三氮唑与吡啶之间延长一个亚甲基后获得化合物16m~16p, 它们对PI3Kγ的抑制活性变化与化合物16e~16g基本一致。

在上述化合物中, 16l对PI3Kγ具有较强的抑制活性(IC₅₀ = 0.11 nmol·L^-1), 同时对PI3Kα表现出一定的选择性(IC₅₀ = 46.4 nmol·L^-1)。因此, 又进一步检测了16l对PI3Kδ和PI3Kβ亚型的抑制活性, 得到的IC₅₀值分别为0.79和26.14 nmol·L^-1, 说明在蛋白水平16l对PI3Kδ有较强的活性, 并且对PI3Kβ也有一定的选择性。

接下来, 在一系列PI3K亚型特异性的细胞上分别检测了化合物16l对于PI3Kα、β、γ和δ四种亚型的抑制活性(图 2)。在RAW264.7细胞中, 16l能够显著抑制PI3Kγ介导的Akt S473的磷酸化, 并且其在Raji细胞中能够显著抑制PI3Kδ介导的Akt S473的磷酸化。在SK-OV-3细胞中, 16l对PI3Kα介导的Akt S473磷酸化具有中等抑制活性。而在786-O细胞中, 16l对PI3Kβ介导的Akt S473磷酸化具有较弱的抑制作用。这些研究结果表明, 在细胞水平, 化合物16l对于PI3Kγ和PI3Kδ亚型具有显著的抑制活性, 同时对PI3Kα和PI3Kβ亚型具有较好的选择性。

3 化合物16l的结合模式研究

为了解化合物16l与PI3Kγ和PI3Kδ间的相互作用, 分子对接被用来探索16l与PI3Kγ (PDB: 6C1S) 和PI3Kδ (PDB: 6EZ6) 的结合模式(图 3)。分析结果显示, 16l位于PI3K的ATP结合口袋内, 吡唑并吡啶母核与PI3Kγ的主链原子Val882形成氢键相互作用(图 3A) (在PI3Kδ中为Val828, 图 3B), 二甲氧基取代的吡啶上的甲氧基与PI3Kγ的Lys833的侧链形成氢键(图 3A) (在PI3Kδ中为Lys779, 图 3B), 另一侧吡啶基延伸到溶剂暴露区, 羰基与PI3Kγ的Lys890侧链形成氢键结合(图 3A) (在PI3Kδ中为Asn836, 图 3B)。这些相互作用是保持化合物16l对PI3Kγ和PI3Kδ抑制活性的主要因素。

4 化合物16l的药代动力学性质和心脏安全性研究

在随后的实验中, SD大鼠被随机分为两组, 每组3只, 采用单剂量单次给药方案, 一组将化合物16l以1 mg·kg^-1剂量进行静脉注射给药, 另一组以10 mg·kg^-1剂量进行灌胃给药, 检测化合物16l的药代动力学参数。研究结果显示, 在10 mg·kg^-1的剂量下通过口服给药时, 16l表现出较低的体内清除率(CL)、适当的半衰期(t_1/2)、较好的血浆暴露(AUC_0-∞), 以及良好的口服生物利用度(F) (表 2)。这些数据初步表明, 化合物16l具有良好的药代动力学性质, 适宜通过口服给药的方式进行后续的体内药效研究。

另外, hERG电生理膜片钳测试的结果显示, 16l对hERG钾通道没有明显的抑制作用(IC₅₀ > 30 μmol·L^-1), 意味着该化合物没有明显的潜在心脏毒性。

5 化合物16l的体内药效评价

基于化合物16l良好的体外活性以及药代动力学性质, 进一步在MC38同种移植小鼠模型上分别采用1和3 mg·kg^-1的给药剂量口服连续给药30天, 然后评价16l的体内抗肿瘤药效(图 4)。实验结果显示, 不同给药剂量下小鼠的体重没有明显降低, 说明化合物16l具有较好的安全性(图 4A)。当化合物16l在1 mg·kg^-1剂量下连续给药30天, 对肿瘤生长的抑制率(tumor growth inhibition, TGI) 为43.1%, 而在3 mg·kg^-1剂量下16l的TGI可达到84.4%, 表明16l能够以剂量依赖性的方式抑制肿瘤生长(图 4B、C)。同时, 为了验证16l对体内免疫微环境的作用, 选取了小鼠脾脏组织样本通过细胞流式的方法进行检测, 结果表明16l在不同剂量下均可以激活脾脏中总T细胞、CD8⁺ T细胞(CTL细胞) 和NK细胞(图 4D)。此外, 在MC38同种移植小鼠模型上采用25 mg·kg^-1的口服给药剂量, 以连续给药30天后停药再接种的方式评价了16l对免疫系统的影响。在该实验中, 停药后观察到肿瘤持续消退的现象, 对于肿瘤完全消退的小鼠进行二次接种后发现, 与进行首次接种的正常小鼠相比, 其肿瘤生长明显受到抑制, 说明化合物16l给药激活的免疫系统具有免疫记忆功能(图 4E)。

6 小结

PI3Kγ和PI3Kδ影响肿瘤微环境的塑造, 是肿瘤免疫治疗的新靶点。本研究对化合物14a的吡啶基邻位取代基进行结构优化, 通过构效关系分析, 发现吡唑并嘧啶类化合物16l对PI3Kγ和PI3Kδ具有较强的抑制活性, 其IC₅₀分别为0.11和0.79 nmol·L^-1。在RAW264.7和Raji细胞中, 16l能够分别显著抑制PI3Kγ和PI3Kδ介导的Akt S473的磷酸化。在SD大鼠上的研究结果表明, 16l具有良好的药代动力学性质。此外, 16l以剂量依赖性的方式抑制MC38同种移植小鼠模型中的肿瘤生长。以上研究结果说明, 化合物16l是一种新型PI3Kγ/δ双重抑制剂, 可以为肿瘤免疫治疗小分子药物的研发提供苗头化合物。

实验部分

收起

N, N-二甲基甲酰胺(0HEEAE3A)、氢化钠(9LDDGR)、四氢呋喃(02RX1RTH)、二氧六环(99XQRTNU)、4,5-双二苯基膦-9, 9-二甲基氧杂蒽(ZMR8RRKX) 购于萨恩化学技术(上海) 有限公司; 维生素C钠(LE70R25)、四三苯基膦钯(LJ40X18)、N, N-二异丙基乙胺(LD60W14) 购于百灵威科技有限公司; 2, 6-二溴吡啶(K0HTKG38-WF3A)、6-溴-2-吡啶甲酸(BKV217)、HATU (EKY383)、1,3-二甲基嘧啶-2,4(1H, 3H)-二酮(BNY865) 购于上海毕得医药科技股份有限公司; 乙酸乙酯(20200617)、甲醇(20201207)、二氯甲烷(20201123)、无水硫酸钠(20200721)、碳酸铯(20200117)、无水乙醇(20200910)、乙酸酐(20200809)、无水碳酸钾(20201008) 购于天津市永大化学试剂有限公司; 叔丁醇(20180501JN) 购于上海润捷化学试剂有限公司; 乙醇钠(C13309631) 购于上海麦克林生化科技有限公司; 2-溴-6-溴甲基吡啶(批号: 20201219)、叠氮化钠(20210302)、三氯氧磷(20210105)、五水硫酸铜(20201104)、1H-吡唑-3,5-二胺(20201205) 购于安徽邦之丽化工有限责任公司; 硅胶购于青岛海洋化工有限公司; ADP-Glo激酶检测试剂盒(0000490667)、PI3Kα (0000505380)、PI3Kβ (0000257468)、PI3Kδ (0000318068)、PI3Kγ (0000505382)蛋白、底物PI3:PS (0000494068) 购于美国Promega公司; 蛋白酶抑制剂cocktail (KN129530) 购于陶素公司; RIPA裂解液(23096351) 购于Biosharp公司; NC膜(0000202633) 购于德国Millipore公司; ECL免疫印迹检测试剂盒(S8321120) 购于全式金公司; 肝素钠注射液(52208113) 购于江苏万邦生化医药集团有限公司; FITTC-NKp46 (2048914)、PE-CD19 (1172984)、PerCP-Cy5.5-CD8a (1076177)、APC-CD3 (1165670) 抗体购于美国BD公司; RPMI-1640培养基(20230713)、DMEM高糖培养基(20231110)、青链霉素双抗溶液(20231109) 购于江苏凯基生物技术股份有限公司; 三(羟甲基)氨基甲烷(G910BA0004)、甘氨酸(JB27BA0054)、十二烷基硫酸钠(I908BA0006)、吐温-20 (F419BA0004) 购于生工生物工程(上海) 股份有限公司; 胎牛血清FBS (1827594) 购于苏州依科赛生物科技股份有限公司; 快速凝胶试剂盒(037911200) 购于美国Epizyme公司。

核磁共振波谱仪(Bruker 500 MHz NMR, 美国Bruker公司); 质谱仪(Agilent 6224 TOF, 美国Agilent公司); 旋转蒸发仪(OSB-2200, 日本EYELA公司); 磁力加热搅拌器(RCT basic, 德国IKA公司); 流式细胞仪(cytoflex)、高速低温离心机(Allegra X-12), 美国Beckman Coulter公司; 恒温CO₂细胞培养箱(Heracell^TM 150i, 美国Thermo Scientific公司); Vortex涡旋混匀仪(MV-100, 武汉塞维尔生物科技有限公司); 低速台式离心机(CTL-420, 湖南湘立科学仪器有限公司)。

1 化合物的合成

1.1 2-(叠氮甲基)-6-溴吡啶(2)

将2-溴-6-溴甲基吡啶(500 mg, 2.0 mmol, 1.0 equiv) 溶解DMF (2 mL) 中, 然后加入叠氮化钠(155.4 mg, 2.4 mmol, 1.2 equiv), 反应在室温下搅拌3 h。反应结束后, 反应体系加入30 mL水, 然后用乙酸乙酯(3×30 mL) 萃取。合并有机层, 并用水(30 mL)、饱和食盐溶液(30 mL) 洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得粗品。粗品用硅胶柱纯化, 洗脱剂为甲醇/二氯甲烷, 洗脱梯度为0~5%。经提纯后产品是白色固体, 收率为94.0%。

1.2 2-溴-6-((4-环丙基-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)吡啶(3a)

将中间体2 (100 mg, 0.47 mmol, 1.0 equiv) 溶解于叔丁醇/水(1 mL/2 mL) 中, 依次加入3-甲基-1-丁炔(38.1 mg, 0.56 mmol, 1.2 equiv)、五水硫酸铜(1.2 mg, 0.004 7 mmol, 0.01 equiv)、维生素C钠(4.5 mg, 0.023 mmol, 0.05 equiv), 反应在室温下搅拌8 h。反应结束后, 反应体系加入30 mL水, 然后用乙酸乙酯(3×30 mL) 萃取。合并有机层, 并用水(30 mL)、饱和食盐溶液(30 mL) 洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得粗品。粗品用硅胶柱纯化, 洗脱剂为甲醇/二氯甲烷, 洗脱梯度为0~3%。经提纯后产品是淡黄色固体, 收率为65.2%。

化合物3b~3d按照化合物3a的合成方法进行合成。

1.3 (R)-1-(6-溴吡啶-2-基)-N, N-二甲基吡咯烷-3-胺(5a)

将2, 6-二溴吡啶(100 mg, 0.42 mmol, 1.0 equiv) 溶解于DMF (5 mL) 中, 在0 ℃下依次加入(R)-N, N-二甲基吡咯烷-3-胺(57.1 mg, 0.5 mmol, 1.2 equiv)、氢化钠(12 mg, 0.5 mmol, 1.2 equiv), 反应在室温下搅拌2 h。反应结束后, 反应体系加入20 mL水, 然后用乙酸乙酯(3×30 mL) 萃取。合并有机层, 并用水(30 mL)、饱和食盐溶液(30 mL) 洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得粗品。粗品用硅胶柱纯化, 洗脱剂为甲醇/二氯甲烷, 洗脱梯度为0~3%。经提纯后产品是白色固体, 收率为72.4%。

化合物5b~5f按照化合物5a的合成方法进行合成。

1.4 2-(4-(6-溴吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙烷-1-醇(7a)

将2-溴-6-乙炔基吡啶(100 mg, 0.55 mmol, 1.0 equiv) 溶解于叔丁醇/水(1 mL/2 mL) 中, 依次加入2-叠氮基乙醇(57.5 mg, 0.66 mmol, 1.2 equiv)、五水硫酸铜(1.4 mg, 0.005 5 mmol, 0.01 equiv)、维生素C钠(5.5 mg, 0.028 mmol, 0.05 equiv), 反应在室温下搅拌8 h。反应结束后, 反应体系加入20 mL水, 然后用乙酸乙酯(3×30 mL) 萃取。合并有机层, 并用水(30 mL)、饱和食盐溶液(30 mL) 洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得粗品。粗品用硅胶柱纯化, 洗脱剂为甲醇/二氯甲烷, 洗脱梯度为0~3%。经提纯后产品是白色固体, 收率为68.1%。

化合物7b、7c按照化合物7a的合成方法进行合成。

1.5 6-溴-N-(5-甲基异恶唑-3-基)吡啶酰胺(9a)

将6-溴-2-吡啶甲酸(100 mg, 0.5 mmol, 1.0 equiv) 溶解于THF (2 mL) 中, 加入HATU (228 mg, 0.6 mmol, 1.2 equiv)、DIPEA (174 μL, 1.0 mmol, 2.0 equiv)。随后, 在室温条件下加入3-氨基-5-甲基异恶唑(58.9 mg, 0.6 mmol, 1.2 equiv) 反应3 h。反应结束后, 反应体系加入20 mL水, 然后用乙酸乙酯(3×30 mL) 萃取。合并有机层, 并用水(30 mL)、饱和食盐溶液(30 mL) 洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得粗品。粗品用硅胶柱纯化, 洗脱剂为甲醇/二氯甲烷, 洗脱梯度为0~3%。经提纯后产品是白色固体, 收率为90.5%。

化合物9b、9c按照化合物9a的合成方法进行合成。

1.6 2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5(4H)-酮(11)

将1H-吡唑-3,5-二胺(20 g, 203.8 mmol, 1.0 equiv) 溶解于无水乙醇(560 mL) 中, 依次加入1,3-二甲基嘧啶-2, 4(1H, 3H)-二酮(57.1 g, 407.7 mmol, 2.0 equiv)、乙醇钠(44 g, 815.4 mmol, 4.0 equiv)。在氩气保护下, 反应体系加热到80 ℃反应14 h后冷却至室温。反应体系经减压过滤收集析出的固体, 固体用少量无水乙醇洗涤, 并干燥后得到淡黄色固体, 收率61.1%。

1.7 N-(5-氧代-4,5-二氢吡唑[1,5-a]嘧啶-2-基)乙酰胺(12)

将化合物11 (18.7 g, 124.5 mmol, 1.0 equiv) 逐渐溶解于乙酸酐(160 mL) 中, 室温搅拌14 h。反应结束, 反应体系浓缩、干燥得到呈微黄色固体粗产物, 收率90.7%。

1.8 N-(5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)乙酰胺(13)

0 ℃下, 将化合物12 (21.7 g, 112.9 mmol, 1.0 equiv) 缓慢溶于POCl₃ (120 mL) 中, 反应液加热到80 ℃反应1 h。反应液冷却至室温后经减压蒸馏除去POCl₃得初产物。在搅拌下, 将初产物加入冰水中, 然后缓慢加入K₂CO₃ (固体颗粒) 直至pH为8。混合物经减压过滤, 收集滤饼得粗产品。粗产品用减压硅胶柱层析进行纯化, 洗脱剂为甲醇/二氯甲烷, 洗脱梯度为0~5%, 得到淡黄色固体产品, 收率40.8%。

1.9 5-氯吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(14)

将化合物13 (9.7 g, 46.0 mmol, 1.0 equiv) 溶解于甲醇(20 mL) 中, 接着加入盐酸/乙酸乙酯溶液(4 mol·L^-1, 40 mL), 所得反应液在室温下搅拌24 h。反应结束后, 反应体系经减压浓缩, 然后加入饱和NaHCO₃溶液调节pH至8。混合液用乙酸乙酯(3×50 mL) 萃取。合并有机层, 并用水(50 mL)、饱和食盐溶液(50 mL) 洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得粗品。粗品用硅胶柱纯化, 洗脱剂为甲醇/二氯甲烷, 洗脱梯度为0~3%。经提纯后产品是黄色固体, 收率89.2%。

1.10 5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-胺(15)

将化合物14 (6.9 g, 40.9 mmol, 1.0 equiv) 溶解于1, 4-二氧六环/水(84 mL/21 mL) 中, 依次加入2, 3-二甲氧基-5-(4, 4, 5, 5-四甲基-1, 3, 2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶(13.0 g, 49.1 mmol, 1.2 equiv)、Pd(PPh₃)₄ (1.9 g, 1.6 mmol, 0.04 equiv) 和K₂CO₃ (11.3 g, 81.8 mmol, 2.0 equiv)。在氩气保护下, 反应液于90 ℃反应3 h。反应结束后, 反应体系加入100 mL水, 然后用乙酸乙酯(3×50 mL) 萃取。合并有机层, 并用水(50 mL)、饱和食盐溶液(50 mL) 洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得粗品。粗品用硅胶柱纯化, 洗脱剂为甲醇/二氯甲烷, 洗脱梯度为0~3%。经提纯后产品是黄色固体, 收率77.5%。

1.11 (R)-5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)-N-(6-(3-(二甲基氨基吡咯烷-1-基)吡啶-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-胺(16a)

将化合物15 (50 mg, 0.18 mmol, 1.0 equiv) 溶解于1, 4-二氧六环(2 mL) 中, 依次加入5a (24.3 mg, 0.09 mmol, 0.5 equiv)、Pd(PPh₃)₄ (21.3 mg, 0.018 mmol, 0.1 equiv)、xantphos (10.7 mg, 0.018 mmol, 0.1 equiv)、Cs₂CO₃ (120.1 mg, 0.36 mmol, 2.0 equiv)。在氩气保护下, 反应混合物加热到120 ℃反应3 h。反应结束后, 反应体系加入20 mL水, 然后用乙酸乙酯(3×30 mL) 萃取。合并有机层, 并用水(30 mL)、饱和食盐溶液(30 mL) 洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得粗品。粗品用硅胶柱纯化, 洗脱剂为甲醇/二氯甲烷, 洗脱梯度为0~3%。经提纯后产品是淡黄色固体, 收率为59.0%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 9.64 (s, 1H), 8.92 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.53 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.95 (s, 1H), 6.54 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.81~3.78 (m, 1H), 3.72~3.69 (m, 1H), 3.48~3.42 (m, 3H), 2.56 (s, 6H), 2.35~2.31 (m, 1H), 2.16~2.12 (m, 1H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 156.22, 155.95, 155.66, 153.45, 152.93, 148.43, 144.30, 139.00, 136.56, 135.05, 127.49, 115.93, 103.38, 98.36, 97.34, 84.79, 70.24, 64.76, 56.06, 53.97, 46.03, 42.64, 28.16. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₄H₂₈N₈O₂, 461.241 3; found, 461.241 5。

化合物16b~16p按照化合物16a的合成方法进行合成。

1.12 (R)-N-(6-(3-氨基吡咯烷-1-基)吡啶-2-基)-5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-胺(16b)

淡黄色固体, 收率为10.1%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 9.62 (s, 1H), 8.92 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.53 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.43 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.88 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.77~3.73 (m, 1H), 3.70~3.66 (m, 1H), 3.62~3.58 (m, 1H), 3.50~3.44 (m, 2H), 2.24~2.16 (m, 1H), 1.96~1.88 (m, 1H), 1.23 (s, 2H). HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₂H₂₄N₈O₂, 433.210 0; found, 433.210 4。

1.13 5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)-N-(6-(1-异丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-胺(16c)

淡黄色固体, 收率为32.1%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 9.90 (s, 1H), 8.96 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.56 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 8.01 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 4.63~4.55 (m, J = 6.6 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 1.49 (d, J = 6.6 Hz, 6H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 155.81, 155.74, 154.31, 153.21, 150.52, 148.45, 144.34, 138.60, 137.11, 136.65, 135.20, 127.46, 126.58, 123.16, 115.96, 111.25, 108.34, 103.54, 84.81, 56.11, 53.96, 53.64, 23.13. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₄H₂₄N₈O₂, 457.210 0; found, 457.210 2。

1.14 N-(6-(1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(16d)

淡黄色固体, 收率为26.9%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.03 (s, 1H), 8.99 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.56 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.01 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.93 (t, J = 58.9 Hz, 1H), 7.70 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 155.73, 155.54, 154.52, 153.24, 148.64, 148.45, 144.33, 141.19, 138.85, 136.68, 135.25, 127.64, 127.45, 125.88, 115.98, 112.09, 110.75 (t, J = 248.2 Hz), 109.82, 103.74, 84.88, 56.14, 53.97. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₂H₁₈F₂N₈O₂, 465.159 9; found, 465.160 3。

1.15 2-(4-(6-((5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙烷-1-醇(16e)

白色固体, 收率为16.5%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.05 (s, 1H), 8.98 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.56 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.01 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 5.13 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.54 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.86 (q, J = 5.3 Hz, 2H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 155.75, 155.59, 154.55, 153.22, 148.70, 148.47, 147.66, 144.34, 138.83, 136.70, 135.25, 127.49, 123.88, 116.09, 111.47, 110.35, 103.75, 84.99, 60.43, 56.17, 53.99, 52.81. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₂H₂₁N₉O₃, 460.184 6; found, 460.185 0。

1.16 5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)-N-(6-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-2-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(16f)

淡黄色固体, 收率为20.6%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.08 (s, 1H), 8.98 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.56 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.00 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.08 (s, 1H), 4.69 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.83 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.34 (s, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 155.75, 155.56, 154.56, 153.19, 148.54, 148.49, 147.85, 144.34, 138.83, 136.69, 135.23, 127.49, 123.79, 116.00, 111.43, 110.44, 103.76, 85.06, 70.73, 58.47, 56.10, 53.98, 49.85. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₃H₂₃N₉O₃, 474.200 2; found, 474.200 6。

1.17 N-(6-(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-2-基)-5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(16g)

淡黄色固体, 收率为8.6%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.06 (s, 1H), 8.98 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.57 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.74 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.42~7.39 (m, 4H), 7.37~7.33 (m, 1H), 7.28 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 5.75 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.95 (s, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 155.76, 155.55, 154.57, 153.21, 148.46, 148.44, 148.11, 144.35, 138.85, 136.73, 136.61, 135.28, 129.27, 128.63, 128.44, 127.49, 123.58, 116.08, 111.57, 110.53, 103.77, 85.03, 56.15, 54.00, 53.41. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₇H₂₃N₉O₂; 506.205 3; found, 506.205 4。

1.18 5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)-N-(6'-(三氟甲基)-[2,3'-联吡啶]-6-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(16h)

淡黄色固体, 收率为20.9%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.24 (s, 1H), 9.01 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.94 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.56 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 8.40 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.88 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.58~7.56 (m, 2H), 6.92 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 155.76, 155.28, 154.73, 153.36, 151.50, 150.61, 148.59, 148.41, 147.86 (q, J = 34.0 Hz), 144.30, 139.46, 136.64, 135.32, 127.32, 124.35, 122.29 (q, J = 274.7 Hz), 117.79, 115.88, 113.58, 112.85, 103.75, 84.90, 55.97, 53.95. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₄H₁₈F₃N₇O₂, 494.155 2; found, 494.155 6。

1.19 5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)-N-(6-(2-(吡咯烷-1-基)嘧啶-5-基)吡啶-2-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(16i)

黄色固体, 收率为31.8%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.03 (s, 1H), 9.05 (s, 2H), 8.97 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.59~3.57 (m, 4H), 1.20~1.96 (m, 4H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 160.23, 156.46, 155.77, 155.49, 154.50, 153.34, 151.73, 148.52, 144.37, 138.92, 136.72, 135.23, 127.51, 120.78, 116.04, 110.24, 109.40, 103.85, 84.84, 56.22, 53.98, 47.03, 25.46. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₆H₂₅N₉O₂, 496.220 9; found, 496.221 3。

1.20 6-((5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基)-N-(5-甲基异恶唑-3-基)吡啶酰胺(16j)

淡黄色固体, 收率为5.8%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.80 (s, 1H), 10.27 (s, 1H), 9.02 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.56 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.96~7.93 (m, 1H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.59 (dd, J = 7.2, 4.2 Hz, 2H), 6.84 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 2.45 (s, 3H). HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₃H₂₀N₈O₄, 473.168 6; found, 473.168 9。

1.21 (4,4-二氟哌啶-1-基)(6-((5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)甲酮(16k)

黄色固体, 收率为20.4%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.14 (s, 1H), 8.97 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.54 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.79 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.53~7.50 (m, 2H), 7.06 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.80 (s, 2H), 3.56 (s, 2H), 2.10~2.08 (m, 4H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 167.61, 155.80, 155.33, 153.72, 153.40, 152.18, 148.36, 144.35, 139.05, 136.68, 135.37, 127.35, 123.20 (t, J = 241.9 Hz) 115.93, 114.36, 112.01, 103.75, 85.00, 56.05, 53.97, 43.83, 38.96. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₄H₂₃F₂N₇O₃, 496.190 9; found, 496.191 2。

1.22 6-((5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基)-N, N-二乙基吡啶酰胺(16l)

淡黄色固体, 收率为30.5%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.11 (s, 1H), 8.98 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.54~7.50 (m, 2H), 6.89 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.48 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.27 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.18 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.07 (t, J = 7.0 Hz, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 168.51, 155.78, 155.48, 153.85, 153.74, 153.44, 148.35, 144.34, 138.91, 136.69, 135.39, 127.36, 115.95, 113.26, 111.19, 103.69, 84.75, 56.11, 53.96, 42.80, 39.29, 14.68, 13.33. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₃H₂₅N₇O₃, 448.209 7; found, 448.209 5。

1.23 5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)-N-(6-((4-异丙基-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)吡啶-2-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(16m)

淡黄色固体, 收率为38.0%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.09 (s, 1H), 8.93 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.99 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.75 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.64 (s, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.12~3.04 (m, J = 6.9 Hz, 1H), 1.30 (d, J = 6.9 Hz, 6H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 155.73, 155.24, 154.52, 153.88, 153.63, 152.96, 148.39, 144.32, 138.82, 136.65, 135.06, 127.46, 122.04, 115.80, 113.30, 110.58, 103.65, 85.28, 56.04, 54.57, 53.98, 25.82, 22.96. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₄H₂₅N₉O₂, 472.220 9; found, 472.221 2。

1.24 N-(6-((4-环丙基-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-胺(16n)

白色固体, 收率为11.5%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.04 (s, 1H), 8.94 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.56 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.65 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.69 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.58 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 2.01~1.95 (m, 1H), 0.90~0.86 (m, 2H), 0.82~0.78 (m, 2H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 155.77, 155.31, 154.48, 153.87, 153.08, 149.57, 148.41, 144.36, 138.90, 136.68, 135.17, 127.49, 122.03, 115.89, 113.34, 110.54, 103.69, 85.24, 56.07, 54.72, 54.00, 8.13, 7.09. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₄H₂₃N₉O₂, 470.205 3; found, 470.205 6。

1.25 2-(1-((6-((5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙烷-1-醇(16o)

淡黄色固体, 收率为4.5%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.04 (s, 1H), 8.94 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.01 (s, 2H), 7.65 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.71 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.63 (s, 2H), 4.70 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.68 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 7.0 Hz, 2H). HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₃H₂₃N₉O₃, 474.200 2; found, 474.200 3。

1.26 4-(1-((6-((5-(5,6-二甲氧基吡啶-3-基)吡唑[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯甲酸甲酯(16p)

淡黄色固体, 收率为7.7%。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.09 (s, 1H), 8.94 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.92 (s, 1H), 8.51 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.05~8.03 (m, 2H), 7.96~7.94 (m, 3H), 7.68 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.82 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.76 (s, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.82 (s, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ 166.32, 155.75, 155.27, 154.57, 153.39, 153.14, 148.37, 145.90, 144.30, 139.00, 136.70, 135.80, 135.19, 130.28, 129.05, 127.40, 125.80, 124.26, 116.04, 113.52, 110.71, 103.77, 85.38, 56.13, 55.01, 53.98, 52.51. HRMS (ESI, m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₉H₂₅N₉O₄, 564.210 8; found, 564.211 1。

2 生物部分

2.1 PI3K激酶活性实验

激酶反应体系包含3 μL PI3Kα (3.5 μg·mL^-1)、PI3Kβ (3 μg·mL^-1)、PI3Kδ (3.3 μg·mL^-1) 或PI3Kγ (17.4 μg·mL^-1), 3 μL梯度稀释的化合物(1∶3比例用DMSO稀释), 6 μL底物PI3:PS (0.06 mg·mL^-1), 以及60 μmol·L^-1 ATP (对于PI3Kβ为150 μmol·L^-1 ATP, 对于PI3Kγ为30 μmol·L^-1 ATP, 对于PI3Kδ为80 μmol·L^-1 ATP)。加入相应量的ATP并于室温下反应1 h, 随后向每个孔中加入12 μL ADP-Glo试剂孵育40 min, 再将24 μL激酶检测试剂添加到每个孔中并孵育30 min以产生发光信号。该发光信号通过自动平板读取器读取。

2.2 蛋白免疫印迹实验

Raji和RAW264.7细胞接种到六孔板中, 1% FBS饥饿过夜, DMSO连续稀释的化合物16l (0.01~1 μmol·L^-1) 处理细胞2 h, 37 ℃下用anti-IgM (4 μg·mL^-1) 刺激10 min或C5a (100 ng·ml^-1) 刺激5 min。SK-OV-3和786-O细胞接种到六孔板中, 孵育过夜, 后用DMSO连续稀释的化合物16l (0.01~1 μmol·L^-1) 处理细胞2 h。使用加入蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA裂解液裂解细胞样品。超声处理和煮样后, 使用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质裂解物, 并转移到NC膜上。用含有0.1% Tween-20和5%脱脂牛奶的TBS进行封闭, 然后用抗体孵育。最后, 使用ECL免疫印迹检测试剂盒曝光显影。

2.3 药代动力学实验

SD大鼠(体重180~220 g) 购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可代码: SCXK (浙江) 2019-0001]。实验前, 将动物适应环境一周, 然后禁食12 h。随机分为两组, 每组3只, 采用单剂量单次给药方案。化合物16l静脉注射剂量为1 mg·kg^-1, 灌胃剂量为10 mg·kg^-1。给药后, 静脉注射组在2、5、15、30 min, 1、2、4、6、8、12、24 h采血, 灌胃组在5、15、30 min, 1、2、4、6、8、12、24 h采血, 并用肝素钠抗凝。然后将血样以8 000 r·min^-1转速离心5 min, 取上清100 μL置于1.5 mL离心管中, -80 ℃保存, 待处理测定。样品处理方法: 20 μL内标溶液(200 ng·mL^-1咖啡因溶液) 加入100 μL血浆样品中, 混合, 然后加入400 μL甲醇进行蛋白质沉淀, 涡旋5 min后, 14 000 r·min^-1转速离心10 min, 取5 μL上清液用于LC-MS/MS分析测定。

2.4 体内药效实验

六周龄雄性C57BL/6J小鼠购自南京集萃药康公司[许可代码: SCXK (苏) 2018-0008]。小鼠置于中国科学院合肥物质科学研究院实验动物中心[SYXK (皖) 2019-010] 的SPF级环境IVC笼盒中饲养, 且其使用严格按照中国科学院合肥物质科学研究院动物伦理规定执行(批准号: DWLL-2000-06)。

将一百万个处于指数生长期的MC38细胞注入小鼠右侧皮下空间, 并于接种后第一天开始给药。化合物16l甲磺酸盐以溶液(0.25% CMC-Na溶液) 的形式进行灌胃给药, 给药剂量为1和3 mg·kg^-1·d^-1, 每个给药剂量组的小鼠数量为5只。小鼠的体重和肿瘤生长情况每两天测量一次。肿瘤体积按照如下方式进行计算: 肿瘤体积(mm³) = (W² × L)/2, 将两个测量值中的较小值定义为宽度(W), 较大值定义为长度(L)。给药30天观察结束后, 分流小鼠脾脏单个核细胞进行流式细胞术的分析, 标记FITTC-NKp46, PE-CD19, PerCP-Cy5.5-CD8a, APC-CD3检测T细胞、CTL细胞和NK细胞比例变化。

MC38二次接种实验是在MC38细胞荷瘤小鼠上灌胃给药25 mg·kg^-1·d^-1 16l甲磺酸盐30天进行治疗, 肿瘤持续减小至完全消退。间隔3周后, 在肿瘤消退的小鼠右侧皮下进行二次接种, 同样是一百万个处于指数生长期的MC38细胞。对比初次接种MC38细胞的小鼠, 观察对比这两种小鼠的肿瘤生长情况, 记录肿瘤的体积变化。

2.5 分子模拟研究

PI3Kγ (PDB ID: 6C1S) 和PI3Kδ (PDB ID: 6EZ6) 的晶体结构来源于蛋白质数据库。使用PyMOL软件手动去除水分子和原始配体。对接工作由Autodock (版本4.2.6) 执行。AutoDockTools 1.5.6中的prepare_ligand4.py和prepare_receptor4.py脚本用于准备初始文件, 包括添加电荷和氢原子。设置间距为0.375 Å的60 Å×60 Å×60 Å的网格盒以包围整个结合位点。采用拉马克遗传算法(LGA) 搜索最佳结合姿势。

2.6 hERG实验

hERG检测由苏州药明康德新药开发有限公司完成。中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞系, CHO-hERG细胞用于本实验。西沙必利为阳性对照。全细胞膜片钳技术下记录hERG电流, 记录温度为室温。膜片钳放大器输出信号通过数模转换以及2.9 kHz低通滤波。数据记录用Patchmaster Pro软件采集。Origin曲线拟合计算IC₅₀值。

作者贡献: 邓茂青、邹凤鸣、齐紫平、王纯、龙凯丽、刘青旺和梁小飞完成相关实验研究; 邓茂青完成文章初稿撰写工作; 梁小飞、王傲莉、刘静负责课题规划、实验指导以及文章修改与校对。

利益冲突: 本文作者均声明没有利益冲突。

基金

收起

国家自然科学基金项目(82173671)
国家自然科学基金项目(82373723)
国家自然科学基金项目(81872745)
安徽省自然科学基金项目(2108085J42)
安徽省重点研究与开发计划项目(2023s07020018)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第59卷第7期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0112

接收时间：2024-02-03
首发时间：2025-11-26
出版时间：2024-07-12

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收稿日期：2024-02-03
修回日期：2024-03-14

基金

国家自然科学基金项目(82173671)

国家自然科学基金项目(82373723)

国家自然科学基金项目(81872745)

安徽省自然科学基金项目(2108085J42)

安徽省重点研究与开发计划项目(2023s07020018)

作者信息

1.中国科学院, 合肥物质科学研究院健康与医学技术研究所, 安徽合肥 230031

2.中国科学技术大学, 安徽合肥 230026

3.中国科学院合肥肿瘤医院, 安徽合肥 230031

通讯作者:

^*刘静, E-mail: jingliu@hmfl.ac.cn;

梁小飞, E-mail: xiaofeiliang@hmfl.ac.cn

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2024-0112

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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Compd.	R	IC₅₀/nmol·L^-1		Compd.	R	IC₅₀/nmol·L^-1
Compd.	R	PI3Kα	PI3Kγ	Compd.	R	PI3Kα	PI3Kγ
14a		36.9 ± 4.3	0.62 ± 0.01	16i		90.0 ± 8.7	58.9 ± 3.2
16a		148.6 ± 66.8	61.6 ± 14.9	16j		106.0 ± 16.3	23.7 ± 2.1
16b		255.0 ± 46.7	83.6 ± 1.7	16k		59.2 ± 12.4	35.4 ± 2.6
16c		18.2 ± 1.4	10.7 ± 23.6	16l		46.4 ± 7.1	0.11 ± 0.00
16d		43.3 ± 3.2	4.92 ± 2.4	16m		1.5 ± 0.1	3.1 ± 0.3
16e		14.9 ± 0.3	14.3 ± 0.3	16n		21.2 ± 2.5	27.3 ± 2.1
16f		10.5 ± 0.2	8.4 ± 0.8	16o		8.8 ± 0.1	10.5 ± 0.4
16g		572.0 ± 272.0	218.0 ± 191.0	16p		132.0 ± 27.1	280.0 ± 11.1
16h		373.0 ± 31.3	118.0 ± 2.6