药学学报

生物大分子药物纳米递送系统在罕见病治疗中的研究进展

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魏淑洁 ¹^,^# , 何函星 ²^,^# , 郝锦涛 ¹ , 吕芊芊 ¹ , 刘丁阳 ¹ , 杨少坤 ¹ , 张会丰 ³ , 何朝星 ¹^,^* , 向柏 ¹^,^*

药学学报 | 综述 2024,59(7): 1952-1961

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药学学报 | 综述 2024, 59(7): 1952-1961

生物大分子药物纳米递送系统在罕见病治疗中的研究进展

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魏淑洁¹^,^#, 何函星²^,^#, 郝锦涛¹, 吕芊芊¹, 刘丁阳¹, 杨少坤¹, 张会丰³, 何朝星¹^,^*, 向柏¹^,^*

作者信息

1.河北医科大学药学院, 河北石家庄 050017

2.石家庄市人民医院泌尿外科, 河北石家庄 050011

3.河北医科大学第二医院儿科, 河北石家庄 050000

通讯作者:

^*何朝星, Tel: 86-311-86265591, E-mail: chaoxinghe@hebmu.edu.cn;

向柏, E-mail: baixiang@hebmu.edu.cn

Progress of biomacromolecule drug nanodelivery systems in the treatment of rare diseases

Shu-jie WEI¹, Han-xing HE², Jin-tao HAO¹, Qian-qian LV¹, Ding-yang LIU¹, Shao-kun YANG¹, Hui-feng ZHANG³, Chao-xing HE¹^,^*, Bai XIANG¹^,^*

Affiliations

1. School of Pharmacy, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China

2. Department of Urology, Shijiazhuang People′s Hospital, Shijiazhuang 050011, China

3. Department of Pediatrics, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China

出版时间: 2024-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1432

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摘要

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目前罕见病仍缺乏有效的治疗方法, 罕见病药物(称孤儿药) 的研发是亟需解决的医学难题。一些生物大分子药物作为生物体内的天然活性成分, 具有良好的生物相容性、低免疫原性、高靶向性, 已成为21世纪药物研发中极具前景的领域之一, 但在体内递送方面仍存在诸多障碍, 鉴于由聚合物、脂质、有机仿生和无机材料等制备的纳米载体在药物递送方面的独特优势, 研究者致力于构建多功能性与协同作用的高效递送系统, 以解决罕见病治疗中生物大分子药物目前存在的瓶颈问题。因此, 本文对近10年来纳米载体递送蛋白、多肽及核酸等药物在罕见病治疗领域的研究进展进行系统综述, 为基于生物大分子药物纳米递送系统的罕见病干预研究提供思路。

关键词

罕见病 / 纳米载体 / 生物大分子 / 高效递送 / 治疗

Abstract

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Rare diseases still lack effective treatments, and the development of drugs for rare diseases (known as orphan drugs) is an urgent medical problem. As natural active ingredients in living organisms, some biomacromolecule drugs have good biocompatibility, low immunogenicity, and high targeting. They have become one of the most promising fields in drug research and development in the 21st century. However, there are still many obstacles in terms of in vivo delivery. In view of the unique advantages of nanocarriers prepared from polymers, lipids, organic biomimetic and inorganic materials in drug delivery, researchers are committed to building an efficient delivery system with versatility and synergy to solve the bottleneck issues in treating rare diseases with biomacromolecule drugs. Therefore, this article reviews the research progress of nanocarrier delivering proteins, peptides and nucleic acids in the field of rare disease treatment in the past ten years, which provides ideas for researches on biomacromolecule drug nanosystems in the field of treatment of rare diseases.

Key words

rare disease / nanocarrier / biomacromolecule drug / efficient delivery / treatment

引用本文

魏淑洁, 何函星, 郝锦涛, 吕芊芊, 刘丁阳, 杨少坤, 张会丰, 何朝星, 向柏. 生物大分子药物纳米递送系统在罕见病治疗中的研究进展. 药学学报, 2024 , 59 (7) : 1952 -1961 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1432

Shu-jie WEI, Han-xing HE, Jin-tao HAO, Qian-qian LV, Ding-yang LIU, Shao-kun YANG, Hui-feng ZHANG, Chao-xing HE, Bai XIANG. Progress of biomacromolecule drug nanodelivery systems in the treatment of rare diseases[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (7) : 1952 -1961 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1432

正文

收起

罕见病是指发病率较低的疾病, 大部分属于遗传病^[1], 具有病情严重、诊断困难、死亡率高等特点^[2], 迄今大部分罕见病尚无有效的治疗药物, 目前临床用药以改善患者健康状况, 延长存活期为主要目的。随着科学技术的进步及多学科的融合, 新的筛选技术与合成化学、计算筛选和结构生物学正在加快新的生物活性分子的发现和设计, 生物大分子药物(多肽、蛋白质、抗体、聚糖与核酸等) 在21世纪药物研发中具有无限潜力, 但仍存在亟待解决的难题与障碍: 如稳定性低, 选择性差, 难以穿透生物屏障^{[3, 4]}, 需经胞内转运和胞内释放才能发挥作用。为此, 科研工作者通过构建生物大分子药物纳米递送系统来提高基因疗法、酶替代疗法和免疫疗法等在罕见病治疗中的疗效(图 1)。

纳米药物系指利用纳米制备技术将原料药等制成的具有纳米尺度的颗粒或以适当载体材料与原料药结合形成的具有纳米尺度的颗粒等, 及其最终制成的药物制剂。不同纳米载体因其结构、性质等的差异, 在递送药物时可表现出不同的性能, 聚合物和脂质等有机纳米载体具有良好的生物相容性和生物可降解性, 毒性比其他载体低, 其特殊的疏水结构利于药物装载和控制释放; 而有机仿生纳米载体是通过设计仿生或利用生物内源性材料作为递送载体, 具有良好的生物膜转运特性、高生物相容性和特异靶向机制, 通过载体的结构修饰和转化, 可将药物输送到靶部位^[5]。与传统的有机纳米载体相比, 无机纳米载体不仅具有独特的光、磁、电等物理学性能, 而且其在水溶液中具有高分散性和物理稳定性、粒子大小及形态简单可控、易于表面修饰, 因此在药物载体方面展现出良好的前景^[6]。纳米载体材料在形状、大小、疏水性和表面电荷等方面的高度可调节性, 有望将生物大分子药物高效递送到靶部位, 改变罕见病治疗领域缺药和费用高的现状。本文以罕见病种类为分类依据, 着重介绍纳米载体类型、相关制备技术、作用机制和疗效评价, 为罕见病的治疗提供新思路。

1 神经系统罕见病

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1.1 多发性硬化(multiple sclerosis, MS)

1.1.1 聚合物纳米载体

MS是由自身反应性T细胞功能障碍引起的免疫反应, 与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)、髓鞘蛋白脂蛋白(proteolipid protein, PLP) 和髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP) 受损有关。免疫抑制剂常用于控制此类疾病, 但长期给药带来的非特异性免疫抑制等不良反应限制了其使用, 目前出现的抗原特异性免疫疗法, 能够诱导对疾病特异性自身抗原的耐受性, 而不抑制全身免疫系统。有研究团队以聚乙丙交酯(poly (L-lactide-co-glycolide), PLGA) 为载体, 负载PLP^{[7, 8]}或MOG^[9], 通过间接调节自身反应性T细胞来诱导免疫耐受, 降低自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 模型小鼠的严重程度。与间接诱导耐受策略不同, Pei等^[10]采用溶剂蒸发法制备出偶联MOG、抗Fas、细胞程序性死亡-配体1的Fc段(programmed cell death 1 ligand 1-fragment crystallizable, PD-L1-Fc) 和簇分化抗原47的Fc段(cluster of differentiation 47-Fc, CD47-Fc) 的PLGA纳米粒(nanoparticles, NPs), 用于包封转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1), 结果显示, 载药纳米粒平均尺寸为(217 ± 4.5) nm, zeta电位为(35.8 ± 8.8) mV, 通过多种配体的表面呈递和细胞因子旁分泌释放直接调节自身反应性T细胞, 持久地改善EAE。

通过不同策略抑制富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白-1 (leucine-rich repeat and Ig domain containing 1 gene, LINGO-1), 与不同中枢神经系统脱髓鞘动物模型中髓鞘再生的增强相关, Youssef团队^[11]制备出LINGO-1定向siRNA负载的壳聚糖(chitosan, CS) NPs, 鼻内给药沿细胞外途径直接将药物输送到中枢神经系统(central nervous system, CNS), 通过RNA干扰抑制脑桥中LINGO-1的表达。与未治疗组相比, 使用siRNA NPs治疗导致MBP mRNA和蛋白表达显著升高, 改善了脱髓鞘大鼠的运动性能和组织髓鞘再生。干扰素β (interferon-β, IFN-β) 作为治疗MS的一线疗法, 半衰期短, CNS通路有限, González等^[12]将CS/磺基丁基醚-β-环糊精(sulfobutylether-β-cyclodextrin, SBE-β-CD) 两种水溶液与IFN-β高效混合制备IFN-β-NPs, 在MS临床前模型中, 尽管每周IFN-β-NPs鼻内给药的IFN-β总量减少了78%, 药效却明显优于游离IFN-β全身给药, 临床症状显著改善, 运动障碍和神经损伤恢复。

1.1.2 脂质体(liposome, LIP)

Krienke等^[13]把含有1-甲基假尿苷(m1Ψ) 的mRNA装载到缺乏佐剂能力的LIP中, 以将mRNA编码的抗原全身递送到淋巴组织驻留的CD11c抗原呈递细胞。m1ΨmRNA-LIP不会诱导炎症细胞因子或激活免疫细胞, 并允许更高和更长的抗原表达, 通过减少效应T细胞和调节性T细胞群体的发育来发挥免疫抑制作用。

1.1.3 有机仿生纳米载体

Carnasciali等^[14]开发了一种基于纳米技术的细胞介导的药物传递系统, 在抗原特异性T细胞中装载具有抗CD20的功能化磁性氧化铁纳米颗粒(iron-oxide nanoparticles, NBR)。在EAE动物模型中发现, 单独注射抗CD20只会耗尽小鼠脾脏中的B细胞, 而这种T细胞-NBR-抗CD20复合物可跨越血脑屏障, 同时消耗小鼠外周和中枢神经系统的B细胞, 从而改善病程和病理。

1.1.4 无机纳米载体

Rezaei等^[15]将软骨素酶ABC I (chondroitinase ABC, ChABC) 固定在多孔硅纳米颗粒(porous silicon nanoparticles, Psi NPs) 上制得ChABC@PSi, 以提高酶在体内的稳定性和功能, 减少注射次数。在脱髓鞘小鼠模型体内, ChABC@PSi通过去除体内硫酸软骨素蛋白聚糖、募集少突胶质前体细胞来增强髓鞘再生, 减少脱髓鞘面积。

1.2 其他

杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy, DMD) 是一种遗传性疾病, 由肌营养不良蛋白基因的无义或移码突变引起。Hersh团队^[16]开发了一种用骨骼肌靶向肽、用于细胞内转运的动力蛋白轻链8 (dynein light chain 8 protein, DLC8) 结合肽和用于核摄取的核定位信号肽修饰的G5聚酰胺(G5 polyamidoamine, G5 PAMAM) 树突状聚合物-DNA复合物, 筛选出多链体为200 nm的处方, 可将微肌营养不良蛋白基因靶向递送到骨骼肌细胞, 并有效表达蛋白质, 进而改善DMD的肌肉功能。

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA) 是一类由脊髓前角运动神经元和脑干运动神经核变性导致肌无力和肌萎缩的疾病。Kim等^[17]报告了一种自组装人工pri-miRNA, 将其包封到脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, LNP) 中, 通过基因沉默和剪接调节来提供多模态基因调控可为治疗SMA提供协同治疗效果。

角鲨烯(squalenoyl, SQ) 是一种天然和生物相容的脂质, 且药物-SQ NPs的合成和制备很容易, 是一个灵活的药物递送平台。Boutary团队^[18]将针对外周髓磷脂蛋白22 (peripheral myelin protein 22, PMP22) 的siRNA与SQ进行生物偶联, 对偶联物进行HPLC纯化后在丙酮∶水(体积比1∶2) 中通过纳米沉淀制备NPs来治疗由PMP22的过表达引起的1A型腓骨肌综合征(Charcot-Marie-Tooth disease type 1A, CMT1A)。其剂量给药使CMT1A转基因小鼠模型的PMP22蛋白水平正常化, 改善了运动和神经肌肉活动, 恢复电生理终点并触发轴突髓鞘再生。

视神经脊髓炎(neuromyelitis optica, NMO) 的发病机制与自身免疫反应和抗水通道蛋白4 (aquaporin 4, AQP4) 自身抗体的产生有关, 有研究者^[19]用羧化聚缩水甘油(carboxylated polyglycidol, PG8MG) LIP包封AQP4肽201~220, 以诱导AQP4抗原肽免疫耐受。结果发现, PG8MG LIP的粒径为164.4 nm, zeta电位为-45.7 mV, 分布到淋巴结, 且可以将抗原肽递送至树突状细胞, 进而诱导免疫耐受。

2 代谢缺陷罕见病

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2.1 溶酶体贮积症(lysosomal storage disorder, LSD)

2.1.1 黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis, MPS)

MPS根据患者症状和影像学表现不同, 分为MPS I至MPS IX型, 有团队对I型、II型和IV型进行了纳米药物递送的研究。

2.1.1.1 聚合物纳米粒

Salvalaio等^[20]制备了负载异硫氰酸荧光素结合物(fluorescein isothiocyanate conjugate, FITC)-白蛋白的PLGA NPs, 并用7-氨基酸糖肽(7-aminoacid glycopeptide, g7) 修饰以靶向递送到大脑。MPS I和MPS II小鼠的体内实验首次证明g7-NPs可以携带高分子质量的分子跨过血脑屏障, 向大脑输送。该研究结果鼓励使用酶负载的g7-NPs进行实验, 以将足量药物输送到LSD的大脑区域, 进而纠正病理表型。

2.1.1.2 脂质体(LIP)

MPS I是一组由α-L-艾杜糖苷酶(alpha-L-iduronidase gene, IDUA) 缺乏引起的遗传性LSD, 其特征是糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAG) 的积累。Vera等^[21]将编码Cas9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR/ Cas9) 系统和编码靶向Rosa26位点的IDUA基因的两个质粒(pDNA) 与添加了1, 2-二油酰基-sn-甘油-3-三甲基丙烷铵(1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-trimethylammonium propane, DOTAP) 的LIP络合得到黏膜黏附复合物, 能够有效渗透猪鼻黏膜, 与未治疗组相比, MPS I小鼠心脏IDUA活性显著增加, 血清、尿液、组织和大脑皮层中的GAG水平降低, 小鼠行为改善。

2.1.1.3 纳米乳(nanoemulsions, NM)

Fraga团队^[22]先将编码IDUA基因的质粒(pIDUA) 与DOTAP以不同电荷比络合, 采用高压均质法制备由中链甘油三酯(medium chain triglycerides, MCT)、1, 2-二硬酯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000], DSPE-PEG)、DOTAP和1, 2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE) 组成的NM, 再将预制的pIDUA-DOTAP络合物吸附或包裹到NM的油芯中, 得到不同处方的含药NM。MPS I基因敲除小鼠中静注后, 发现较高电荷比+4/-1的pIDUA NM在肺和肝中IDUA活性(荧光测定) 和表达(RT-qPCR) 显著增加。另有团队^[23]采用同法获得了电荷比为+4/-1的pIDUA/NM, 鼻腔给药后MPS I小鼠大脑、肾脏和脾脏组织中的IDUA表达和活性增强。此后, 该团队又制备NM共载CRISPR/Cas9质粒和供体寡核苷酸, 成功转染MPS I患者的成纤维细胞并产生IDUA^[24]。

2.1.1.4 纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carriers, NLC)

IVA黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis IVA, Morquio A) 由溶酶体酶N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(N-acetylgalatosamine-6-sulfate-sulfatase, GALNS) 缺乏引起, 目前, 临床上的治疗以静脉注射重组GALNS酶和造血干细胞移植为主, 但酶在进入体内会快速降解和清除, Álvarez等^[25]通过快速化和低温固化技术发明了一种带有凝胶核心的聚乙二醇化NLC来封装elosulfase α (一种重组GALNS酶), 体外细胞实验证实了包封在NLC中的酶能被溶酶体内化, 酶活性和稳定性得到保留; 小鼠体内生物分布研究表明, NLC能够到达脑、软骨和骨骼等不易接近的组织。

2.1.2 尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease, NPD)

NPD主要分为A、B、C三型, B型尼曼-匹克病由酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase, ASM) 缺乏引起, 导致鞘磷脂在全身细胞中大量积累, 主要在肝脏、脾脏和肺中。

2.1.2.1 聚合物纳米载体

Garnacho等^[26]使用PLGA/聚苯乙烯(polystyrene, PS) 纳米载体负载ASM, 在表面偶联细胞间黏附分子1 (intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1) 抗体以实现靶向递送, 增加肺对酶的摄取。与裸酶相比, ASM敲除小鼠单次静脉注射抗ICAM/ASM纳米载体后, 肺、肝和脾中的ASM活性增强, 肺鞘磷脂储存和巨噬细胞浸润减少, NPD-B炎症表型减弱。

2.1.2.2 LIP

Aldosari团队^[27]将重组人酸鞘磷脂酶(Olipudase alfa, rhASM) 装载到LIP制剂中, 递送到细胞内。相对于游离rhASM, 鞘磷脂的细胞外降解减少了61%, 大大降低了由于rhASM在细胞外降解鞘磷脂时神经酰胺的全身释放而表现出剂量依赖性毒性; NPD-B成纤维细胞中累积的溶血鞘磷脂降低了71%, 而使用游离rhASM酶时为55%, 证明rhASM-LIP的有效和安全性。

C1型NPD (NPC1) 是一种溶酶体胆固醇贮积症, 由NPC1基因突变引起, 有研究者^[28]将表达NPC1的质粒封装在100 nm聚乙二醇化的特洛伊木马脂质体(trojan horse liposomes, THLs) 中, 在表面偶联受体特异性单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb), 以靶向表达转铁蛋白受体的器官。NPC1小鼠体内试验显示, THLs静脉内给药减少了大脑和外周器官中的由胆固醇蓄积而产生的组织包涵体, 但小鼠寿命并未延长, 可能需要早期干预。

2.1.3 法布雷病(Fabry disease, FD)

FD是由编码溶酶体酶α-半乳糖苷酶A (α-galactosidase A, α-Gal A) 的基因突变引起, 酶的缺乏导致鞘糖脂(主要是三酰神经酰胺球蛋白(globotriaosylceramide, Gb3)) 在溶酶体中积累, 目前采用α-Gal A替代疗法来阻止疾病进展。

2.1.3.1 固体脂质纳米颗粒(solid lipid nanoparticles, SLN)

Rodríguez-Castejón等^[29]采用热熔乳化技术制备了一种SLN, 负载编码α-Gal A的质粒DNA, 并用半乳甘露聚糖(galactomannan, GM) 修饰以靶向肝脏来表达α-Gal A。肝细胞体外研究显示GM-SLN载体能有效被细胞摄取并转染; 与未治疗组相比, 静脉给药后FD小鼠心脏和肾脏中的酶活性分别提高6倍和2倍。

2.1.3.2 白蛋白纳米粒

人血清白蛋白上有许多药物结合位点, 并且表面具有多功能基团, 可用配体进行修饰, 成为优异的仿生型药物递送载体。Lee团队^[30]以来自家蚕的30Kc19蛋白和人血清白蛋白(human serum albumin, HSA) 作为载体, 通过脱溶剂化法制备了负载有α-Gal A的30Kc19-HSA NPs, 在FD成纤维细胞中显示出增强的Gb3降解, 30Kc19含量占50%时Gb3降解量达47%, 比HSA NPs高3.8倍, 比α-Gal A本身高1.6倍。

2.2 氨基酸代谢缺陷

2.2.1 LNP

苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU) 是由肝脏中促进苯丙氨酸(phenylalanine, PHE) 分解代谢的苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH) 基因突变引起的, 血液和组织中的PHE水平升高。目前可用的LNP会诱导肝损伤并引发强烈的免疫反应, Perez-Garcia团队^[31]开发出一种名为LUNAR (lipid-enabled and unlocked nucleic acid modified RNA) 的LNP, 由4种脂质成分组成[Arcturus专有可电离阳离子脂质(Arcturus' proprietary ionizable cationic lipid, ATX)、胆固醇、1, 2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(l, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC) 和聚乙二醇化脂质], 是一种安全、可重复和有效的mRNA递送平台, 可用于治疗需要蛋白质替代的疾病。该团队利用微流体装置将密码子优化的编码人类PAH的全长mRNA封装在专有的LUNAR中, 静注后递送给PAH基因错义突变小鼠模型, 在肝细胞中高水平表达PAH蛋白并恢复PHE的代谢。有研究团队^[32]采用同样的方法分别将3种植物来源的PHE解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL) mRNA负载到LNP上, 产生的PAL蛋白成功降低血清PHE水平, 证明了植物性PAL蛋白可替代细菌性PAL来降低免疫原性反应。

精氨酸酶缺乏症(arginase deficiency, hyperargininemia, HA) 由尿素循环的最后一步精氨酸酶1 (arginase 1, ARG1) 的双等位基因突变引起, 生化结果为高精氨酸血症和胍基化合物的存在。Truong等^[33]将密码子优化的hARG1 mRNA包封在可生物降解的肝脏靶向LNP中, 静脉注射到ARG1缺陷小鼠模型体内, 存活率延长8周, 生化指标表现出良好的控制。后来, 在ARG1敲除小鼠模型体内发现, ARG1 mRNA LNP可以预防与精氨酸酶缺乏相关的髓鞘形成异常^[34]。

1型肝肾酪氨酸血症(hepatorenal tyrosinemia type 1, HT-1) 由延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, FAH) 突变引起, Cheng等^[35]筛选出一种名为5A2-SC8的树枝状大分子脂质聚合物, 装载FAH mRNA成功制备树枝状脂质纳米颗粒(mRNA-loaded dendrimer lipid nanoparticles, mDLNP)。肝功能受损的HT-1小鼠模型静脉给药后, 通过流式细胞术发现转染了肝脏 > 44%的肝细胞, mRNA的递送效力提高, 在低mRNA剂量下可产生高FAH蛋白水平, 并且在小鼠模型中耐受性良好, 体重和肝功能持续正常化。

2.2.2 融合蛋白载体

瓜氨酸血症I型(citrullinemia type I, CTLN-I) 由于精氨酸琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase, AS) 的缺失或缺乏所致, 会导致尿素循环异常, 氨在血液和脑脊液中有害地积聚。大多数治疗性外源性蛋白质不能到达细胞质, 酶替代疗法受限, Knox等^[36]把细胞通透性微型蛋白ZF5.3 (ZF) 和AS融合得到一种融合蛋白, 并成功转运到培养细胞的细胞质, AS浓度为内源性的3~10倍。结果显示, 融合蛋白ZF-AS在体外具有催化活性, 在血浆中稳定, 并能成功转运到Saos-2和人肝癌细胞(human hepatocarcinoma cells, SK-HEP-1) 的细胞质中, 作为在细胞质中起作用的治疗性蛋白质。相应地, 通过静脉给药也能将AS递送到健康小鼠肝脏, 且肝脏中浓度比基线高出近200 nmol·L^-1。

2.2.3 双纳米颗粒

鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(ornithine transcarbamylase deficiency, OTCD) 是由尿素循环中主要在肝脏中表达的关键酶丢失引起的, 导致血液中氨水平升高。Prieve等^[37]描述了一种新的双纳米颗粒mRNA传递系统, 由两部分组成: 一部分为惰性LNP, 它可以保护mRNA免受血液中核酸酶的影响; 另一部分为靶向肝细胞并触发mRNA内吞体释放的二嵌段聚合物胶束, 将mRNA/LNP和聚合物溶液混合, 静脉注射至OTCD小鼠模型, 导致肝脏中mRNA表达急剧增加, 酶活性提高2倍, 肝脏中所需蛋白质高水平合成, 且血浆氨和尿乳清酸水平正常化, 生存期延长。

2.3 其他

有不同的研究团队分别用LNP负载编码人线粒体酶丙酰辅酶A羧化酶(propionyl-CoA carboxylase, PCC) PCCA和PCCB的双mRNA^[38]、编码人甲基丙二酰辅酶A变位酶(human methylmalonyl-CoA mutase, hMUT) 的mRNA^[39]、Galnac偶联修饰siRNA^[40]、编码人类半乳糖-1-磷酸: 尿苷基转移酶(galactose-1-phosphate: uridylyltransferase, GALT) 的mRNA^[41], 通过促进或抑制特定蛋白的表达来改善丙酸血症(propionic acidemia/aciduria, PA)、甲基丙二酸血症(isolated methylmalonic acidemia/aciduria, MMA)、急性肝卟啉病(acute hepatic porphyrias, AHP) 和经典半乳糖血症(classic galactosemi, CG) 的症状。

3 眼及附器罕见病

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3.1 视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)

3.1.1 LNP

Tabatabaei等^[42]使用pH敏感的阳离子脂材通过薄膜水化法制备LNP, 共同包封马法兰(melphalan) 和miR-181a, 以特异性地递送到RB细胞质中。发现其转染Y-79细胞的能力极强, 且与空白LNP相比, 用LNP/miR-181a处理的细胞活力降低27%, 当LNP/miR-181a与LNP/melphalan共处理使活力降低33%, 当两种活性物质在同一LNP内递送时活力再降10%。在RB大鼠模型中, 也同样证明这种联合治疗的效力, 允许减少melphalan的给药剂量。存活蛋白(Survivin) 是迄今为止发现的具体的癌症靶标之一, 有研究团队^[43]利用微流控方法制备直径(133 ± 2) nm、zeta电位(31.5 ± 4.1) mV、包封率96.37% ± 1.35%的负载Survivin siRNA的LNP, 发现其在人乳腺癌细胞(Michigan Cancer Foundation-7, MCF7) (84%)、A549细胞(78%) 和HeLa细胞(92%) 中有更好地沉默存活蛋白基因的作用, 具有细胞系依赖性。还探索了永生化的Y79细胞和原代RB人细胞体外模型中Survivin沉默和化疗药物之间的协同作用, Survivin siRNA处理的选择是减少治疗剂量和减轻对健康细胞毒性的一种有希望的策略。

3.1.2 配体修饰纳米粒

纳米级基因递送系统的使用很有吸引力, 因为它们具有高度可调的结构, 可以携带治疗剂和成像剂。有研究报道了一种叶酸(folic acid, FA) 修饰的相变阳离子NPs, 包封液全氟戊烷(perfluoropentane, PFP) 和吲哚菁绿(indocyanine green, ICG) 得到FA-CN-PFP-ICG, 其表现出良好的靶向能力, 能在相当长的时间内提供最佳光声和超声对比度, 且FA-CN-PFP-ICG/pDNA +激光系统在体内也表现出最佳的治疗效果, 为RB的临床检测和治疗奠定了实验基础^[44]。

3.2 视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)

3.2.1 壳聚糖纳米粒

RP由60多个基因的突变引起, 通过外源性施用睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF) 和抑瘤素M (oncostatin M, OSM) 来治疗, 以保留现有的视网膜解剖结构和视觉功能, 是一种合理的策略, 但直接给药会迅速降解, Yang等^[45]首先合成硫酸葡聚糖-壳聚糖纳米粒(dextran sulfate-chitosan nanoparticles, DSCS NPs), 核心部位将壳聚糖与丁二酸交联后, 将CNTF或OSM负载到外壳上得到CNTF/OSM-NPs, 粒径在317~338 nm, zeta电位在-39 mV左右。两种营养因子-NPs的单次玻璃体内递送在RP动物模型中提供了神经保护。

3.2.2 硅基纳米颗粒

Valdés-Sánchez等^[46]采用溶胶-凝胶法合成负载质粒DNA的胺化介孔二氧化硅基纳米颗粒(amino-functionalized mesoporous silica-based nanoparticles, N-MSiNPs), 通过表面胺化修饰来改善与带负电荷的核酸的结合。结果表明, N-MSiNPs能够在体外将外源性pre-mRNA加工因子31 (pre-mRNA processing factor 31, PRPF31) 基因递送到人体细胞, 在体内通过视网膜下注射能够递送到小鼠视网膜的色素上皮细胞层且安全性良好。

4 呼吸系统罕见病

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特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) 是一种慢性和进行性致命的间质性肺疾病, 其特征是成纤维细胞的异常转化和增殖, 巨大的细胞外基质(extracellular matrix, ECM) 沉积在肺实质中, 导致气体交换逐渐失败和患者死亡。尽管FDA批准的新的抗纤维化药物尼达尼布和吡非尼酮改善了患者的健康状况, 但预后仍然很差, 5年死亡率仍在70%~80%之间, 迫切需要开发有效的IPF治疗方法。

4.1 LIP

Wang等^[47]证实肺纤维化的发病机制Srpx2过表达有关, 并制备出负载Srpx2 siRNA的阳离子LIP, 气管内给药后通过阻断成纤维细胞到肌成纤维细胞的转化来逆转肺纤维化。另有研究团队设计出负载Sart1 siRNA^[48]和Mecp2 siRNA^[49]的阳离子LIP, 通过调节巨噬细胞极化来减轻肺纤维化。

4.2 NLC

Garbuzenko等^[50]将前列腺素E (prostaglandin E, PGE2) 与3种siRNA [分别靶向基质金属蛋白酶3 (matrix metalloproteinase 3, MMP3)、趋化因子(chemokine (C-C motif) ligand 12, CCL12) 和缺氧诱导因子(hypoxia-inducible-factor, HIF1-A)] 联合负载到NLC中, 小鼠模型气管内吸入给药后, 体重和肺部羟脯氨酸含量显著降低, 并干扰了mRNA表达, 可限制肺组织损伤并提高动物存活率。这种效果不能通过单独使用仅含有PGE2或siRNA的NLC来实现, 且PGE2与3种siRNA联合治疗后小鼠模型肺部纤维化组织的体积与博莱霉素组相比, 降低了约3/4, 几乎达健康水平。

4.3 聚合物和脂质自组装载体

白细胞介素-11 (interleukin-11, IL-11) 是一种促纤维化细胞因子, 驱动IPF发病机制的基础过程, Bai等^[51]使用可生物降解的PLGA-PEG二嵌段共聚物和自制的阳离子脂质样分子G0-C14自组装配制成可吸入和黏液穿透纳米颗粒(PPGC NPs), 用于负载针对IL-11的siRNA以实现siIL-11的高效经黏膜递送。无创气溶胶吸入通过抑制细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK) 和Smad2信号转导, 阻碍成纤维细胞分化并减少ECM沉积。

5 其他

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近10年内, 研究学家曾试图利用基因药物共载的LNP^[52]等作为纳米药物传输系统, 来研究人类难以根治的血友病(hemophilia), 也有研究者^[53]将抗miRNA质粒和纳米材料结合, 为常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD) 的治疗提供了潜在的临床意义。对于纳米药物递送系统治疗罕见病的研究, 除递送生物大分子药物之外, 仍有不少研究团队使用纳米载体递送小分子药物, 如亨廷顿舞蹈症^{[54, 55]}、强直性肌营养不良^[56]、结节性硬化症^{[57, 58]}、枫糖浆尿病^[59]、肝豆状核变性^{[60, 61]}、肺淋巴肌瘤病^[62-64]、系统性硬化症^{[65, 66]}、镰刀型细胞贫血症^[67]等。

文中采用溶剂蒸发、薄膜水合、纳米沉淀、微流控和高压均质等制备方法, 构建了PLGA NPs、CS NPs、Psi NPs、LIP、G5 PAMAM聚合物载体、LNP、NM、NLC、有机仿生纳米载体等递送载体, 包载核酸、蛋白等生物大分子药物, 体内外试验评价神经系统、代谢系统、眼部、呼吸系统相关22种罕见病的治疗效果。

6 展望

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相较于小分子药物, 生物大分子药物药理活性的发挥更加依赖于安全高效的递药系统, 国家高度重视罕见病患者用药问题, 生物大分子纳米递送系统的研发前景广阔。但同时其在罕见病的治疗探索中又受到许多限制: 第一, 大多数罕见病的发病机制尚不明确, 基础研究缺乏不利于罕见病的精准治疗, 而且治疗效果存在很大的基因异质性, 难以普适推广。未来要加深对罕见病发病机制及疾病进程的研究, 不断寻找新的药物靶点, 提高药物递送效率。第二, 罕见病患者人群总体数量较少, I期临床试验数据的缺乏, 在一定程度上减慢了孤儿药的研发速度, 且纳米药物处于研发早期, 大部分仍停留在动物模型阶段, 很少有成功案例转化为临床试验和应用。第三, 纳米材料蓄积产生的安全性问题不可忽视, 有报道体外无细胞毒性的空白PLGA, 健康大鼠体内显示轻度毒性信号^[68], 需要再做进一步考察。这要求作者必须对新开发的纳米材料提出要求, 或者对已有载体材料进行合理优化, 降低对机体的毒性。基于生物大分子的自身特点, 其与纳米递药系统的结合更加有利于提高它的成药性, 有研究报道采用有机与无机结合的纳米载体递送拉罗尼酶, 通过长期酶替代疗法来治疗MPSI^[69]。必须指出的是, 尽管临床前研究中取得了一些成果, 但进入临床试验后效果不尽如人意, 生物大分子纳米药物的上市仍困难重重, 因此在递送过程中生物大分子如何保持活性稳定、成功穿透体内多种生物屏障、实现准确的靶向递送进入细胞发挥作用仍是纳米药物递送系统研究的难点和发展方向。随着人类对罕见病的认识逐渐深入, 新纳米材料的开发, 及与更多技术的联合应用, 将有效助力生物活性大分子在体内的高效递送。

作者贡献: 魏淑洁、何函星负责文献检索和论文撰写及修改; 何朝星、向柏负责论文选题和写作指导; 郝锦涛、吕芊芊负责论文校对; 杨少坤、刘丁阳负责论文的结构调整和优化; 张会丰负责论文的专业性和规范性审阅。

利益冲突: 本文所有作者声明不存在利益冲突关系。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81973251)
河北省引进留学人员资助项目(C20230351)
河北医科大学大学生创新性实验计划项目(USIP2023008)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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2024年第59卷第7期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1432

接收时间：2023-12-22
首发时间：2025-11-26
出版时间：2024-07-12

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收稿日期：2023-12-22
修回日期：2024-05-16

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河北省引进留学人员资助项目(C20230351)

河北医科大学大学生创新性实验计划项目(USIP2023008)

作者信息

1.河北医科大学药学院, 河北石家庄 050017

2.石家庄市人民医院泌尿外科, 河北石家庄 050011

3.河北医科大学第二医院儿科, 河北石家庄 050000

通讯作者:

^*何朝星, Tel: 86-311-86265591, E-mail: chaoxinghe@hebmu.edu.cn;

向柏, E-mail: baixiang@hebmu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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