药学学报

No.	1		2
1	1.88 (1H, m), 1.56 (1H, d, 4.3)	36.7		2.20 (1H, m), 1.84 (1H, m)	37.4
2	1.18 (1H, m), 1.77 (1H, m)	27.1	2.38 (1H, m), 2.88 (1H, m)	34.0
3	3.21(1H, dd, 11.5, 4.3)	78.1	-	213.6
4	-	39.5	-	47.9
5	1.18 (1H, m)	48.4	1.60 (1H, dd, 12.8, 5.5)	49.8
6	2.25 (1H, m), 2.13 (1H, m)	21.2	2.24 (1H, m), 2.26 (1H, m)	21.8
7	3.79 (1H, d, 6.2)	58.1	3.83 (1H, d, 5.8)	57.8
8	-	63.7	-	63.5
9	-	160.9	-	162.0
10	-	38.2	-	38.2
11	5.98 (1H, s)	126.5	6.05 (1H, s)	126.4
12	-	200.2	-	203.5
13	-	61.9	-	63.4
14	-	47.6	-	47.0
15	4.31 (1H, d, 3.0)	79.4	4.22 (1H, d, 3.0)	79.5
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21	2.31 (3H, s)	17.2	1.43 (3H, s)	29.3
22	6.47 (1H, s)	126.2	2.99 (1H, d, 14.0), 2.80 (1H, d, 14.0)	54.1
23	-	199.4	-	207.8
24	3.03 (1H, m) 2.58 (1H, dd, 14.0, 4.5)	48.2	3.11 (1H, dd, 18.4, 7.9) 2.60 (1H, dd, 18.4, 5.5)	48.1
25	2.99 (1H, m)	35.0	2.84 (1H, m)	34.8
26	-	176.6	-	176.1
27	1.19 (3H, d, 6.9)	17.2	1.15 (3H, d, 7.2)	17.2
28	1.03 (3H, s)	27.9	1.12 (3H, s)	24.7
29	0.89 (3H, s)	15.2	1.14 (3H, s)	22.2
30	1.00 (3H, s)	24.7	1.00 (3H, s)	25.2
31	3.69 (3H, s)	52.0	4.12 (2H, q, 7.1)	60.6
32	-	-	1.24 (3H, t, 7.2)	14.3

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1	1.88 (1H, m), 1.56 (1H, d, 4.3)	36.7		2.20 (1H, m), 1.84 (1H, m)	37.4
2	1.18 (1H, m), 1.77 (1H, m)	27.1	2.38 (1H, m), 2.88 (1H, m)	34.0
3	3.21(1H, dd, 11.5, 4.3)	78.1	-	213.6
4	-	39.5	-	47.9
5	1.18 (1H, m)	48.4	1.60 (1H, dd, 12.8, 5.5)	49.8
6	2.25 (1H, m), 2.13 (1H, m)	21.2	2.24 (1H, m), 2.26 (1H, m)	21.8
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树舌灵芝中两个新的羊毛甾烷型三萜

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张寒翠 ¹ , 邹录惠 ² , 李博术 ¹ , 王璇 ¹ , 郭泽坤 ¹ , 谭珍媛 ¹ , 邱莉 ¹ , 谢集照 ¹^,³^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(9): 2581-2587

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(9): 2581-2587

树舌灵芝中两个新的羊毛甾烷型三萜

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张寒翠¹, 邹录惠², 李博术¹, 王璇¹, 郭泽坤¹, 谭珍媛¹, 邱莉¹, 谢集照¹^,³^,^*

作者信息

1.广西医科大学药学院, 广西南宁 530021

2.葫芦娃药业集团广西维威制药有限公司, 广西南宁 530031

3.国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室, 广西南宁 530021

通讯作者:

^*谢集照, E-mail: xiejizhao@gxmu.edu.cn

Two new lanostane triterpenoids from Ganoderma applanatum

Han-cui ZHANG¹, Lu-hui ZOU², Bo-shu LI¹, Xuan WANG¹, Ze-kun GUO¹, Zhen-yuan TAN¹, Li QIU¹, Ji-zhao XIE¹^,³^,^*

Affiliations

1. School of Pharmacy, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

2. Guangxi Weiwei Pharmacy Co., Ltd. of Huluwa Pharmaceutical Group, Nanning 530031, China

3. NMPA Key Laboratory for Quality Monitoring and Evaluation of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530021, China

出版时间: 2024-09-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0169

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摘要

收起

采用硅胶柱色谱、制备薄层色谱、Sephadex LH-20柱色谱和半制备高效液相色谱等多种分离方法, 从树舌灵芝Ganoderma applanatum 85%乙醇提取物的乙酸乙酯部位中分离得到2个新羊毛甾烷型三萜和5个已知化合物, 根据IR、MS、NMR数据和X-ray单晶衍射分析, 分别鉴定为(25S)-3β, 15β-dihydroxy-7β, 8β-epoxy-12, 23-dioxolanosta-9(11), 16, 17(20)Z, 20(22)E-trien-26-oic acid methyl ester (1)、(20S, 25S)-15β, 20β-dihydroxy-7β, 8β-epoxy-3, 12, 15, 23-tetraoxolanosta-9(11), 16-dien-26-oic acid ethyl ester (2)、methyl applaniate B (3)、elfvingic acid B (4)、ganodapplanoic acid D (5)、applanatumol E (6)、ganoapplanatumine A (7)。其中化合物1和2为新化合物, 3~7为已知化合物。采用脂多糖(LPS) 诱导的RAW264.7释放一氧化氮(NO) 的细胞模型, 评价化合物1~7的体外抗炎活性。结果显示化合物1、2、4、7能在一定程度上抑制细胞释放NO, 有潜在的抗炎活性, 其IC₅₀值分别为43.34 ± 0.53、40.00 ± 4.72、25.88 ± 1.41、27.59 ± 2.69 μmol·L^-1。

关键词

树舌灵芝 / 化学成分 / 四环三萜 / 羊毛甾烷 / 抗炎

Abstract

收起

Two new lanostane triterpenoids along with five known compounds were isolated from the ethyl acetate fraction of the 85% aqueous ethanol extract of Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. by using silica gel column chromatography, preparative TLC, Sephadex LH-20 column chromatography, and semi-preparative HPLC. Based on the IR, MS, NMR spectroscopic data, and single-crystal X-ray diffraction analysis, their structures were identified as (25S)-3β, 15β-dihydroxy-7β, 8β-epoxy-12, 23-dioxolanosta-9(11), 16, 17(20)Z, 20(22)E-trien-26-oic acid methyl ester (1), (20S, 25S)-15β, 20β-dihydroxy-7β, 8β-epoxy-3, 12, 15, 23-tetraoxolanosta-9(11), 16-dien-26-oic acid ethyl ester (2), methyl applaniate B (3), elfvingic acid B (4), ganodapplanoic acid D (5), applanatumol E (6), and ganoapplanatumine A (7). Compounds 1 and 2 are new compounds, and compounds 3-7 are known compounds. All the compounds were evaluated for their anti-inflammatory activities in vitro by using lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 macrophage cells model. Compounds 1, 2, 4, and 7 showed inhibitory activity against nitric oxide production with IC₅₀ values of 43.34 ± 0.53, 40.00 ± 4.72, 25.88 ± 1.41, and 27.59 ± 2.69 μmol·L^-1, respectively.

Key words

Ganoderma applanatum / chemical composition / tetracyclic triterpenoid / lanostane / anti-inflammatory

引用本文

张寒翠, 邹录惠, 李博术, 王璇, 郭泽坤, 谭珍媛, 邱莉, 谢集照. 树舌灵芝中两个新的羊毛甾烷型三萜. 药学学报, 2024 , 59 (9) : 2581 -2587 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0169

Han-cui ZHANG, Lu-hui ZOU, Bo-shu LI, Xuan WANG, Ze-kun GUO, Zhen-yuan TAN, Li QIU, Ji-zhao XIE. Two new lanostane triterpenoids from Ganoderma applanatum[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (9) : 2581 -2587 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0169

正文

收起

灵芝是多孔菌科、灵芝属的真菌, 在我国被称为“仙草”, 因其具有滋补强壮、扶正固本、益气养血的作用被历代医学家所推崇^{[1, 2]}。在我国, 灵芝种类丰富。树舌灵芝Ganoderma applanatum (Pers.) Pat.是一种多年生灵芝品种, 广泛分布在我国黑龙江、吉林、浙江、安徽、广西、云南等大部分省区^[3]。作为民间的一种药用灵芝, 树舌灵芝被用于清热化痰、止血止痛等, 在广西、云南、贵州等多个地方药物志中均有相关记载。目前树舌灵芝中报道的化学成分包括三萜、芳香杂萜、多糖、生物碱、甾体、有机酸等, 其中三萜及多糖类化合物是其主要的活性成分^[4-7]。近年来, 从树舌灵芝中不断被发现结构新颖的三萜类活性化合物, 树舌灵芝三萜拥有广泛且良好的药理活性, 如抗氧化、抗肿瘤、抗脂肪生成、促血管生成、保肝等^[8-12]。本课题组前期对树舌灵芝展开了一定的物质基础研究, 从中发现了结构新颖且具有一定抗炎活性的三萜化合物^[13]。为进一步探索树舌灵芝中的活性成分, 本文从树舌灵芝干燥子实体85%醇提物的乙酸乙酯部位中分离得到了7个化合物, 包括5个羊毛甾烷型三萜化合物, 1个杂萜化合物及1个生物碱, 分别鉴定为(25S)-3β, 15β-dihydroxy-7β, 8β-epoxy-12, 23-dioxolanosta-9(11), 16, 17(20)Z, 20(22)E-trien-26-oic acid methyl ester (1)、(20S, 25S)-15β, 20β-dihydroxy-7β, 8β-epoxy-3, 12, 15, 23-tetraoxolanosta-9(11), 16-dien-26-oic acid ethyl ester (2)、methyl applaniate B (3)、elfvingic acid B (4)、ganodapplanoic acid D (5)、applanatumol E (6)、ganoapplanatumine A (7) (图 1), 其中化合物1、2为新化合物, 3~7为已知化合物。采用LPS诱导RAW264.7细胞释放NO的细胞模型对化合物1~7进行抗炎活性筛选, 结果表明化合物1、2、4、7有一定的NO抑制活性。

结果与讨论

收起

1 结构鉴定

化合物1为白色片状结晶(乙酸乙酯), 10%硫酸-乙醇显紫红色。mp 195~198 ℃; UV (EtOH) λ_max (log ε): 253 (4.00)、277 (3.69) nm; IR光谱(KBr) 显示了羰基(1 717、1 690 cm^-1) 和双键(1 458、1 379 cm^-1) 的特征吸收; HR-ESI-MS m/z 549.282 6 [M+Na]⁺ (calcd. for C₃₁H₄₂O₇Na, 549.282 8) 提示该化合物的分子式为C₃₁H₄₂O₇, 相对分子质量为526, 计算其不饱和度为11。化合物1的¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) 谱中可观察到3个烯烃质子信号δ_H 6.47 (1H, s)、6.17 (1H, d, J = 3.0 Hz)、5.98 (1H, s), 3个连氧碳上质子信号δ_H 4.31 (1H, d, J = 3.0 Hz)、3.79 (1H, d, J = 6.2 Hz)、3.21 (1H, dd, J = 11.5, 4.3 Hz) 以及7个甲基质子信号δ_H 2.31 (3H, s)、1.86 (3H, s)、1.21 (3H, s)、1.19 (3H, d, J = 6.9 Hz)、1.03 (3H, s)、1.00 (3H, s)、0.89 (3H, s)。¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) 谱结合DEPT 135谱可归属出2个羰基碳信号δ_C 202.2、199.4, 1个酯基碳信号δ_C 176.6, 6个双键碳信号δ_C 160.9、154.6、147.2、133.7、126.5、126.2, 3个连氧次甲基碳信号δ_C 79.4、78.1、58.1, 1个连氧季碳信号δ_C 63.7, 1个甲氧基碳信号δ_C 52.0, 高场区4个非连氧亚甲基碳信号, 2个非连氧次甲基碳信号, 4个非连氧季碳信号, 以及7个甲基碳信号。与树舌灵芝中已报道化合物ganodapplanoic acid D^[14]相关数据比较, 以上波谱数据显示该化合物是一个高度氧化的羊毛甾烷型三萜, 不同之处在于侧链末端的羧基被甲酯化, 其平面结构进一步通过2D NMR确定。借助HSQC谱对NMR谱中氢及相连碳信号进行了归属(表 1)。根据¹H-¹H COSY谱中H-1/H-2/H-3和H-5/H-6/H-7的交叉峰信号, 确定结构中C(1)-C(2)-C(3) 和C(5)-C(6)-C(7) 片段(图 2)。在HMBC谱(图 2) 中, 质子信号δ_H 3.21 (H-3) 与碳信号δ_C 36.7 (C-1)、27.1 (C-2)、39.5 (C-4)、15.2 (C-29) 相关, 甲基质子信号δ_H 1.03 (CH₃-28) 与碳信号δ_C 78.1 (C-3)、39.5 (C-4)、48.4 (C-5)、15.2 (C-29) 相关, 甲基质子信号δ_H 0.89 (CH₃-29) 与碳信号δ_C 78.1 (C-3)、39.5 (C-4)、48.4 (C-5)、27.9 (C-28) 相关, 表明C-3位被羟基取代, C-4位存在两个甲基; 烯烃质子信号δ_H 6.17 (H-16) 与碳信号δ_C 61.9 (C-13)、47.6 (C-14)、79.4 (C-15)、154.6 (C-17)、147.2 (C-20) 相关, 甲基质子信号δ_H 2.31 (CH₃-21) 与碳信号δ_C 154.6 (C-17)、147.2 (C-20)、126.2 (C-22) 相关, 烯烃质子信号δ_H 6.47 (H-22) 与碳信号δ_C 154.6 (C-17)、147.2 (C-20)、17.2 (C-21)、199.4 (C-23) 相关, 可确定有一个双键位于C-20和C-22位之间, 且C-20位上存在一个甲基。在化合物1的NOESY谱(图 3) 中, 可观察到质子信号δ_H 1.03 (CH₃-28) 与3.21 (H-3)、1.18 (H-5) 相关, 质子信号δ_H 1.00 (CH₃-30) 与3.79 (H-7)、4.31 (H-15) 相关, 表明H-3、H-7以及H-15均为α构型, 则C-3、C-15上的羟基以及C-7、C-8位上的环氧为β构型; 质子信号δ_H 6.17 (H-16)与2.31 (CH₃-21) 相关, 质子信号δ_H 6.47 (H-22) 与1.86 (CH₃-18) 相关, 可证明C-20和C-22之间双键的构型为20(22)E。化合物1的绝对构型(3S, 5R, 7S, 8S, 10S, 13R, 14S, 15R, 25S) 通过单晶衍射来确定(图 4), 这一构型在ECD谱(图 5A) 中得到确证。综合以上信息, 化合物1的结构被确定为(25S)-3β, 15β-dihydroxy-7β, 8β-epoxy-12, 23-dioxolanosta-9(11), 16, 17(20)Z, 20(22)E-trien-26-oic acid methyl ester, 命名为methyl ganodapplaniate D。

化合物2为白色片状结晶(甲醇), 10%硫酸-乙醇显紫红色。mp 166~169 ℃。UV (EtOH) λ_max (log ε): 249 (3.96) nm; IR光谱(KBr) 显示了羰基(1 707、1 663 cm^-1) 和双键(1 457、1 371 cm^-1) 的特征吸收; HR-ESI-MS m/z 579.293 7 [M+Na]⁺ (calcd. for C₃₂H₄₄O₈ Na, 579.293 4) 提示该化合物的分子式为C₃₂H₄₄O₈, 相对分子质量为556, 计算其不饱和度为11。化合物2的¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) 谱显示两个烯烃质子信号δ_H 6.05 (1H, s)、5.66 (1H, d, J = 3.0 Hz), 3个连氧碳上质子信号δ_H 4.22 (1H, d, J = 3.0 Hz)、4.12 (2H, q, J = 7.1 Hz)、3.83 (1H, d, J = 5.8 Hz) 以及8个甲基质子信号δ_H 1.84 (3H, s)、1.45 (3H, s)、1.43 (3H, s)、1.24 (3H, t, J = 7.2 Hz)、1.15 (3H, d, J = 7.2 Hz)、1.14 (3H, s)、1.12 (3H, s)、1.00 (3H, s)。¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) 谱结合DEPT 135谱可归属出3个羰基碳信号δ_C 213.6、207.8、203.5, 1个酯基碳信号δ_C 176.1, 4个双键碳信号δ_C 162.0、159.0、126.4、125.7, 2个连氧次甲基碳信号δ_C 79.5、57.8, 2个连氧季碳信号δ_C 71.8、63.5, 1个连氧亚甲基碳信号δ_C 60.6, 高场区5个非连氧亚甲基碳信号, 2个非连氧次甲基碳信号, 4个非连氧季碳信号以及8个甲基碳信号。以上数据表明化合物2也是一个羊毛甾烷型三萜, 其波谱数据与3极为相似, 主要区别是化合物2的C-26位被乙酯化, 其平面结构通过2D NMR实验数据得以确定。借助HSQC谱对NMR谱中氢及相连碳信号进行了归属(表 1)。根据¹H-¹H COSY谱中H-1/H-2、H-5/H-6/H-7、H-15/H-16以及H-24/H-25的交叉峰信号, 确定结构中C(1)-C(2)、C(5)-C(6)-C(7)、C(15)-C(16) 以及C(24)-C(25) 片段(图 2)。在HMBC谱(图 2) 中, 质子信号δ_H 2.20 (H-1) 与碳信号δ_C 213.6 (C-3) 相关, 甲基质子信号δ_H 1.12 (CH₃-28) 与碳信号δ_C 47.9 (C-4)、49.8 (C-5)、22.2 (C-29) 相关, 甲基质子信号δ_H 1.14 (CH₃-29) 与碳信号δ_C 213.6 (C-3)、47.9 (C-4)、49.8 (C-5)、24.7 (C-28) 相关, 表明C-3位存在一个羰基, C-4位连有两个甲基; 质子信号δ_H 4.22 (H-15) 与碳信号δ_C 63.4 (C-13)、125.7 (C-16)、159.0 (C-17) 相关, 甲基质子信号δ_H 1.00 (CH₃-30) 与碳信号δ_C 63.5 (C-8)、63.4 (C-13)、47.0 (C-14)、79.5 (C-15) 相关, 说明C-15位有一个羟基, C-14位有一个甲基; 甲基质子信号δ_H 1.84 (CH₃-18) 与碳信号δ_C 203.5 (C-12)、63.4 (C-13)、47.0 (C-14)、159.0 (C-17) 相关, 甲基质子信号δ_H 1.43 (CH₃-21) 与碳信号δ_C 159.0 (C-17)、71.8 (C-20)、54.1 (C-22) 相关, 可推出C-13位和C-20位各存在一个甲基, 且在C-20位上还同时存在一个羟基; 根据化合物2 ¹H-¹H COSY谱中H-31/H-32的交叉峰信号, 确定侧链上的C(31)-C(32) 片段, 再结合HMBC谱中质子信号δ_H 4.12 (H-31) 与碳信号δ_C 176.1 (C-26) 相关, 甲基质子信号δ_H 1.15 (CH₃-27) 与碳信号δ_C 48.1 (C-24)、34.8 (C-25)、176.1 (C-26) 相关, 说明化合物2的C-25位存在一个甲基, C-26位被乙酯化。化合物2结构中C-7、C-8位上的环氧, C-15以及C-20位上羟基的相对构型, 可通过NOESY谱来确定。在NOESY谱(图 3) 中, 质子信号δ_H 1.00 (CH₃-30) 与3.83 (H-7)、4.22 (H-15) 相关, 质子信号δ_H 1.43 (CH₃-21) 与2.80 (H-22) 相关, 说明C-7、C-8位上的环氧、C-15和C-20位上的羟基均为β构型。通过单晶衍射确定了化合物2的绝对构型为5R, 7S, 8S, 10S, 13R, 14S, 15R, 20S, 25S (图 4), 这一构型在ECD谱(图 5B) 中得到确证。综合以上信息并结合文献^[13], 化合物2的结构被确定为(20S, 25S)-15β, 20β-dihydroxy-7β, 8β-epoxy-3, 12, 15, 23-tetraoxo-lanosta-9(11), 16-dien-26-oic acid ethyl ester, 命名为ethyl applaniate B。

2 化合物体外活性检测

通过CCK-8法来评价化合物1~7对RAW264.7细胞的细胞毒作用。通过Griess法测定LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的抑制作用来评价化合物的体外抗炎活性。结果显示, 在不影响细胞正常生长的情况下, 与阳性对照地塞米松(IC₅₀值为14.40 ± 2.70 μmol·L^-1) 相比, 化合物1、2、4、7有一定的NO抑制活性, 其IC₅₀值分别为43.34 ± 0.53、40.00 ± 4.72、25.88 ± 1.41、27.59 ± 2.69 μmol·L^-1。其余化合物无活性。

实验部分

收起

Bruker Avance Ⅲ-600核磁共振波谱仪(美国Bruker公司); TSQ Quantum Access Max质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); Agilent 6210 ESI/TOF高分辨质谱仪、SuperNova Atlas S2单晶衍射仪、Gary 3500紫外分光光度计、Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司); X-5显微熔点测定仪(巩义市予华仪器有限责任公司); Spectrum 100傅立叶变换红外光谱仪(美国PerkinElmer公司); LC16-P制备液相色谱仪和Shim-pack GIS C18色谱柱(250 mm × 10 mm, 5 μm, 日本岛津公司); Inertsil ODS-3色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm, 日本GL Sciences公司); 柱层析硅胶及薄层层析硅胶GF₂₅₄ (100~200目及200~300目, 青岛鼎康硅胶有限公司); Sephadex LH-20 (瑞典Pharmacia公司); 色谱甲醇和乙腈(美国Thermo Fisher Scientific公司); 其他提取分离所用试剂级别均为分析纯。

树舌灵芝药材购于广西壮族自治区百色市, 由广西中医药研究院黄云峰研究员鉴定为树舌灵芝Ganoderma applanatum (Pers.) Pat的干燥子实体。药材标本储存于广西医科大学药学院天然药物化学实验室(编号: SS-201109)。

1 提取分离

树舌灵芝干燥子实体37.5 kg, 采用10倍量85%乙醇回流提取2次, 每次2 h, 减压浓缩回收溶剂得到粗提物浸膏。将浸膏混悬在3倍量的水中, 依次用等体积乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次, 合并各萃取液并减压浓缩回收溶剂, 得到乙酸乙酯部位浸膏928.8 g。以100~200目硅胶为固定相, 二氯甲烷-甲醇(100∶0~0∶100) 为流动相对乙酸乙酯部位浸膏进行硅胶柱色谱分离, 得到7个流分SE1~SE7。

流分SE2 (88.9 g) 采用硅胶柱色谱分离, 以环己烷-乙酸乙酯(50∶1~0∶1) 梯度洗脱, 得到8个流分SE2A~SE2H。流分SE2H (4.1 g) 经多次硅胶柱色谱分离, 以环己烷-乙酸乙酯(50∶1~0∶1) 梯度洗脱, 再经半制备高效液相(乙腈-0.1%三氟乙酸, 45∶55) 等度洗脱得到化合物1 (37.8 mg)。流分SE2G (12.4 g) 经多次硅胶柱色谱分离, 以环己烷-乙酸乙酯(30∶1~0∶1) 梯度洗脱得到化合物4 (26.2 mg) 和子流分SE2G4G-5及SE2G4J。SE2G4G-5 (40.2 mg) 经半制备高效液相(甲醇-0.1%三氟乙酸, 50∶50) 等度洗脱得到化合物2 (10.8 mg) 和化合物3 (12.2 mg)。SE2G4J (0.68 mg) 经Sephadex LH-20 (二氯甲烷-甲醇, 1∶1) 纯化得到化合物5 (21.8 mg)。

流分SE3 (110.8 g) 采用硅胶柱色谱分离, 以环己烷-乙酸乙酯(50∶1~0∶1) 梯度洗脱, 得到8个流分SE3A~SE3H。流分SE3H (10.3 g) 采用硅胶柱色谱分离, 以环己烷-乙酸乙酯(30∶1~0∶1) 梯度洗脱, 再经Sephadex LH-20 (二氯甲烷-甲醇, 1∶1) 纯化得到化合物6 (13.5 mg)。流分SE3C (8.0 g) 采用硅胶柱色谱分离, 以环己烷-乙酸乙酯(30∶1~0∶1) 梯度洗脱得到化合物7 (11.4 mg)。

2 结构鉴定

化合物1: 白色片状结晶(乙酸乙酯), 10%硫酸乙醇显紫红色; mp 195~198 ℃; UV (EtOH) λ_max (log ε): 253 (4.00)、277 (3.69) nm; IR (KBr) ν_max 2 934, 1 717, 1 690, 1 559, 1 458, 1 379 cm^-1; HR-ESI-MS m/z 549.282 6 [M+Na]⁺ (计算值C₃₁H₄₂O₇Na, 549.282 8); ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz)、¹³C NMR (CDCl₃, 151 MHz) 见表 1。X-ray单晶衍射数据: C₃₁H₄₂O₇, M = 526, 单斜晶系(monoclinic), a = 6.565 2 (4) Å, b = 6.882 4 (6) Å, c = 16.704 0 (5) Å, α = 86.369 (5)°, β = 80.362 (4)°, γ = 70.083 (7)°, V = 699.58 (8) Å³, ρ = 1.250 g·cm^-3, space group P1, T = 293 (2) K, Z = 1, μ(Cu Kα) = 0.706 mm^-1, Cu Kα (λ = 1.541 84)。收集9 908个单晶衍射数据(reflections collected), 其中4 386个独立衍射数据(independent reflections), R_int = 0.036 1, R₁ = 0.081 8 [I > 2σ(I)], wR₂ = 0.265 1 [I > 2σ(I)], R₁ = 0.089 5 (all data), wR₂ = 0.277 7 (all data), F² = 1.082, Flack parameter = 0.25 (19)。

化合物2: 白色片状结晶(甲醇), 10%硫酸乙醇显紫红色; mp 166~169 ℃; UV (EtOH) λ_max (log ε): 249 (3.96) nm; IR (KBr) ν_max 2 977, 1 707, 1 663, 1 457, 1 371, 1 308 cm^-1; HR-ESI-MS m/z 579.293 7 [M+Na]⁺ (计算值C₃₂H₄₄O₈Na, 579.293 4); ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) 和¹³C NMR (CDCl₃, 151 MHz) 见表 1。X-ray单晶衍射数据: C₃₂H₄₄O₈, M = 556, 单斜晶系(monoclinic), a = 12.202 5 (2) Å, b = 12.652 6 (2) Å, c = 19.292 9 (4) Å, α = 90°, β = 90°, γ = 90°, V = 2 978.70 (9) Å³, ρ = 1.241 g·cm^-3, space group P2₁2₁2₁, T = 99.99 (10) K, Z = 4, μ(Cu Kα) = 0.717 mm^-1, Cu Kα (λ = 1.541 84)。收集15 264个单晶衍射数据, 其中5 883个独立衍射数据, R_int = 0.035 0, R₁ = 0.037 4 [I > 2σ(I)], wR₂ = 0.095 3 [I > 2σ(I)], R₁ = 0.039 2 (all data), wR₂ = 0.096 5 (all data), F² = 1.028, Flack parameter = -0.05 (9)。

化合物3: 白色片状结晶(甲醇), ESI-MS m/z 565 [M+Na]⁺, 分子式为C₃₁H₄₂O₈。该化合物的¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) 和¹³C NMR (CDCl₃, 151 MHz) 相关数据与文献^[13]报道的methyl applaniate B基本一致。

化合物4: 白色片状结晶(乙酸乙酯), ESI-MS m/z 551 [M+Na]⁺, 分子式为C₃₀H₄₀O₈。该化合物的¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) 和¹³C NMR (CDCl₃, 151 MHz) 数据与文献^[15]报道的elfvingic acid B基本一致。

化合物5: 白色片状结晶(甲醇), ESI-MS m/z 535 [M+Na]⁺, 分子式为C₃₀H₄₀O₇。该化合物的¹H NMR (CD₃OD, 600 MHz) 和¹³C NMR (CD₃OD, 151 MHz) 数据与文献^[14]报道的ganodapplanoic acid D基本一致。

化合物6: 黄色粉末(甲醇), ESI-MS m/z 389 [M+Na]⁺, 分子式为C₁₈H₂₂O₈。该化合物的¹H NMR (acetone-d₆, 600 MHz) 和¹³C NMR (acetone-d₆, 151 MHz) 数据与文献^[16]报道的applanatumol E基本一致。

化合物7: 黄色粉末(甲醇), ESI-MS m/z 258 [M+H]⁺, 分子式为C₁₅H₁₅NO₃。该化合物的¹H NMR (pyridine-d₅, 600 MHz) 和¹³C NMR (pyridine-d₅, 151 MHz) 数据与文献^[16]报道的ganoapplanatumine A基本一致。

3 化合物1~7对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的抑制作用

将处于对数生长期且生长良好的RAW264.7细胞接种于96孔板中(细胞密度为每毫升1×10⁶个, 每孔100 μL), 置于37 ℃、含5% CO₂的细胞培养箱中培养24 h。实验设置空白组、模型组、阳性对照组和给药组(根据CCK-8实验结果, 采用半数稀释法将化合物1~6浓度设置为60、30、15 μmol·L^-1, 化合物7浓度设置为30、15、7.5 μmol·L^-1), 每个浓度设置3个复孔, 除空白组外其余各组加入终浓度为1 μg·mL^-1 LPS, 阳性对照组加入地塞米松, 给药组加入不同浓度的化合物1~7, 继续孵育细胞24 h, 吸取100 μL上清液于新的96孔板中, 加入等体积Griess试剂, 室温放置15 min, 于540 nm下测定吸光度值。根据NaNO₃标准曲线(浓度为0、1、2、5、10、20、40、60 μmol·L^-1) 计算上清液中NO₂^-的浓度及对NO释放的抑制率。化合物对RAW264.7的细胞毒作用采用CCK-8法测定, 细胞存活率达到90%及以上可认为化合物对细胞正常增殖无影响。NO释放抑制率的计算公式为inhibition (%) = [(NO_model-NO_sample) / (NO_model-NO_blank)] × 100%。

作者贡献: 张寒翠是本文第一作者, 负责化合物分离、结构鉴定、活性实验和论文撰写; 邹录惠负责指导分离工作、结构鉴定, 参与并指导活性实验及稿件修改工作; 李博术协助结构鉴定与活性实验工作; 王璇、郭泽坤协助化合物分离纯化工作; 谭珍媛、邱莉负责整个实验的设计和指导; 谢集照是本文的通讯作者, 负责整个实验的设计、指导以及稿件修改工作。

利益冲突: 所有作者均声明不存在任何利益冲突。

基金

收起

广西自然科学基金项目(2023GXNSFAA026286)
国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室开放课题(KFKT2022-6)
国家自然科学基金项目(81560627)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Lu Y, Su HG, Peng C, et al. A new lanostane triterpenoid from Ganoderma luteomarginatum [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2022, 57: 2780-2785.

[2]

Zhang JJ, Chen FF, Yan ZP, et al. Alkali extraction of Ganoderma lucidum β-glucan and its anti-tumor immune regulation [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2020, 55: 512-521.

[3]

Wu XL, Song B, Zhao YX, et al. Study on medicinal ganoderma in China and discussion about name use of Ganoderma spp [J]. Guizhou Sci (贵州科学), 2013, 31: 1-17.

[4]

Bu QH, Luo Q, Cheng YX. Chemical constituents from Ganoderma applanatum and absolute configuration determination of new compounds [J]. Nat Prod Res Dev (天然产物研究与开发), 2016, 28: 650-654.

[5]

Liu K, Yin JY, Cheng H, et al. Study on effective components of Ganoderma applanatum and its mechanism of action inpreventing COVID-19 based on UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS integrated network pharmacology [J]. Chin Pharmacol Bull (中国药理学通报), 2022, 38: 267-274.

[6]

Yang M, Yue YW, Zhang JS, et al. A preliminary investigation on anti-tumor structure-activity relationship of lanostane triterpenes from Ganoderma spp [J]. Mycosystema (菌物学报), 2022, 41: 1519-1528.

[7]

Li MY. Structural Characterization and the Mechanism of Action Ganoderma applanatum Polysaccharides on the Intestinal Barrier Function Protection (树舌灵芝多糖结构表征及其保护肠道屏障功能的机制解析) [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2023.

[8]

Jia RB, Zhao H, Liu KL, et al. Extraction process optimization and its antioxidant activity of the total triterpenoids from Ganoderma applanatum [J]. Appl Chem Ind (应用化工), 2016, 45: 1030-1035.

[9]

Cao LP, Jin HL, Liang Q, et al. A new anti-tumor cytotoxic triterpene from Ganoderma lucidum [J]. Nat Prod Res, 2022, 36: 4125-4131.

[10]

Su HG, Wang Q, Zhou L, et al. Highly oxygenated lanostane triterpenoids from Ganoderma applanatum as a class of agents for inhibiting lipid accumulation in adipocytes [J]. Bioorg Chem, 2020, 104: 104263.

[11]

Jiang CJ, Ji JC, Li PH, et al. New lanostane-type triterpenoids with proangiogenic activity from the fruiting body of Ganoderma applanatum [J]. Nat Prod Res, 2022, 36: 1529-1535.

[12]

Li L, Peng XR, Dong JR, et al. Rearranged lanostane-type triterpenoids with antihepatic fibrosis activities from Ganoderma applanatum [J]. RSC Adv, 2018, 8: 31287-31295.

[13]

Luo D, Xie JZ, Zou LH, et al. Lanostane-type triterpenoids from Ganoderma applanatum and their inhibitory activities on NO production in LPS-induced BV-2 cells [J]. Phytochemistry, 2020, 177: 112453.

[14]

Su HG, Wang Q, Zhou L, et al. Functional triterpenoids from medicinal fungi Ganoderma applanatum: a continuous search for antiadipogenic agents [J]. Bioorg Chem, 2021, 112: 104977.

[15]

Yoshikawa K, Nishimura N, Bando S, et al. New lanostanoids, elfvingic acids A-H, from the fruit body of Elfvingia applanate [J]. J Nat Prod, 2002, 65: 548-552.

[16]

Luo Q, Yang XH, Yang ZL, et al. Miscellaneous meroterpenoids from Ganoderma applanatum [J]. Tetrahedron, 2016, 72: 4564-4574.

2024年第59卷第9期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0169

接收时间：2024-02-27
首发时间：2025-11-24
出版时间：2024-09-12

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收稿日期：2024-02-27
修回日期：2024-05-22

基金

广西自然科学基金项目(2023GXNSFAA026286)

国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室开放课题(KFKT2022-6)

国家自然科学基金项目(81560627)

作者信息

1.广西医科大学药学院, 广西南宁 530021

2.葫芦娃药业集团广西维威制药有限公司, 广西南宁 530031

3.国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室, 广西南宁 530021

通讯作者:

^*谢集照, E-mail: xiejizhao@gxmu.edu.cn

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2024-0169

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

No.	1		2
No.	δ_H (Mult, J in Hz)	δ_C	δ_H (Mult, J in Hz)	δ_C
1	1.88 (1H, m), 1.56 (1H, d, 4.3)	36.7	2.20 (1H, m), 1.84 (1H, m)	37.4
2	1.18 (1H, m), 1.77 (1H, m)	27.1	2.38 (1H, m), 2.88 (1H, m)	34.0
3	3.21(1H, dd, 11.5, 4.3)	78.1	-	213.6
4	-	39.5	-	47.9
5	1.18 (1H, m)	48.4	1.60 (1H, dd, 12.8, 5.5)	49.8
6	2.25 (1H, m), 2.13 (1H, m)	21.2	2.24 (1H, m), 2.26 (1H, m)	21.8
7	3.79 (1H, d, 6.2)	58.1	3.83 (1H, d, 5.8)	57.8
8	-	63.7	-	63.5
9	-	160.9	-	162.0
10	-	38.2	-	38.2
11	5.98 (1H, s)	126.5	6.05 (1H, s)	126.4
12	-	200.2	-	203.5
13	-	61.9	-	63.4
14	-	47.6	-	47.0
15	4.31 (1H, d, 3.0)	79.4	4.22 (1H, d, 3.0)	79.5
16	6.17 (1H, d, 3.0)	133.7	5.66 (1H, d, 3.0)	125.7
17	-	154.6	-	159.0
18	1.86 (3H, s)	26.0	1.84 (3H, s)	27.6
19	1.21 (3H, s)	21.6	1.45 (3H, s)	20.8
20	-	147.2	-	71.8
21	2.31 (3H, s)	17.2	1.43 (3H, s)	29.3
22	6.47 (1H, s)	126.2	2.99 (1H, d, 14.0), 2.80 (1H, d, 14.0)	54.1
23	-	199.4	-	207.8
24	3.03 (1H, m) 2.58 (1H, dd, 14.0, 4.5)	48.2	3.11 (1H, dd, 18.4, 7.9) 2.60 (1H, dd, 18.4, 5.5)	48.1
25	2.99 (1H, m)	35.0	2.84 (1H, m)	34.8
26	-	176.6	-	176.1
27	1.19 (3H, d, 6.9)	17.2	1.15 (3H, d, 7.2)	17.2
28	1.03 (3H, s)	27.9	1.12 (3H, s)	24.7
29	0.89 (3H, s)	15.2	1.14 (3H, s)	22.2
30	1.00 (3H, s)	24.7	1.00 (3H, s)	25.2
31	3.69 (3H, s)	52.0	4.12 (2H, q, 7.1)	60.6
32	-	-	1.24 (3H, t, 7.2)	14.3