药学学报

MoS₂纳米酶通过调控线粒体动力及自噬减轻炎性内皮细胞损伤

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潘冬梅 ¹ , 柯孙葵 ³ , 尹乾浩 ⁴ , 杨沛彦 ² , 李超 ¹^,^* , 叶社房 ⁴^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(10): 2791-2799

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(10): 2791-2799

MoS₂纳米酶通过调控线粒体动力及自噬减轻炎性内皮细胞损伤

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潘冬梅¹, 柯孙葵³, 尹乾浩⁴, 杨沛彦², 李超¹^,^*, 叶社房⁴^,^*

作者信息

1.厦门医学院附属海沧医院, 福建厦门 361000

2.厦门大学附属第一医院, 福建厦门 361004

3.厦门大学附属中山医院, 福建厦门 361004

4.厦门大学材料学院, 生物材料系/生物医学工程研究中心/福建省高校重点实验室, 厦门市生物医学工程技术研究中心, 福建厦门 361005

通讯作者:

^*李超, Tel: 86-592-6589189, E-mail: lc5912005@163.com;

叶社房, Tel: 86-592-2185299, E-mail: yeshefang@xmu.edu.cn

MoS₂ nanozyme attenuated inflammation-related endothelial cell injury by regulating mitochondrial dynamics and mitophagy

Dong-mei PAN¹, Sun-kui KE³, Qian-hao YIN⁴, Pei-yan YANG², Chao LI¹^,^*, She-fang YE⁴^,^*

Affiliations

1. The HaiChuang Hospital of Xiamen Medical College, Xiamen 361000, China

2. The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004, China

3. Zhongshan Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004, China

4. The Higher Educational Key Laboratory for Biomedical Engineering of Fujian Province, Department of Biomaterials, Research Center of Biomedical Engineering of Xiamen, Xiamen University, Xiamen 361005, China

出版时间: 2024-10-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0416

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摘要

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探讨新型MoS₂纳米酶通过调控线粒体动力, 以减轻炎性血管内皮细胞损伤的保护机制。利用水热法制备出了花状MoS₂纳米片, 结合电子自旋共振(electron spin resonance, ESR) 光谱检测技术, 表明花状MoS₂纳米片对羟基自由基(·OH) 和单线态氧(¹O₂) 都具有很强的清除能力, 呈剂量依赖效应。通过体外脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 诱导的血管内皮细胞炎性氧化应激损伤模型, 用花状MoS₂纳米片预处理, 本研究分别用MTT及Annexin V-FITC/PI双染法检测内皮细胞毒性及凋亡; 用MitoTracker荧光探针观察内皮细胞线粒体分裂及融合形态; 用活性氧(reactive oxygen species, ROS) 探针DCFH-DA及超氧阴离子(O^2-) 探针DHE检测细胞氧化应激水平; 用质粒GFP-LC3转染及荧光共定位技术观察并分析细胞自噬及线粒体自噬形成。结果表明, MoS₂纳米酶可以显著减少炎性内皮细胞的细胞毒性及细胞凋亡, 减轻炎性内皮细胞线粒体的分裂, 并维持融合状态下的线粒体动力; 还可以缓解LPS介导的内皮细胞线粒体自噬, 进而保护内皮细胞免受炎性氧化应激性损伤。以上结果确立了新型MoS₂纳米酶可以通过调控内皮细胞线粒体动力及线粒体自噬, 实现对炎性内皮细胞损伤的保护, 有望拓展MoS₂纳米酶用于防治慢性炎症性血管内皮损伤相关疾病。

关键词

MoS₂纳米酶 / 血管内皮 / 氧化应激 / 线粒体动力 / 线粒体自噬

Abstract

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To explore the protective mechanisms of a novel molybdenum disulfide (MoS₂) nanozyme in alleviating inflammation-related endothelial cell injury by regulating mitochondrial dynamic, flower like-MoS₂ nanosheets were prepared by hydrothermal method, and its antioxidant enzyme-mimic activities were assessed via electron spin resonance (ESR) spectroscopy. It was shown that MoS₂ nanosheets had strong scavenging ability for hydroxyl radical (·OH) and singlet reactive oxygen species (¹O₂) in a dose-dependent manner. Using an in vitro lipopolysaccharide (LPS)-induced vascular endothelial cell injury model, the protective roles of MoS₂ nanozyme on cytotoxicity and apoptosis of endothelial cells were examined by MTT and Annexin V-FITC/PI assay, respectively. Mitochondrial fission/fusion of endothelial cell were observed by Mito-Tracker green probe. Reactive oxygen species (ROS) probe DCFH-DA and superoxide anion probe DHE were used to detect the level of oxidative stress in vitro. Plasmid GFP-LC3 transfection using colocalization analysis was applied to assess the autophagy of endothelial cells. The results showed that MoS₂ nanozyme could significantly reduce the cytotoxicity and apoptosis of endothelial cells stimulated by LPS, and prevent the impairment mitochondrial dynamics of endothelial cells, thus maintaining mitochondrial dynamics. In addition, MoS₂ nanozyme was also shown to alleviate LPS-mediated endothelial mitochondrial autophagy, thus protecting endothelial cells from inflammatory stress. These results established that MoS₂ nanozyme protected endothelial cells injury from inflammatory stress by regulating mitochondrial dynamics and mitochondrial autophagy of endothelial cells, which is expected to expand the use of MoS₂ nanozyme in the prevention and treatment of inflammation-related vascular endothelial diseases.

Key words

MoS₂ nanozyme / vascular endothelium / oxidative stress / mitochondrial dynamics / mitophagy

引用本文

潘冬梅, 柯孙葵, 尹乾浩, 杨沛彦, 李超, 叶社房. MoS₂纳米酶通过调控线粒体动力及自噬减轻炎性内皮细胞损伤. 药学学报, 2024 , 59 (10) : 2791 -2799 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0416

Dong-mei PAN, Sun-kui KE, Qian-hao YIN, Pei-yan YANG, Chao LI, She-fang YE. MoS₂ nanozyme attenuated inflammation-related endothelial cell injury by regulating mitochondrial dynamics and mitophagy[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (10) : 2791 -2799 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0416

正文

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血管内皮作为选择性单层细胞生物屏障维持血管稳态, 包括维持血管张力、血管生成以及为机体提供一个抗氧化、抗炎和抗血栓形成的界面等^[1]。血管内皮受损所致的内皮功能异常是许多泛血管疾病的标志特征, 其中过量的氧自由基是血管内皮功能受损的重要病理机制之一^[2]。生理状态下, 氧化应激可调节内皮细胞功能、受体信号和免疫反应等, 但过度的氧化应激则会通过促进血管平滑肌和炎症细胞的生长及迁移、降解细胞外基质、促进内皮细胞凋亡、激活转录因子、促进炎症因子和黏附分子过表达等机制损伤内皮细胞^{[3, 4]}。线粒体是活性氧(reactive oxygen species, ROS) 的主要生成场所, 线粒体功能障碍会促使细胞内ROS的过度生成, 造成细胞内氧化应激, 促进细胞损伤甚至凋亡。线粒体动力(mitochondrial dynamics) 紊乱是引起线粒体功能障碍的关键机制^[5], 线粒体通过不断地融合与分裂、线粒体自噬等过程维持细胞正常生理功能^{[5, 6]}。当线粒体动力异常时, 线粒体分裂相关蛋白, 如动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1, Drp1)、线粒体分裂因子(mitochondrial ﬁssion factor, Mff)、线粒体分裂蛋白1 (mitochondrial fission protein 1, Fis1) 等表达增高; 而线粒体融合相关蛋白, 如视神经萎缩因子1 (optic atrophic protein1, OPA1)、线粒体融合蛋白2 (mitofusin 2, Mfn2) 等表达降低, 造成线粒体碎片化, 诱发其严重功能障碍^[7]。线粒体动力在能量产生、钙稳态和细胞免疫及凋亡等方面发挥着重要作用, 其异常与血管慢性炎症、血管通透性增加、内皮细胞衰老、内皮细胞代谢异常和内皮细胞间质转化等密切相关^[8]。因此, 干预线粒体动力调控细胞内氧化应激水平可作为治疗泛血管疾病的潜在靶标, 是血管药物研究的重要策略之一。

纳米酶(nanozyme) 是指具有类似天然酶活性的纳米材料^[9]。与天然酶相比, 纳米酶具有稳定性高、催化活性可调、易规模制备及功能修饰等特点, 因而在生物医学领域备受关注^{[10, 11]}。纳米酶主要有过氧化物酶模拟酶、过氧化氢酶模拟酶、氧化物酶模拟酶, 以及超氧化物歧化酶模拟酶等^[12]。体外环境下, 纳米酶在极端条件下性能稳定, 有望替代天然酶在细胞捕获、生物分子检测、生物排污等领域发挥作用^[13]。体内环境下, 纳米酶则可通过多重氧化还原酶活性来调节细胞内活性氧ROS水平, 以用于防治慢性氧化应激性疾病, 如心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病及癌症等^{[14, 15]}, 目前在纳米生物医药研究领域备受关注。MoS₂是一类具有类似石墨烯独特二维结构的过渡金属二硫化物纳米材料, 因其出色的理化性能及良好的生物相容性等, 其在药物载体、光动力治疗、生物传感等领域具有潜在应用前景^{[16, 17]}。MoS₂纳米片层因其表面富有Mo、S空穴而显示出类过氧化氢酶活性、类超氧化物歧化酶活性等多重类酶活性, 引起了研究者的广泛关注^{[18, 19]}。研究表明, MoS₂纳米酶可以通过发挥类氧化酶活性, 调控病灶微环境的氧化应激状态, 在抗氧化应激损伤及内皮细胞衰老、促进保护性自噬及保护神经等方面发挥重要作用^{[20, 21]}。最近还发现, MoS₂纳米酶可逆转内皮细胞间质化、促进血管再生等^[22]。本研究合成了花状MoS₂纳米片层结构, 通过体外炎性内皮细胞损伤模型, 探讨MoS₂纳米花的纳米酶活性及其对线粒体动力的调控机制, 为发展新型纳米酶用于炎性血管内皮损伤的防治策略提供新思路。

材料与方法

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仪器与试剂

人脐静脉血管内皮细胞系(HUVECs) 购自中国科学院上海生命科学研究所。脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)、2, 2, 6, 6-四甲基哌啶(2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidine, TEMP)、5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(5, 5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide, DMPO) 购自美国Sigma公司。内皮细胞培养基EGM-2购自美国Clonetics公司。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素-链霉素溶液、MTT细胞增殖及毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、Mito-Tracker荧光探针、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) 荧光探针2′, 7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′, 7′-dichlorofluorescindiacetate, DCFH-DA)、二氢乙锭(dihydroethidium, DHE)、增强型ATP检测试剂盒、GFP-LC3质粒、ECL化学发光试剂购自上海碧云天生物技术公司。一抗包括: 抗Drp1抗体、抗Drp1 Ser616抗体、抗Mff抗体、抗Bcl-2 (B-celllymphoma-2) 抗体、抗caspase-3 (apoptosis-related cysteine peptidase caspase 3) 抗体、抗TOMM20 (translocase of outer mitochondrial membrane 20 homolog) 抗体、抗β-actin抗体购自美国Cell Signaling公司; 抗LC-3Ⅱ (microtubule-associated proteins light chain 3) 抗体、抗p62 (sequestosome 1) 抗体、抗PINK1 (PTEN induced putative kinase 1) 抗体、抗Parkin (Parkin protein) 抗体系美国Abcam公司产品。Lipofectamine3000购自美国Invitrogen公司。

酶标仪(美国Bio-Rad 680); Tcs SP2激光共聚焦显微镜(德国Lecia公司); Axiovert 200荧光倒置显微镜(德国Carl Zeiss公司); BD FACSCanto cytometers (美国BD公司); FEI Tecnai G2高分辨透射电子显微镜(TEM, 美国FEI公司); 电子顺磁共振波谱仪(EPR, 德国Bruker公司); ZS90纳米粒度电位仪(英国Malvern公司)。

MoS₂纳米酶的制备及模拟酶活性检测

通过水热法^[23]制备得到花状MoS₂纳米片。为了验证花状MoS₂纳米片的抗氧化酶活性, 本研究通过ESR测定其清除活性氧的能力。以TEMP作为自旋捕集剂检测¹O₂的生成, 它可以与¹O₂反应并形成稳定的自旋加合物TEMP/¹O₂, ESR三重态信号与TEMP-¹O₂浓度呈正相关。将不同浓度的MoS₂纳米片溶解在水中, 并添加到100 µmol·L^-1 H₂O₂和2 mol·L^-1 TEMP的混合溶液中, 用紫外-可见光照射该混合溶液2 min并记录ESR信号。以DMPO作为·OH检测的自旋捕集剂, 它可以与·OH反应形成自旋加合物DMPO/·OH。以FeSO₄刺激H₂O₂生成·OH, 将10 µmol·L^-1 FeSO₄、2 µmol·L^-1 DMPO、100 µmol·L^-1 H₂O₂和不同浓度MoS₂纳米片混合后记录ESR信号。

细胞培养

HUVECs细胞培养于10%胎牛血清、100 u·mL^-1氨苄青霉素、100 µg·mL^-1链霉素的EGM-2培养基中, 置于37 ℃湿化的5% CO₂孵箱中培养。对数生长期细胞消化后, 按适宜密度接种于细胞培养板。根据预实验观察到0.1 mg·mL^-1 LPS刺激HUVECs细胞时伴随明显的线粒体分裂, 因此本研究采用该浓度刺激HUVECs细胞6或24 h建立体外内皮细胞炎性活化损伤模型, 然后用MoS₂纳米片在50 mg·mL^-1时作为适宜浓度预处理HUVECs细胞用于后续研究。

细胞活性与凋亡检测

根据实验设计处理细胞后, 按试剂说明每孔加入10 µL MTT溶液, 放置1.5 h后使用酶标仪测A₄₉₀值, 并计算细胞存活率。细胞存活率=[(处理组A₄₉₀值-空白组A₄₉₀值)/(对照组A₄₉₀值-空白组A₄₉₀值)] × 100%。同时, 参照试剂说明进行细胞凋亡检测。收集处理后的细胞, 经缓冲液洗涤、离心后, 悬浮于100 µL结合缓冲液并加入10 µL Annexin V-FITC和5 µL PI。室温避光孵育15 min后, 流式细胞仪上机检测。

线粒体动力分析

HUVECs细胞接种在共聚焦培养皿中并进行相应的处理。内皮细胞经消化、洗涤后, 加入无血清培养基稀释的线粒体特异荧光染料Mito-Tracker Green, 37 ℃孵育30 min后, 经PBS润洗, 在激光共聚焦显微镜下观察细胞中线粒体长度(反映线粒体融合与分裂形态)。使用ImageJ软件对共聚焦图片中Mito-Tracker Green标记的线粒体长度进行统计分析。

细胞内活性氧及线粒体功能检测

HUVECs细胞经接种、贴壁后进行处理。收集消化细胞并洗涤, 用细胞内活性氧探针DCFH-DA和超氧化物阴离子探针DHE结合流式细胞术测定细胞总体或线粒体ROS水平。根据试剂操作说明, 分别与DCFH-DA、DHE荧光探针在37 ℃避光孵育30 min, PBS漂洗3次, 过筛后流式细胞上机检测。同时, 参照JC-1线粒体膜电位试剂盒说明, 结合流式细胞仪检测线粒体膜电位ΔΨ_m变化, 观察分析JC-1聚合体(红色)/JC-1单体(绿色) 荧光强度的变化。处理过的细胞裂解后, 按试剂盒检测说明用化学发光法检测细胞内ATP含量。

细胞转染及自噬体观察

根据Lipofectamine 3000转染试剂盒说明书, 将GFP-LC3质粒转染体系分别转入到HUVECs细胞中, 使用G418筛选出具有稳定转染的GFP-LC3/HUVECs细胞, 并按细胞密度3×10⁵个/孔接种到24孔板中, 继续培养20 h。细胞进行相应处理后, 在共聚焦显微镜下观察GFP聚集情况并进行图片采集分析。

细胞免疫荧光检测

用4%多聚甲醛对细胞爬片进行固定后, 以5% BSA/0.15% Triton X-100封闭液室温处理30 min, 分别加入一抗: TOMM20 (1∶200) 和PINK1 (1∶200), 4 ℃孵育过夜。然后加入Alexa fluor 488或FITC标记的二抗(1∶400), 37 ℃温育1 h, 碘化丙啶复染、封片后, 置于荧光显微镜下观察分析。

蛋白印迹检测

收集处理细胞样品, 经蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA液裂解后, 4 ℃ 13 000 r·min^-1离心取上清。按胞浆/线粒体蛋白分离试剂盒说明书, 提取胞浆和线粒体蛋白。提取细胞总蛋白后对蛋白浓度进行定量后, 进行SDS-PAGE凝胶电泳1.5 h, 300 mA转膜2 h, 5%脱脂乳室温封闭2 h后, 加入一抗, 4 ℃孵育过夜; 然后, TBST缓冲液洗涤30 min。加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗, 室温孵育2 h, TBST洗涤, 加入ECL显色液显影成像, 用ImageJ软件分析条带灰度值。

统计学分析

采用SPSS 10.0统计软件对各组数据进行ANOVA单因素方差分析, 多组数据之间的比较采用student′s Newman-Keuls方法, 数据表达为相对值均值±标准差, 其中相对值为实验值与对照值(设为1或100%) 的比值。P < 0.05为有统计学差异。

结果与讨论

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1 MoS₂纳米花的理化性能表征

从图 1A TEM照片中可以看出, 制备的MoS₂纳米结构呈类石墨烯的絮状薄片状结构, 边缘卷曲, 形成三维花状结构, 粒径大小约为210 nm。EDS元素分布图揭示MoS₂纳米片异质结构中, Mo和S元素较为均匀地分布(图 1B)。Zeta电位测得MoS₂纳米片的电位为-23.6 mV, 提示其在水中具有良好的分散性。如图 1C所示, DLS分析其平均粒径为242 nm, 与TEM测得的结果较为吻合。MoS₂纳米片呈花状结构, 有较大的比表面积为62.5 m²·g^-1。MoS₂的衍射峰与表征标准卡片对应较好且衍射峰尖锐, 说明其具有较高的结晶度(图 1D)^[23]。接下来, 本研究用ESR法研究了花状MoS₂纳米片在不同条件下的模拟酶抗氧化活性。如图 2A、B所示, 利用DMPO作为·OH检测的自旋捕集剂, 与对照组相比, 在使用MoS₂纳米片后, ESR信号显著降低, 显示良好的·OH清除能力, 效应呈浓度依赖性。类似地, 以TEMP作为自旋捕集剂检测到¹O₂的生成, 在对照组中呈现明显ESR信号; 经MoS₂纳米片处理后, ESR信号峰值强度显著降低, 表明花状MoS₂纳米片能有效地消耗¹O₂, 效应亦呈浓度依赖性(图 2C、D)。花状MoS₂纳米片的模拟酶抗氧化活性可能与MoS₂纳米片平面存在较多的缺陷位点、有利于增加其活性部位有关^{[18, 19]}。

2 MoS₂纳米酶通过清除氧自由基抑制LPS诱导的氧化应激性内皮细胞凋亡

ROS (如¹O₂、·OH等) 的累积引起氧化应激诱导细胞损伤, 是许多泛血管疾病的共同病理机制之一。基于前期研究结果^[23], 花状MoS₂纳米片在低于50 µg·mL^-1浓度作用24 h时, 对HUVECs细胞没有明显毒性作用; 在此浓度范围内, 50 µg·mL^-1显示出最大的抗氧化模拟酶活性, 因此该实验选择50 µg·mL^-1作为适宜剂量用于MoS₂纳米酶抗氧化应激损伤的后续研究。基于LPS刺激血管内皮细胞建立体外炎性氧化应激模型, 本研究发现LPS刺激后HUVECs细胞活力约为正常对照组的50%, 而MoS₂纳米酶预处理后显著抑制了LPS诱导的HUVECs细胞毒性, 细胞活性恢复至对照组的83%左右, 表明MoS₂可以抑制LPS介导的内皮细胞损伤(图 3A)。图 3B显示, 在Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡中, PI被排除在活细胞(Annexin V^-/PI^-) 和早期凋亡细胞(Annexin V⁺/PI^-) 外, 而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被双染料结合呈双阳性(Annexin V⁺/PI⁺)。如图 3B所示, 与对照组相比, LPS刺激细胞后24 h后, HUVECs细胞凋亡率增加到46.7%, 经MoS₂预处理后HUVECs细胞凋亡率降至13.3%。蛋白印迹结果表明, 与LPS模型组相比, MoS₂纳米酶预处理内皮细胞后, 抗凋亡蛋白Bcl-2表达量增加, 促凋亡蛋白Bax及凋亡效应蛋白cleaved caspase-3表达量下调(图 3C~E)。在炎性细胞损伤中, 线粒体外膜通透性增高可诱发细胞凋亡, 该途径主要由Bcl-2家族蛋白调控^[24], 据此推测MoS₂纳米酶可能通过调控Bcl-2家族蛋白稳定线粒体膜, 进而抑制caspase-3依赖性细胞凋亡。

3 MoS₂纳米酶抑制LPS诱导的内皮细胞线粒体断片化

线粒体作为一种动态的细胞器, 可以不停地进行融合与分裂运动, 这种融合与分裂运动称为线粒体动力学, 与细胞的代谢、增殖、凋亡等功能密切相关, 其调控功能的损伤可以导致许多慢性疾病的发生^[6]。利用Mito-Tracker Green作为线粒体特异标记, 本研究发现对照组HUVECs细胞线粒体密集, 呈长丝或管状网络结构; 而LPS模型组线粒体呈密集点状排列, 提示线粒体分裂导致断片化; MoS₂纳米酶预处理后可使HUVECs细胞线粒体恢复至对照组的形态(图 4A)。进一步对线粒体形态进行量化分析表明, LPS刺激模型组与MoS₂纳米酶孵育后, 内皮细胞管状线粒体数量显著增加, 与图 4A观察到的结果一致(图 4B)。线粒体动力学由进化上高度保守的线粒体融合蛋白以及分裂蛋白调控与协同作用完成。蛋白印迹结果显示, LPS刺激后HUVECs细胞总Drp1蛋白水平无明显变化, 但Drp1 Ser616磷酸化水平明显增高。一致地, 线粒体分裂因子Mff表达在LPS刺激下也上调(图 4C、D)。Drp1磷酸化后发生线粒体迁移, 与线粒体外膜上相应的受体蛋白如Mff、Fis1等结合并寡聚化, 最终导致线粒体片段化^[25]。与LPS模型组比较, MoS₂纳米酶预处理后HUVECs细胞p-Drp1及Mff表达均下调(图 4C、D), 表明MoS₂纳米酶逆转LPS介导的线粒体动力紊乱与调控线粒体动力蛋白活性密切相关。

4 MoS₂纳米酶抑制LPS诱导的内皮细胞线粒体功能紊乱

线粒体动力动态平衡是维持细胞线粒体稳态和功能的前提, 一旦该平衡破坏则会导致线粒体断片化使其功能受损, 造成细胞氧化应激状态^[15]。本研究用JC-1法检测了HUVECs细胞线粒体膜电位(ΔΨ_m), 探讨MoS₂纳米酶对炎性内皮细胞线粒体功能的保护作用。在线粒体ΔΨ_m较高时, JC-1以聚合物形式聚集在线粒体基质中而呈红色荧光; 在线粒体ΔΨ_m较低时, JC-1以单体形式存在而呈绿色荧光。用JC-1红/绿荧光的比值来衡量线粒体去极化功能状态。如图 5A所示, 与对照组相比, LPS刺激组的JC-1红色荧光强度变弱而绿色荧光则增强, 表明LPS诱发了线粒体膜电位去极化。而加入MoS₂纳米酶后, HUVECs细胞的JC-1红色荧光强度变强而绿色荧光则减弱, 表明MoS₂纳米酶使受损的线粒体膜电位得到恢复, 对线粒体功能发挥保护作用。线粒体是ATP的主要供应场所, 参与许多细胞功能如活性氧簇、Ca^{2 +}稳态、凋亡等的信号转导过程。如图 5B~D所示, 与对照组相比, LPS刺激明显诱导HUVECs细胞总体ROS、线粒体活性氧上升及细胞内ATP水平的下降。与LPS模型组相比, MoS₂纳米酶干预明显逆转了LPS诱导的HUVECs细胞氧化应激, 并增加细胞ATP含量, 其机制可能与恢复线粒体动力平衡有关。

5 MoS₂纳米酶抑制LPS诱导的内皮细胞自噬与线粒体自噬

线粒体作为细胞内稳态必不可少的能量发生器, 参与调控细胞死亡及自噬等过程, 其核心功能使得线粒体的质量和数量受到严格控制。接下来, 本研究继续探讨了MoS₂纳米酶对LPS介导的细胞自噬的影响。GFP-LC3/HUVECs是稳定转染并持续表达绿色荧光标签的血管内皮细胞系, 当自噬被激活后, GFP-LC3-Ⅰ就会被加工成GFP-LC3-Ⅱ而聚集在自噬小体膜中, 在荧光显微镜下呈点状绿色荧光的自噬体。如图 6A所示, 与对照组相比, LPS诱导内皮细胞的绿色荧光呈点状聚集, 阳性细胞的比例增多; 而经MoS₂纳米酶处理后, 呈绿色荧光点状聚集的内皮细胞比例得到了显著的抑制。同样地, 蛋白印迹分析表明, LPS刺激HUVECs细胞后, 自噬标志物LC3-Ⅱ的表达显著上升并伴随自噬底物p62的降解, 与GFP-LC3标记的自噬体观察结果一致。而MoS₂纳米酶可以抑制LC3-Ⅱ的形成, 促进自噬底物p62的堆积, 与LPS组比较有显著差异(图 6B~D), 从而表明MoS₂纳米酶能够抑制LPS诱导的细胞自噬。

在此基础上, 本研究进一步探讨在线粒体分裂及去极化后, 线粒体自噬是否参与了LPS诱导的内皮细胞自噬。当线粒体受损时, PINK1通过外膜转位酶在线粒体外膜积累, 激活并招募Parkin蛋白, 随后线粒体外膜上的蛋白电压依赖性阴离子通道蛋白1和Mfn1/2被Parkin泛素化, 诱导线粒体自噬^{[26, 27]}。利用荧光共定位技术表明, LPS刺激处理内皮细胞后, PINK1蛋白与线粒体共定位明显, 提示PINK1蛋白迁移到了线粒体膜促进了线粒体自噬, 而MoS₂纳米酶抑制了该效应的发生(图 7A)。同样地, 蛋白印迹分析表明, LPS刺激处理HUVECs细胞后, 细胞PINK1与Parkin蛋白均表达上升, 尤以PINK1蛋白表达更为明显, 提示其可能作为级联启动蛋白通过PINK1/Parkin通路介导了细胞线粒体自噬效应。而MoS₂纳米酶预处理则抑制了LPS诱导的PINK1与Parkin蛋白过表达, 表明MoS₂纳米酶调控炎性活化的内皮细胞线粒体自噬, 进而有助于改善细胞线粒体功能(图 7B、C)。

结论

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本研究合成了具有类抗氧化物酶活性的MoS₂纳米酶, 通过体外炎性氧化应激模型实验结果表明, MoS₂纳米酶抑制LPS造成的内皮细胞氧化损伤和细胞凋亡, 其机制可能与调控线粒体动力及线粒体自噬有关。本研究结果为发展新型纳米酶用于炎性血管内皮损伤的防治策略提供了新思路。

作者贡献: 潘冬梅和柯孙葵负责细胞实验、数据分析及文章撰写; 尹乾浩负责材料的制备与理化表征; 杨沛彦负责分子与细胞相关实验; 李超参与课题设计和指导及论文审阅; 叶社房负责课题设计、指导和论文审阅。

利益冲突: 本文所有作者声明不存在利益冲突关系。

基金

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国家自然科学基金面上资助项目(32071396)
国家自然科学基金面上资助项目(82073405)
厦门市自然科学基金项目(3502Z20227425)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第59卷第10期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0416

接收时间：2024-04-30
首发时间：2025-11-24
出版时间：2024-10-12

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出版历史

收稿日期：2024-04-30
修回日期：2024-07-04

基金

国家自然科学基金面上资助项目(32071396)

国家自然科学基金面上资助项目(82073405)

厦门市自然科学基金项目(3502Z20227425)

作者信息

1.厦门医学院附属海沧医院, 福建厦门 361000

2.厦门大学附属第一医院, 福建厦门 361004

3.厦门大学附属中山医院, 福建厦门 361004

4.厦门大学材料学院, 生物材料系/生物医学工程研究中心/福建省高校重点实验室, 厦门市生物医学工程技术研究中心, 福建厦门 361005

通讯作者:

^*李超, Tel: 86-592-6589189, E-mail: lc5912005@163.com;

叶社房, Tel: 86-592-2185299, E-mail: yeshefang@xmu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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