药学学报

汉防己甲素抑制ROS介导的成纤维细胞活化治疗肺纤维化

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严业超 , 郭春佚 , 张家铭 , 李云炫 , 李珂 ^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(8): 2216-2226

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(8): 2216-2226

汉防己甲素抑制ROS介导的成纤维细胞活化治疗肺纤维化

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严业超, 郭春佚, 张家铭, 李云炫, 李珂^*

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 北京 100050

通讯作者:

^*李珂, Tel / Fax: 86-10-63024341, E-mail: like1986@163.com

Tetrandrine ameliorates pulmonary fibrosis by inhibiting ROS-mediated fibroblast activation

Ye-chao YAN, Chun-yi GUO, Jia-ming ZHANG, Yun-xuan LI, Ke LI^*

Affiliations

Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2024-08-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0313

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摘要

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肺纤维化是一种威胁人类健康的慢性进展性肺部疾病, 目前临床治疗方法有限, 迫切需要研究其发病机制并开发有效治疗策略。汉防己甲素(tetrandrine, TET) 是一种从粉防己中提取的双苄基异喹啉生物碱, 具有一定的抗炎和抗纤维化作用, 但具体机制尚不明确。本研究进一步明确了TET在慢性肺纤维化疾病模型中的抗肺纤维化作用, 并探索了TET抑制成纤维细胞活化的分子机制。结果显示, TET显著减轻多次博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型的病理改变, 并有效抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞活化; 机制上, TET主要通过抑制TGF-β/SMAD信号通路以及减少细胞内活性氧水平的方式来发挥作用。通过CRISPR-Cas9文库筛选, 本研究发现血管紧张素II 1型受体相关蛋白(angiotensin II type 1 receptor associated protein, AGTRAP) 与膜棕榈酰化蛋白6 (membrane palmitoylated protein 6, MPP6) 在TET抑制活性氧水平过程中发挥重要调控作用, 敲除Agtrap和Mpp6基因可以抑制TET的抗成纤维细胞活化作用。本研究所有动物实验均通过中国医学科学院医药生物技术研究所伦理审查委员会批准(IMB-20230406D507)。本研究不仅阐释了汉防己甲素的药理学作用机制, 也为肺纤维化治疗提供了新的选择。

关键词

肺纤维化 / 汉防己甲素 / 成纤维细胞活化 / 活性氧 / 线粒体

Abstract

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Pulmonary fibrosis is a chronic and progressive lung disease that poses a threat to human health. Current treatment options are limited, highlighting the urgent need for more effective therapeutic strategies. Tetrandrine (TET), a bis-benzylisoquinoline alkaloid extracted from Stephania tetrandra, has been known for its anti-inflammatory and anti-fibrotic effects, but its specific mechanisms remain unclear. This study investigated the anti-fibrotic effects of TET in a chronic model of pulmonary fibrosis, aiming to delineate the molecular mechanisms underlying TET-mediated inhibition of fibroblast activation. The results showed that TET significantly alleviated the pathological changes in a murine model of multiple bleomycin-induced pulmonary fibrosis and effectively inhibited TGF-β1-induced fibroblast activation. Mechanistically, TET predominantly inhibited the TGF-β/SMAD signaling pathway and diminished intracellular reactive oxygen species (ROS) levels. Utilizing CRISPR-Cas9 library screening, we identified that angiotensin II type 1 receptor associated protein (AGTRAP) and membrane palmitoylated protein 6 (MPP6) played important roles in TET's suppressive impact of ROS levels, with the knockout of two genes attenuating TET's antifibrotic activity. All animal treatment procedures were approved according to the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences (IMB-20230406D507). This research not only elucidates the pharmacological mechanism of TET but also provides a novel therapeutic avenue for the treatment of pulmonary fibrosis.

Key words

pulmonary fibrosis / tetrandrine / fibroblast activation / reactive oxygen species / mitochondria

引用本文

严业超, 郭春佚, 张家铭, 李云炫, 李珂. 汉防己甲素抑制ROS介导的成纤维细胞活化治疗肺纤维化. 药学学报, 2024 , 59 (8) : 2216 -2226 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0313

Ye-chao YAN, Chun-yi GUO, Jia-ming ZHANG, Yun-xuan LI, Ke LI. Tetrandrine ameliorates pulmonary fibrosis by inhibiting ROS-mediated fibroblast activation[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (8) : 2216 -2226 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0313

正文

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肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF) 是一种慢性、进行性肺部疾病, 其特征为肺组织中细胞外基质过度沉积以及正常肺组织瘢痕化, 导致肺功能逐渐丧失^[1]。特发性肺纤维化(idiopathic pulnomary fibrosis, IPF) 患者的中位生存期仅为3~5年^[2], 当前针对肺纤维化的治疗手段十分有限且存在较大局限性。尽管目前几种针对肺纤维化的药物, 如吡非尼酮和尼达尼布, 已经得到上市批准, 但这些治疗方案通常只能缓解症状而无法达到治疗效果; 此外, 一些抗炎药物和免疫抑制剂能够减轻肺部炎症, 但其往往伴有严重不良反应, 无法达到理想临床效果; 另外, 肺部康复、供氧治疗能够改善患者生活质量, 但难以停止疾病进展; 对于严重肺纤维化患者, 肺移植是唯一治疗手段, 但始终存在手术风险、排斥反应、供体短缺等问题^[3]。因此, 深入研究肺纤维化的发病机制、开发靶向药物迫在眉睫。

成纤维细胞的过度活化是肺纤维化发病的关键起始因素^[4]: 成纤维细胞在细胞因子如转化生长因子β (transforming growth factor β, TGF-β) 的刺激下, 增殖分化为肌成纤维细胞, 过量合成及分泌包括胶原蛋白(collagen)、纤连蛋白(fibronectin) 在内的细胞外基质(extracellular matrix, ECM), 导致结缔组织过度沉积, 促进肺纤维化发病。TGF-β是目前研究最广泛的促纤维化因子, 在成纤维细胞活化中发挥重要功能^[5]。经典的TGF-β信号转导主要通过结合TGF-β受体, 磷酸化SMAD2/3, 与SMAD4形成复合物, 入核调控基因转录, 促进纤维化相关蛋白表达, 推动肺纤维化疾病进程。近期研究发现, 活性氧(reactive oxygen species, ROS) 在调节TGF-β信号通路中发挥重要作用^[6]。一方面, ROS通过SMAD^[7]、MAPK^[8]、Rho-GTPase^[9]等信号通路活化TGF-β信号通路^[6]; 另一方面, TGF-β通过抑制线粒体功能^[10]、诱导NADPH氧化酶^[11]、抑制抗氧化系统^[12]等机制, 促进ROS的产生^[13], 进而导致氧化应激及氧化还原失衡, 该失衡状态进一步维持TGF-β的促纤维化作用^{[6, 14]}。因此, 靶向TGF-β与ROS循环可能具有一定的抗肺纤维化前景。

天然药物在治疗肺纤维化方面的研究相对较少, 市场上针对此病的中药产品稀缺, 反映了在传统治疗方法中还存在着明显的研发不足。汉防己甲素(tetrandrine, TET) 是一种从传统中药粉防己中提取的双苯并异喹啉生物碱, 具有抗炎、抗纤维化和免疫调节作用, 临床多用于风湿痛、关节痛及硅肺病的治疗^{[15, 16]}。有研究表明, TET能够改善小鼠特定病理条件下的生理状态及存活率^{[17, 18]}; 此外, 在单次博来霉素(single bleomycin, sBLM) 诱导的肺纤维化中也能发挥一定的抗纤维化作用^[19], 但其在多次博来霉素(multiple bleomycin, mBLM) 诱导的慢性肺纤维化模型中的抗纤维化作用及其抑制ROS产生的生物学机制尚不明确。本研究观察了TET在慢性肺纤维化模型中抗纤维化的药理学作用, 同时分析了TET抑制TGF-β/SMAD信号通路与ROS产生循环的分子机制。本研究不仅为理解汉防己甲素的治疗机制提供了新的见解, 也为开发新的抗肺纤维化药物策略提供了理论依据。

材料与方法

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细胞人肺成纤维细胞MRC5、小鼠肺成纤维细胞MLg购自ATCC; HEK293T购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

质粒 LentiCas9-blast质粒(plasmid #52962)、MMT文库(Mouse CRISPR Deletion Library-Trafficking, mitochondrial, motility) (1000000126) 购自Addgene。

试剂及仪器 博来霉素(bleomycin, BLM, C0022) 购自北京兰杰柯科技有限公司; 汉防己甲素(HY-13764) 购自美国MCE公司; 人源TGF-β1 (CA59)、鼠源TGF-β1 (CK33) 购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司; CCK8 (T005-00000005) 购自上海陶术生物科技有限公司; LipofectamineTM 3000 (L3000015) 购自美国Invitrogen公司; 2× Phanta Flash Master Mix (P510) 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司; 羟脯氨酸测定试剂盒(A030-2-1) 购自南京建成生物工程技术有限公司; 活性氧检测试剂盒(CA1410) 购自北京索莱宝科技有限公司; α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) 抗体(Ab5694)、I型胶原(collagen I) 抗体(Ab260043)、SMAD3 (phosphoS208) 抗体(Ab192195) 购自英国Abcam公司; 波形蛋白(vimentin) 抗体(5741S)、SMAD3抗体(9523S) 购自美国CST公司; 纤维连接蛋白(fibronectin) 抗体(15613-1-AP) 购自武汉三鹰生物技术有限公司; CRISPR-Cas9 SP antibody (CY6852) 购自上海泊湾生物技术有限公司; 实验相关qPCR引物序列[FN1、Vim、Acta2、Col1A1、血管紧张素II 1型受体相关蛋白(angiotensin II type 1 receptor associated protein, Agtrap)、膜棕榈酰化蛋白6 (membrane palmitoylated protein 6, Mpp6) 等] 来源于Origene官网; Agtrap、Mpp6的sgRNA序列: sgAgtrap-F: 5'-CACCGCACATGCACCGTGAACGAGG-3', sgAgtrap-R: 5'-AAACCCTCGTTCACGGTGCATGTGC-3'; sgMpp6-F: 5'-CACCGGGAGGAATGATAGATCGACA-3', sgMpp6-R: 5'-AAACTGTCGATCTATCATTCCTCCC-3'。DYY-7C型电泳仪购自北京六一生物技术有限公司; Bio-Rad电泳仪及湿转系统购自美国Bio-Rad公司、Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统购自上海天能生命科学有限公司; ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司; FlexiVent肺功能分析系统购自加拿大SCIREQ公司; CKX41倒置显微镜、CX33显微镜购自日本OLYMPUS公司; Beckman Coulter流式细胞仪(A00-1-1102) 购自美国Beckman公司。

肺纤维化动物模型 本研究所有动物实验均通过中国医学科学院医药生物技术研究所伦理审查委员会审查(IMB-20230406D507)。雄性C57BL/6J小鼠, SPF级别, 22 g, 6~8周龄, 购自斯贝福(北京) 生物技术有限公司(实验动物许可证号: 002802)。多次博莱霉素诱导肺纤维化模型制备方法: 使用三溴乙醇通过腹腔注射麻醉小鼠, 随后气管插管滴注50 μL博莱霉素(1 U·kg^-1)^[20], 给药后立起并迅速旋转操作板, 使博莱霉素能够均匀进入左右各肺叶, 直立放置5 min, 取下放回鼠笼, 等待苏醒。小鼠每2周造模1次, 共6次^[21]。在最后一次造模后第10天开始, 通过灌胃方式给予汉防己甲素(10 mg·kg^-1), 连续治疗30天后进行分析。

小鼠肺功能检测 小鼠使用三溴乙醇麻醉后通过气管插管与Flexivent小动物肺功能仪连接, 检测小鼠的深吸气量(inspiratory capacity, IC) 及动态顺应性(respiratory system compliance, Crs) 数据, 并进行数据分析。

羟脯氨酸含量检测 称量小鼠左肺湿重, 取30~100 mg组织, 后续按照试剂盒说明书进行操作: 1.5 mL离心管中加入550 μL水解液, 95 ℃金属浴水解20 min, 转移到10 mL离心管中调节pH值后定容, 每管取相同体积经活性炭吸附处理后离心, 取200 μL上清于96孔板中, 检测450 nm处的吸光度, 并根据肺湿重计算羟脯氨酸的含量。具体操作步骤详见南京建成公司羟脯氨酸测定试剂盒(碱水解法) (A030-2-1) 说明书。

形态学和组织学分析 将利用4%多聚甲醛固定的肺组织包埋在石蜡中并进行切片(厚度5 μm)。对切片进行H & E和Masson三色染色以评估肺组织病理变化, 使用光学显微镜在100×放大倍数下进行图像采集。根据Szapiel评分标准^[22]和Ashcroft评分标准^[23], 分别对肺泡炎程度和纤维化程度进行评分。

人原代成纤维细胞分离 在无菌超净工作台中, 将人肺组织切割成数个2 mm×2 mm的小块, 置于T75培养瓶中, 倒置于37 ℃、5% CO₂环境的细胞培养箱中培养2 h后, 将培养瓶翻转至正向位置, 加入1 mL完全培养基(DMEM+10% FBS+2% 双抗), 继续培养两天, 等待成纤维细胞从肺组织块中迁出后, 对细胞进行消化处理及传代培养。

半数抑制浓度(IC₅₀) 检测 各种细胞计数并接种至96孔板中; 从20 μmol·L^-1开始等比梯度稀释10个浓度给予TET, 共10组, 每组6次重复; 24 h后, 每孔加入10 μL CCK-8试剂, 37 ℃细胞培养箱内孵育2 h, 在酶标仪450 nm处测定吸光度, 利用GraphPad Prism 6.0计算IC₅₀。

蛋白免疫印迹 收集细胞, RIPA裂解液提取蛋白, BCA法进行蛋白定量, 加入5× loading, 98 ℃变性10 min, SDS-PAGE电泳后进行湿转, 5% BSA封闭液室温封闭1 h; 一抗4 ℃孵育过夜, 次日TBST洗涤3次, 每次10 min; 二抗室温孵育2 h, TBST洗涤3次, 每次10 min; 1∶1混合ECL发光液后使用Tanon发光成像系统进行曝光及图像采集, 利用ImageJ对Western blot图片进行归一化定量。

实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR) 使用Cell/Tissue Total RNA Kit (RN001) 试剂盒提取细胞总RNA, 利用NanoDrop2000进行定量; 使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix (AT311) 进行逆转录得到cDNA; 根据NovoStart SYBR Qpcr SuperMix Plus (E096-01A) 说明书进行相应qPCR反应。

流式细胞术检测ROS生成以及流式分选 利用胰酶消化收集经药物处理的成纤维细胞, 利用ROS检测试剂盒(CA1410) 在避光、37 ℃条件下染色20 min, 具体操作步骤详见说明书; 清洗3次后, 使用Beckman Coulter流式细胞仪对20 000个活细胞发出的DCF-DA荧光进行定量, 并使用Flow-jo 10.8.1进行数据分析。MLg-Cas9-MMT细胞经ROS试剂盒染色后利用中国医学科学院基础医学研究所的流式细胞分选器ARIA III进行流式分选, 分选得到FITC阳性及阴性细胞。

病毒包装 在无血清DMEM培养基分别加入慢病毒骨架蛋白5.4 μg pMD2.G、2.7 μg psPAX2及10.6 μg目标质粒, 之后加入153 µL PEI转染试剂并温和混匀, 室温静置10 min, 将预混合的转染液均匀地添加到15 cm细胞培养皿的HEK293T细胞中, 培养72 h后, 收集上清, 加入6×病毒浓缩试剂, 4 ℃过夜静置; 次日3 500 ×g, 4 ℃离心25 min, 按照原体积的1/50加入完全培养基重悬沉淀, 分装置于-80 ℃备用。

Cas9稳转细胞株及MMT文库感染 使用Lipo3000转染试剂, 将Lenti-Cas9-BSD质粒转染至MLg细胞, 48 h后加入杀稻瘟菌素(5 μg·mL^-1), 持续培养72 h, 获得Cas9稳定转染的MLg-Cas9细胞系; 使用MMT病毒文库感染MLg细胞, 48 h后加入嘌呤霉素(1 μg·mL^-1), 确定MOI=0.3时的病毒用量; 使用MOI=0.3的病毒量感染MLg-Cas9细胞, 72 h后加入嘌呤霉素(1 μg·mL^-1), 获得MLg-Cas9-MMT细胞。

基因组DNA提取, 建库测序及分析 流式分选后收集ROS阳性及ROS阴性细胞, 利用通用型柱式基因组DNA提取试剂盒(CW2298S) 进行DNA的提取, 具体步骤详见说明书。使用建库引物oMCB_1562 (5'-AGGCTTGGATTTCTATAACTTCGTATAGCATAC-ATTAC-3') 和oMCB_1563 (5'-ACATGCATGGCGGTAATACGGTTATC-3') 以及引物oMCB_1349 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCACAAA-AGGAAACTCACCCT-3') 和条形码引物(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCAGTCACATAT-ATATCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3') 进行PCR建库, 高通量测序由安诺优达基因科技(北京) 有限公司完成, CRISPR/Cas9筛选下游分析基于MAGeCK算法完成^[24]。

统计学分析 本文所有实验数据均采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。两组参数之间的差异采用非配对Student's t检验进行比较; 两组以上参数之间的差异采用单因素方差分析(one way ANOVA) 进行比较。所有数据均采用平均值(mean) ±标准误(standard error of mean, SEM) 表示。

结果

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1 TET改善慢性肺纤维化病理改变

TET在二氧化硅及sBLM诱导的小鼠肺纤维化模型已被证明具备显著的抗炎和抗纤维化能力^{[15, 16, 25]}, 但在慢性肺纤维化小鼠模型中的药理学作用未知。因此, 本研究采用mBLM诱导慢性肺纤维化模型, 观察TET的抗肺纤维化作用(图 1A)。虽然mBLM处理的小鼠体重没有明显变化(图 1B), 但肺功能检测显示其深吸气量(IC) 以及呼吸系统顺应性(Crs) 显著降低(图 1C); 此外, 其肺重指数(图 1D) 和肺部羟脯氨酸含量(图 1E) 显著增加; 肺组织切片的H & E和Masson染色结果同样显示, mBLM小鼠肺部组织结构紊乱, 肺泡壁增厚, 肺泡及间质腔内存在大量的炎性细胞浸润及纤维化病理改变, 炎症评分和纤维化评分显著升高(图 1F、G), 这些结果均证明肺部发生了明显的纤维化病理改变。令人欣喜的是, 经过连续30天每日给予小鼠10 mg·kg^-1 TET治疗后, 小鼠体重并未发生显著变化, 同时其肺功能得到明显改善, 肺重指数和肺部羟脯氨酸含量显著降低, 炎症及纤维化评分显著下降(图 1B~G)。这些结果表明, TET对于mBLM诱导的慢性肺纤维化具有良好的治疗效果。

2 TET通过抑制TGF-β/SMAD3信号通路、降低ROS水平抑制成纤维细胞活化

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TET已被证明能够抑制成纤维细胞活化^[26], 但具体机制尚未阐明。因此, 本研究进一步评估TET对TGF-β1诱导的原代人肺成纤维细胞(pulmonary lung fibroblast, PLF)、人肺成纤维细胞系MRC5以及小鼠肺成纤维细胞系MLg活化的抑制作用。通过CCK-8检测, 本课题组首先确定了TET在这3种细胞系中24 h的IC₅₀分别为4.979、4.942、8.763 μmol·L^-1 (图 2A~C), 据此确定TET的最高加药浓度为10 μmol·L^-1。随后, 向TGF-β1 (10 ng·mL^-1) 诱导的成纤维细胞添加不同浓度的TET (0.5、1、5、10 μmol·L^-1), 检测成纤维细胞的活化指标。结果显示, 成纤维细胞活化相关蛋白, 包括fibronectin、collagen I、vimentin和α-SMA的蛋白表达水平均在TGF-β1诱导后显著上调, 而TET能够剂量依赖性地抑制上述活化相关蛋白的表达(图 2D~F); 同时, TET对这些蛋白的基因转录水平同样存在抑制效果(图 2G~I)。此外, 明场观察进一步证实, 0.5 μmol·L^-1 TET即能显著抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞活化及其伴随的形态学变化, 具体表现为细胞极化现象明显减少(图 2J)。上述结果说明, TET能够有效抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞活化。

在肺纤维化进展过程中, TGF-β激活SMAD信号通路、升高细胞内ROS水平是成纤维细胞活化和纤维化形成的关键因素之一^[27]。本研究发现, TET能剂量依赖性地抑制TGF-β1诱导的Smad3蛋白磷酸化(图 2D~F); 此外, 流式细胞术分析显示, TET同样能够剂量依赖性抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞内的ROS水平升高(图 2K)。以上结果表明, TET能够抑制TGF-β/SMAD3信号通路, 降低ROS水平, 从而抑制成纤维细胞的活化。

3 筛选TET降低成纤维细胞ROS水平的关键基因

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线粒体是ROS的主要来源, 在产生ATP的同时, 线粒体消耗氧气并产生ROS^[28]。因此, 为了研究TET调控成纤维细胞ROS水平的关键基因, 本研究进一步采用CRISPR/Cas9文库筛选技术, 在过表达Cas9蛋白的小鼠成纤维细胞株中感染线粒体相关基因文库, 获得MLg-Cas9-MMT细胞株, 实现了MLg细胞中线粒体相关基因的敲除(图 3A、B)。在TGF-β1 (10 ng·mL^-1) 刺激下, MLg-Cas9-MMT细胞经0.5 μmol·L^-1 TET处理, 并使用ROS检测试剂盒中DCFH-DA染料进行染色, 之后利用流式分选技术分离ROS水平高(FITC阳性) 和ROS水平低(FITC阴性) 的细胞(图 3C)。随后, 从这些细胞中提取基因组DNA, 构建文库进行高通量测序, 利用MAGeCK算法进行下游分析(图 3D); 并结合GEO数据库中肺纤维化数据集(GSE173355、GSE47460) 的表达量分析(图 3E) 及相关性分析(图 3F) 结果, 识别到TET调节ROS水平、抑制肺纤维化的关键基因: 高通量测序结果显示, Agtrap与Mpp6基因在筛选结果中排名靠前(图 3D); 表达量分析显示, Agtrap与Mpp6在肺纤维化患者中显著下调(图 3E); 且与一氧化碳弥散量(DLCO)、支气管扩张剂前用力肺活量(FVC_pre_bd)、支气管扩张剂前第一秒用力呼气量(FEV1_pre_bd) 3种肺功能指标均呈正相关(图 3F); 另外, 在PLF、MRC5、MLg3种成纤维细胞接受TGF-β1刺激后, Agtrap和Mpp6基因表达显著下降, 而在TET治疗后, 两种基因表达水平随TET浓度增加有明显上升(图 3G)。上述结果提示, TET可能通过表达AGTRAP及MPP6蛋白降低ROS水平, 抑制成纤维细胞活化。

4 TET通过AGTRAP及MPP6抑制ROS水平

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先前研究表明, AGTRAP^[29]能够特异性结合血管紧张素II 1型受体AT1R并促进其内化, 从而抑制ROS产生、抑制成纤维细胞活化及促纤维化级联反应。MPP6是构成外周膜相关鸟苷酸激酶(MAGUK) 的重要亚家族之一, 参与细胞黏附、细胞极性调节等多种生物学过程, 其缺失能够显著提高细胞ROS水平, 影响线粒体功能及细胞活性^[30], 对成纤维细胞的活化和极化有抑制作用。为了进一步探索AGTRAP和MPP6在TET抑制成纤维细胞活化中的作用, 本研究利用CRISPR/Cas9技术在MLg-Cas9细胞中敲除Agtrap和Mpp6基因(图 4A、B), 随后检测在基因缺失条件下TET对TGF-β1诱导的成纤维细胞活化的抑制作用。通过Western blot (图 4C~E) 和qPCR (图 4F~H) 分析显示, 与对照组相比, 敲除Agtrap和Mpp6的细胞中, TET对TGF-β1诱导表达的fibronectin、vimentin、collagen I、α-SMA以及Smad3蛋白磷酸化形式的抑制能力显著减弱。这表明敲除这两个基因降低了TET对成纤维细胞活化的抑制作用。此外, 明场观察进一步发现, 在Agtrap及Mpp6基因缺失的条件下, TET抑制成纤维细胞向更细长形态的转变能力也明显减弱(图 4I)。同时, 流式细胞术结果也显示, TET对ROS的抑制作用在Agtrap及Mpp6缺失后同样有所下降(图 4J)。以上结果均提示, TET可能通过表达AGTRAP和MPP6降低ROS水平, 从而抑制成纤维细胞活化。

讨论

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肺纤维化始终是人类难以攻克的慢性疾病, 治疗手段十分有限^[3]。虽然已有吡非尼酮和尼达尼布作为治疗用药, 但疗效不佳且不良反应明显^[31]。中药活性成分由于成本低、毒副作用小、易于获得等特点, 为肺纤维化的治疗提供了新的选择。

TET源自植物粉防己, 已显示出明显的抗炎、抗纤维化作用^[15], 且在矽肺治疗的临床应用上已有50余年历史^[32]。研究表明, TET在不同的动物模型中通过调节自噬^[33]、抑制炎症通路^[25]等多种机制, 减轻肺部炎症, 发挥抗纤维化作用。然而, 以往研究采用的动物模型均有其局限性: 如二氧化硅模型更贴近硅肺特征^[34]; 高氧及sBLM诱导则倾向于模拟急性肺损伤, 且纤维化进程会自行消退; 这些模型均未能完全再现人类肺纤维化疾病的复杂性^[35]。相较之下, mBLM模型通过模拟肺损伤的反复发生, 更贴近人类肺纤维化的病理特征^[36]。因此, 本研究通过重复气管内滴注博来霉素(1 U·kg^-1)^{[21, 36]}, 更准确地模拟人类慢性肺纤维化的发病进程, 从而进行TET治疗肺纤维化的机制探索。

成纤维细胞活化是肺纤维化形成和发展的关键驱动因素^[37], 在此过程中, TGF-β作为一种主要的促纤维化因子^[38], 通过SMAD途径(经典途径) 发挥作用。近期研究发现, TGF-β1能够通过激活SMAD3信号通路促进NADPH氧化酶4 (NOX4) 基因表达^[11], 并且通过抑制抗氧化酶[如过氧化氢酶^[39]、超氧化物歧化酶(SOD)^[12]或谷胱甘肽^[40]] 的表达, 影响线粒体功能及其代谢产物水平, 促进ROS水平升高^{[10, 13, 41]}; 增加的ROS则能通过诱导NOX4表达^[42]、激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、抑制MAPK磷酸酶功能^[6]或刺激大量炎症介质产生^[43], 进一步激活TGF-β/SMAD信号通路, 最终导致成纤维细胞活化和肺纤维化形成^[6]。本研究证明, 通过抑制TGF-β/SMAD3通路的激活及ROS的产生, TET能够显著抑制成纤维细胞活化及肺纤维化进展。

血管紧张素II (Ang II) 作为肾素-血管紧张素系统的关键神经激素配体, 能够结合AT1R, 诱导炎症, 产生ROS, 促进成纤维细胞活化及纤维化疾病进展^{[44, 45]}, 而AGTRAP作为血管紧张素II 1型受体AT1R的特异性结合蛋白^{[46, 47]}, 能够促进AT1R内化, 抑制该过程的ROS产生及后续的纤维化进程^[48]。研究表明, Agtrap敲除会导致线粒体异常, 增加ROS产生, 加剧肾纤维化进程^[29]; MPP6是构成外周膜相关鸟苷酸激酶(MAGUK) 的重要亚家族之一, 参与细胞黏附、细胞极性调节等多种生物学过程, 研究人员^[49]发现Mpp6缺失能够显著提高卵母细胞ROS水平, 影响线粒体功能从而改变卵母细胞活性。上述研究证明, AGTRAP和MPP6能够影响线粒体代谢功能及ROS水平, 但其与肺纤维化的关系尚不清楚。本研究不仅通过体内外实验证明了TET对肺纤维化及成纤维细胞活化的抑制作用; 同时通过CRISPR/Cas9文库筛选技术揭示了TET能够通过促进AGTRAP与MPP6的表达, 抑制TGF-β/SMAD3信号通路及ROS产生, 发挥抗肺纤维化作用; 因此, Agtrap与Mpp6可能是TET抗纤维化作用的潜在靶点。然而, 本研究主要依赖体外细胞实验模型探究TET抗肺纤维化的作用机制, 其在体内模型中的效果尚待验证; 此外, Agtrap与Mpp6等线粒体相关基因在肺纤维化中的具体功能, 以及TET调控其表达的分子机制仍需深入研究。综上所述, 本研究不仅探索了TET在慢性肺纤维化治疗中的应用前景, 筛选了其潜在的靶点, 也为开发新的抗肺纤维化治疗策略提供了新的选择。

作者贡献: 严业超负责Western blot、qPCR、流式细胞术等实验工作; 郭春佚负责细胞实验及流式分选工作; 张家铭负责数据分析及文献整理工作; 李云炫负责相关动物实验及数据库分析工作; 李珂为文章框架的构思者及负责人。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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国家重点研发计划(2022YFA1106100)
国家自然科学基金资助项目(82222070)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

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2024年第59卷第8期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0313

接收时间：2024-04-02
首发时间：2025-11-26
出版时间：2024-08-12

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作者

出版历史

收稿日期：2024-04-02
修回日期：2024-05-11

基金

国家重点研发计划(2022YFA1106100)

国家自然科学基金资助项目(82222070)

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 北京 100050

通讯作者:

^*李珂, Tel / Fax: 86-10-63024341, E-mail: like1986@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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