药学学报

Gene	Species	Primer sequence
Bmal1	Mouse	Forward 5'-CTCCAGGAGGCAAGAAGATTC-3'
		Reverse 5'-ATAGTCCAGTGGAAGGAATG-3'
Clock	Mouse	Forward 5'-CACTCTCACAGCCCCACTGTAC-3'
		Reverse 5'-CCCCACAAGCTACAGGAGCAGT-3'
Per1	Mouse	Forward 5'-AACGGGATGTGTTTCGGGGTGC-3'
		Reverse 5'-AGGACCTCCTCTGATTCGGCAG-3'
Per2	Mouse	Forward 5'-CCACACTTGCCTCCGAAATA-3'
		Reverse 5'-ACTGCCTCTGGACTGGAAGA-3'
Cry1	Mouse	Forward 5'-CCCAGGCTTTTCAAGGAATGGAAC-3'
		Reverse 5'-GCAGGGAGTTTGCATTCATTCGAG-3'
Cry2	Mouse	Forward 5'-TGGGCATCAACCGATGGAG-3'
		Reverse 5'-CCCATTCCTTGAACAGCCTTG-3'
Rev-erbα	Mouse	Forward 5'-TTTTTCGCCGGAGCATCCAA-3'
		Reverse 5'-ATCTCGGCAAGCATCCGTTG-3'
Rev-erbβ	Mouse	Forward 5'-CGCACATTGCCGATATAGGAGG-3'
		Reverse 5'-GAGACTGCCACCACCACGTACT-3'
Rorα	Mouse	Forward 5'-CCAACCGTGTCCATGGCAGAAC-3'
		Reverse 5'-GCACACAGCTGCCACATCACCT-3'
Rorγ	Mouse	Forward 5'-CGCGGAGCAGACACACTTA-3'
		Reverse 5'-CCCTGGACCTCTGTTTTGGC-3'
Rn18s	Mouse	Forward 5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'
		Reverse 5'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3'

Gene	Species	Primer sequence
Bmal1	Mouse	Forward 5'-CTCCAGGAGGCAAGAAGATTC-3'
		Reverse 5'-ATAGTCCAGTGGAAGGAATG-3'
Clock	Mouse	Forward 5'-CACTCTCACAGCCCCACTGTAC-3'
		Reverse 5'-CCCCACAAGCTACAGGAGCAGT-3'
Per1	Mouse	Forward 5'-AACGGGATGTGTTTCGGGGTGC-3'
		Reverse 5'-AGGACCTCCTCTGATTCGGCAG-3'
Per2	Mouse	Forward 5'-CCACACTTGCCTCCGAAATA-3'
		Reverse 5'-ACTGCCTCTGGACTGGAAGA-3'
Cry1	Mouse	Forward 5'-CCCAGGCTTTTCAAGGAATGGAAC-3'
		Reverse 5'-GCAGGGAGTTTGCATTCATTCGAG-3'
Cry2	Mouse	Forward 5'-TGGGCATCAACCGATGGAG-3'
		Reverse 5'-CCCATTCCTTGAACAGCCTTG-3'
Rev-erbα	Mouse	Forward 5'-TTTTTCGCCGGAGCATCCAA-3'
		Reverse 5'-ATCTCGGCAAGCATCCGTTG-3'
Rev-erbβ	Mouse	Forward 5'-CGCACATTGCCGATATAGGAGG-3'
		Reverse 5'-GAGACTGCCACCACCACGTACT-3'
Rorα	Mouse	Forward 5'-CCAACCGTGTCCATGGCAGAAC-3'
		Reverse 5'-GCACACAGCTGCCACATCACCT-3'
Rorγ	Mouse	Forward 5'-CGCGGAGCAGACACACTTA-3'
		Reverse 5'-CCCTGGACCTCTGTTTTGGC-3'
Rn18s	Mouse	Forward 5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'
		Reverse 5'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3'

PXR、PPARα激动所致小鼠肝增大的昼夜节律研究

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冼图 ¹ , 田佳宁 ¹ , 李宣 ² , 范仕成 ² , 蔡承晖 ¹ , 赵鹏飞 ¹ , 黄民 ¹^,^* , 毕惠嫦 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(12): 3251-3260

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(12): 3251-3260

PXR、PPARα激动所致小鼠肝增大的昼夜节律研究

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冼图¹, 田佳宁¹, 李宣², 范仕成², 蔡承晖¹, 赵鹏飞¹, 黄民¹^,^*, 毕惠嫦¹^,²^,^*

作者信息

1.中山大学药学院, 广东广州 510006

2.南方医科大学药学院, 广东广州 510515

通讯作者:

^*黄民, Tel: 86-20-39943011, E-mail: huangmin@mail.sysu.edu.cn;

毕惠嫦, Tel: 86-20-61648530, E-mail: bihchang@smu.edu.cn

Diurnal rhythm of PXR or PPARα activation-induced liver enlargement

Tu XIAN¹, Jia-ning TIAN¹, Xuan LI², Shi-cheng FAN², Cheng-hui CAI¹, Peng-fei ZHAO¹, Min HUANG¹^,^*, Hui-chang BI¹^,²^,^*

Affiliations

1. School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China

2. School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

出版时间: 2024-12-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0730

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摘要

收起

肝脏大小受生物钟控制并具有昼夜节律。孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR) 和过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα) 是核受体超家族的重要成员。本课题组前期发现, 鼠源激动剂孕烯醇酮16α-腈(pregnenolone 16α-carbonitrile, PCN) 激动PXR、匹立尼酸(pirinixic acid, WY-14643) 激动PPARα后均显著促进小鼠生理性肝增大及部分肝切除术后肝再生。但是, PXR、PPARα激动所致肝增大的昼夜变化尚不清楚。因此, 本研究考察连续3天不同时辰给予雄性C57BL/6小鼠玉米油、PCN或WY-14643后肝脏大小及生物钟相关基因等的变化。本动物实验方案经中山大学实验动物伦理委员会审核批准(批准号: SYSU-IACUC-2023-001613、SYSU-IACUC-2023-001783)。结果表明, 连续3天不同时辰给予PXR、PPARα激动剂均显著促进小鼠肝增大, 其所致肝增大与肝脏大小本身的昼夜节律基本一致, 且基本不影响生物钟相关基因的表达, 提示PXR、PPARα激动可能不影响肝脏大小本身的昼夜节律。本研究阐明了PXR、PPARα激动所致肝增大的昼夜节律, 为核受体促进肝增大及肝脏大小昼夜节律的研究提供新数据和参考。

关键词

孕烷X受体 / 过氧化物酶体增殖物激活受体α / 核受体 / 肝增大 / 昼夜节律

Abstract

收起

Liver size is regulated by circadian clock and exhibits a diurnal rhythm. Pregnane X receptor (PXR) and peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), members of nuclear receptor superfamily, are important regulators of liver size. We previously demonstrated that mPXR agonist pregnenolone 16α-carbonitrile (PCN) and mPPARα agonist pirinixic acid (WY-14643) promoted liver enlargement and liver regeneration after partial hepatectomy. However, whether PXR or PPARα activation-induced liver enlargement exhibits diurnal rhythm with normal liver diurnal oscillations remains unclear. The aim of this study was to investigate the diurnal rhythm of PXR or PPARα activation-induced liver enlargement. Male C57BL/6 mice were intraperitoneally injected with corn oil, PCN or WY-14643 for three days, and liver samples were weighed and collected at various time points for analysis. The animal experiment protocol was reviewed and approved by Institutional Animal Care and Use Committee of Sun Yat-sen University (approval No. SYSU-IACUC-2023-001613, SYSU-IACUC-2023-001783). The results showed that PXR or PPARα activation at various time points significantly induced liver enlargement, and liver size maintained normal diurnal oscillations during PXR or PPARα activation-induced hepatomegaly, without significant effects on the expression of core clock genes. This study reveals PXR or PPARα activation-induced liver enlargement exhibits diurnal rhythm with normal liver diurnal oscillations, and provides novel data for nuclear receptor-induced liver enlargement and liver diurnal rhythm.

Key words

pregnane X receptor / peroxisome proliferator-activated receptor α / nuclear receptor / liver enlargement / diurnal rhythm

引用本文

冼图, 田佳宁, 李宣, 范仕成, 蔡承晖, 赵鹏飞, 黄民, 毕惠嫦. PXR、PPARα激动所致小鼠肝增大的昼夜节律研究. 药学学报, 2024 , 59 (12) : 3251 -3260 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0730

Tu XIAN, Jia-ning TIAN, Xuan LI, Shi-cheng FAN, Cheng-hui CAI, Peng-fei ZHAO, Min HUANG, Hui-chang BI. Diurnal rhythm of PXR or PPARα activation-induced liver enlargement[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (12) : 3251 -3260 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0730

正文

收起

哺乳动物体内生物钟系统控制着机体内的昼夜节律, 以适应地球自转产生的昼夜交替。外界存在使生物钟周期与环境周期同步的时间信息, 称为授时因子(zeitgeber), 其中光照是最重要的授时因子。授时因子参与调控的时间称为授时因子时间(zeitgeber time, ZT), 在光照-黑暗循环中, ZT0是光照开始的时间, ZT12是黑暗开始的时间^[1]。生物钟从结构上分为中枢生物钟和外周生物钟, 中枢生物钟位于下丘脑视交叉上核, 外周生物钟存在于大部分器官与组织中^[2]。其中, 肝脏是昼夜节律基因表达最为丰富的器官^[3]。早在20世纪50年代, 先后有研究发现鸟类^{[4, 5]}、小鼠^[6-9]、大鼠^[10-15]、家兔^[16]、人类^[17]等的肝脏大小在一天当中具有波动性, 肝脏大小曲线的峰谷值均出现在光照-黑暗交替时辰附近。以雄性C57BL/6小鼠为例, 在12 h∶12 h光照-黑暗、自由饮食条件下, 小鼠肝脏大小峰值出现在ZT0附近, 谷值出现在ZT12附近, 肝脏大小在一天中呈现先下降后上升的趋势, 说明肝脏大小具有昼夜节律^{[6, 8]}。尽管目前有较多肝脏昼夜节律的研究, 但关注肝脏大小昼夜节律的研究较少, 且不同生理/病理条件下肝脏大小的昼夜节律变化尚不清楚。

肝增大(liver enlargement) 又称为肝肥大(liver hypertrophy)、肝肿大(hepatomegaly) 或肝增生(liver hyperplasia), 根据是否具有肝损伤分为生理性肝增大和病理性肝增大^[18]。核受体超家族是一类配体激活的转录因子, 调节代谢、增殖、炎症、昼夜节律等生理过程^[19]。研究发现, 孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR)、过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα)、组成型雄甾烷受体(constitutive androstane receptor, CAR) 等激动后均可诱导小鼠肝脏显著增大^[20]。本课题组前期研究发现, 激动剂孕烯醇酮16α-腈(pregnenolone 16α-carbonitrile, PCN) 激动鼠源PXR、匹立尼酸(pirinixic acid, WY-14643) 激动鼠源PPARα后, 均显著促进小鼠生理性肝增大和部分肝切除术后肝再生^{[21, 22]}。但是, 在PXR、PPARα激动所致生理性肝增大过程中, 肝脏大小的昼夜节律尚不清楚, PXR、PPARα激动是否影响生物钟基因的表达也有待探究。

综上, 本研究旨在阐明PXR、PPARα激动所致肝增大过程中, 肝脏大小的昼夜节律及生物钟基因的表达, 为PXR、PPARα激动所致肝增大及肝脏大小昼夜节律的基础研究提供科学数据。

材料与方法

收起

药品与试剂

PCN、WY-14643 (美国APExBio公司, 货号: C3884、A4305); 玉米油(上海阿拉丁公司, 货号: C116025); RIPA裂解液、PMSF溶液(上海博彩生物科技有限公司, 货号: R0127、R0092); BCA蛋白定量试剂盒、预染蛋白分子marker (美国Thermo Fisher Scientific公司, 货号: 23225、26616); 5×双色蛋白上样缓冲液(杭州弗德生物科技有限公司, 货号: FD006); 30% Acr-Bis制胶液、1 mol·L^-1 Tris-HCl缓冲液(pH=6.8)、1.5 mol·L^-1 Tris-HCl缓冲液(pH=8.8)、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(深圳迈科斯生物科技有限公司, 货号: DB240、DB241、DB242、TC285、TC302); 四甲基乙二胺(上海麦克林生化科技有限公司, 货号: T6023); PAGE胶凝固剂(青岛生物科技公司, 货号: A012); 10%十二烷基硫酸钠溶液(美国Bio-Rad Laboratories公司, 货号: 1610416); 十二烷基硫酸钠、脱脂奶粉(德国Biofroxx公司, 货号: 3250GR500、1172GR500); 通用型抗体稀释液(苏州新赛美生物科技有限公司, 货号: WB500D); anti-cytochrome P450 2B10 (细胞色素P450 2B10, CYP2B10) 一抗、anti-cytochrome P450 3A11 (细胞色素P450 3A11, CYP3A11) 一抗(武汉艾博泰克生物科技有限公司, 货号: A1463、A2544); anti-cytochrome P450 4A (细胞色素P450 4A, CYP4A) 一抗(美国Santa Cruz Biotechnology公司, 货号: sc-271983); anti-acyl-coenzyme A oxidase 1 (酰基辅酶A氧化酶1, ACOX1) 一抗(上海生工生物工程股份有限公司, 货号: D121471); anti-β-actin (ACTB) 一抗、anti-rabbit IgG-HRP-linked二抗、anti-mouse IgG-HRP-linked二抗(美国Cell Signaling Technology公司, 货号: 4970S、7074S、7076S); ECL发光液(美国Merck Millipore公司, 货号: WBKLS0500); 硝酸纤维素膜(美国Pall公司, 货号: 66485); AG RNAex Pro RNA提取试剂、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司, 货号: AG21102、AG11718、AG11728); Tris-EDTA缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司, 货号: ST725)。

仪器

冷冻离心机、微量移液器、梯度qPCR仪(德国Eppendorf公司, 型号: 5427R、Research plus、Mastercycler ep gradient); 十万分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo公司, 型号: XS105); 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司, 型号: KQ-800E); 实时荧光定量PCR仪、Nanodrop超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司, 型号: ABI7500、2000c); 电泳仪(美国Bio-Rad Laboratories公司, 型号: 1658040); 化学发光成像仪(上海天能科技有限公司, 型号: 5200); 4 ℃、-20 ℃、超低温冰箱(安徽中科美菱低温科技股份有限公司, 型号: YC-968L、DW-YL270、DW-HL828); 生物样本匀浆器(法国Bertin Technologies公司, 型号: Precellys 24); 涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司, 型号: G560E)。

实验动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠, 6~8周龄, 购买于广东省医学实验动物中心, 动物生产许可证号为SCXK (粤) 2022-0002。饲养于中山大学(东校园) 实验动物中心, 动物使用许可证号为SYXK (粤) 2023-0112。饲养条件: 小鼠自由饮水和摄食, 室内12 h∶12 h光照-黑暗模拟昼夜交替, 温度20~26 ℃, 相对湿度40%~70%, 每小时换气次数10~20次。动物实验经中山大学实验动物伦理委员会审核通过, 批准编号为SYSU-IACUC-2023-001613、SYSU-IACUC-2023-001783。

动物分组与给药

精密称定PCN或WY-14643 400 mg, 加玉米油40 mL, 充分涡旋后超声处理30 min使其混悬, 制备成10 mg·mL^-1浓度的PCN或WY-14643溶液, 储存于4 ℃冰箱, 每次使用前均涡旋混匀并超声处理。

连续3天不同时辰给予PXR或PPARα激动剂的动物实验分两次完成。动物实验中心早上8:00 (ZT0) 开灯, 晚上20:00 (ZT12) 关灯, 将一天24 h等分为6个时辰, 分别为9:00 (ZT1)、13:00 (ZT5)、17:00 (ZT9)、21:00 (ZT13)、次日1:00 (ZT17)、次日5:00 (ZT21), 各个时辰均设置对照组和给药组, 两次实验各12组, 按每组5~6只随机分配C57BL/6小鼠。处理前称量小鼠体重, 给药组每天腹腔注射(i.p.) PCN溶液或WY-14643溶液, 剂量均为100 mg·kg^-1·d^-1, 对照组每天腹腔注射玉米油, 注射体积为0.01 mL·g^-1, 共连续给药3天。各时辰组分别在最后一次给药24 h后处死并收集肝脏, 称重后冻存于-80 ℃冰箱。

Western blot检测

称取适量小鼠肝脏样本, 按说明书加入相应量的RIPA裂解液和PMSF溶液, 匀浆后离心30 min (温度4 ℃, 转速16 000 ×g), 取上清经BCA蛋白定量试剂盒定量后, 配成2 g·L^-1蛋白上样液。配制10% SDS-PAGE凝胶, 每孔上样15 μL, 经电泳分离后转印至硝酸纤维素膜上, 用5%脱脂牛奶封闭, 孵育一抗及二抗后显影。

实时荧光定量PCR检测

按说明书使用RNA提取试剂提取小鼠肝脏组织的总RNA后, 根据反转录和qPCR试剂盒说明书得到cDNA并检测目的基因的mRNA表达水平, 内参基因为Rn18s。引物序列如表 1所示。

统计学分析

本研究中数据均采用平均值±标准差(mean ± SD) 表示。采用Image J软件对Western blot检测结果进行定量, 使用GraphPad Prism 8.0.1软件制图。采用unpaired student's t-test检验(two-tailed) 比较同一时辰两组间差异; 采用one-way ANOVA检验比较不同时辰多组间差异, 当组内样本数相同时, 采用Tukey法进行两两比较; 当组内样本数不相同时, 采用Bonferroni法进行两两比较; 当P < 0.05具有统计学意义。

结果

收起

1 PXR、PPARα激动所致肝增大与肝脏大小本身的昼夜节律基本一致

为了考察激动PXR、PPARα所致肝增大的昼夜节律变化, 本研究连续3天在不同时辰(ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17和ZT21) 给予雄性C57BL/6小鼠PXR鼠源激动剂PCN或PPARα鼠源激动剂WY-14643 (图 1A)。结果显示, 给予PCN 3天后, 与各自对照组相比, 不同时辰组的小鼠肝重比均显著上升(图 1B), ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17和ZT21小鼠肝重比分别由5.18%、5.19%、4.56%、4.40%、4.50%和5.28%上升至7.14%、6.76%、6.65%、6.06%、6.61%和6.81%, 增幅分别为37.7%、30.1%、45.8%、37.6%、46.8%和29.0% (图 1C)。其中, PCN给药组及其对照组的肝重比在一昼夜内呈现先下降后上升的趋势, ZT21和ZT13分别是对照组肝重比的峰值(5.28%) 和谷值(4.40%), 而ZT1和ZT13分别是PCN给药组肝重比的峰值(7.14%) 和谷值(6.06%), 肝重比曲线的峰谷值基本都出现在光照-黑暗交替时辰附近, 与正常肝脏的昼夜节律基本一致^{[6, 8]}。然而增幅却呈现ZT9 (45.8%) 和ZT17 (46.8%) 两个峰值、ZT5 (30.1%) 和ZT21 (29.0%) 两个谷值, 增幅趋势与文献^[23]报道PXR的mRNA昼夜表达类似, 两个峰值与两个谷值之间分别有显著性差异。

与给予PCN类似, 给予WY-14643 3天后, 与各自对照组相比, 不同时辰组的小鼠肝重比亦均显著上升(图 1D), ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17和ZT21小鼠肝重比分别由5.26%、5.15%、4.64%、4.46%、4.98%和5.13%上升至6.89%、6.79%、6.08%、5.95%、6.68%和6.65%, 增幅分别为31.0%、31.7%、31.1%、33.4%、34.2%和29.6% (图 1E)。其中, WY-14643给药组及其对照组的肝重比在一昼夜内均呈现先下降后上升的趋势, ZT1和ZT13分别是对照组肝重比峰值(5.26%) 和谷值(4.46%), 也分别是WY-14643给药组肝重比峰值(6.89%) 和谷值(5.95%), 肝重比曲线的峰谷值都出现在光照-黑暗交替时辰附近, 与正常肝脏的昼夜节律基本一致^{[6, 8]}。增幅呈现先上升后下降的趋势, 趋势与文献^[24]报道PPARα的mRNA昼夜节律基本一致, 其中ZT17为增幅峰值(34.2%), 但6个时辰间比较无统计学差异。

以上结果提示, 在一昼夜内不同时辰给予PXR或PPARα激动剂均能显著诱导小鼠肝脏增大; PXR或PPARα激动剂所致肝增大过程中, 肝脏大小本身的昼夜节律不受影响。

2 连续3天不同时辰给予PXR或PPARα激动剂均能显著上调PXR或PPARα下游蛋白

为了考察不同时辰给予PXR或PPARα激动剂对PXR或PPARα下游蛋白的影响, 本研究检测了PXR下游蛋白CYP3A11、CYP2B10以及PPARα下游蛋白CYP4A、ACOX1的表达。Western blot结果显示, 在不同时辰给予PXR激动剂PCN后, 与各时辰相应对照组比较, PXR下游蛋白CYP3A11和CYP2B10均显著上调(图 2A), 提示不同时辰给予PCN均能激动PXR。其中, PCN给药组的CYP3A11表达峰值出现在ZT1, 对照组出现在ZT21 (图 2B); ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17和ZT21各时辰CYP3A11分别上调了5.0、4.4、4.7、4.7、4.7和3.6倍(图 2C), ZT1和ZT21分别为上调倍数的峰值(5.0倍) 和谷值(3.6倍), 但各时辰上调倍数相比无统计学差异。PCN给药组的CYP2B10表达峰值出现在ZT21, 对照组出现在ZT17 (图 2D), ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17和ZT21各时辰CYP2B10分别上调了4.9、3.0、4.2、4.0、2.4和3.0倍(图 2E), ZT1和ZT17分别为上调倍数的峰值(4.9倍) 和谷值(2.4倍), 但各时辰上调倍数相比无统计学差异。

在不同时辰给予PPARα激动剂WY-14643后, 与各时辰相应对照组比较, PPARα的下游蛋白CYP4A和ACOX1也显著上调(图 3A), 提示不同时辰给予WY-14643均能激动PPARα。其中, WY-14643给药组及其对照组的CYP4A表达峰值均出现在ZT21 (图 3B); ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17和ZT21各时辰CYP4A分别上调了2.7、3.0、3.0、2.3、2.1和2.1倍(图 3C), ZT5和ZT17分别为上调倍数的峰值(3.0倍) 和谷值(2.1倍), 两者相比有统计学差异。WY-14643给药组的ACOX1表达峰值出现在ZT17, 对照组出现在ZT13 (图 3D), ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17和ZT21各时辰ACOX1分别上调了6.3、5.0、6.2、4.0、5.7和5.2倍(图 3E), ZT1和ZT13分别为上调倍数的峰值(6.3倍) 和谷值(4.0倍), 但各时辰上调倍数相比无统计学差异。

3 连续3天不同时辰给予PXR或PPARα激动剂基本不影响生物钟相关基因的表达

为了进一步明确不同时辰给予PXR或PPARα激动剂后, 生物钟相关基因的表达变化, 本研究通过RT-qPCR检测了肝脏中脑和肌肉芳香烃受体核转位因子样蛋白1 (brain and muscle ARNT-like protein 1, Bmal1) 基因、昼夜运动输出周期(circadian locomotor output cycles kaput, Clock) 基因、周期1/2 (period 1/2, Per1/2) 基因、隐花色素1/2 (cryptochrome 1/2, Cry1/2) 基因、甲状腺激素受体的反向链α/β (reverse strand of ERB α/β, Rev-erbα/β) 基因、视黄酸受体相关孤儿核受体α/γ (retinoic acid receptor-related orphan receptor α/γ, Rorα/γ) 基因的mRNA表达水平。结果显示, 各组生物钟相关基因的表达趋势基本符合文献^{[6, 25-27]}报道的正常节律趋势。在不同时辰给予PXR激动剂PCN后, 与各个时辰相应对照组比较, PCN给药组的Clock、Per2、Cry2、Rev-erbβ、Rorγ在所有时辰均无显著性差异(图 4B、D、F、H和J), 而Bmal1在ZT13 (图 4A)、Per1在ZT13和ZT17 (图 4C)、Cry1在ZT9 (图 4E)、Rev-erbα在ZT13和ZT17 (图 4G)、Rorα在ZT17 (图 4I) 的mRNA表达水平下降。在不同时辰给予PPARα激动剂WY-14643后, 与各个时辰相应对照组比较, WY-14643给药组的Clock、Per1、Cry1、Cry2、Rev-erbα在所有时辰均无显著性差异(图 5B、C、E、F和G), 而Bmal1在ZT21 (图 5A)、Per2在ZT13和ZT21 (图 5D)、Rev-erbβ在ZT13 (图 5H)、Rorα在ZT13和ZT21 (图 5I)、Rorγ在ZT13和ZT21 (图 5J) 的mRNA表达水平下降。鉴于大部分基因的表达趋势基本符合文献^{[6, 25-27]}报道的正常节律趋势, 且与相应对照组比较表达水平没有显著差异, 以上结果提示, PXR、PPARα激动所致肝增大过程中, 生物钟相关基因的表达基本不受影响。

讨论

收起

PCN和WY-14643是公认的鼠源PXR和PPARα特异性激动剂, 是小鼠实验中常用于激动PXR和PPARα的经典工具药^{[28, 29]}。本课题组前期在PXR、PPARα促进肝增大的相关研究中, 给药时辰均为上午9:00 (即ZT1), 证明了PXR、PPARα激动后促进肝增大的作用^{[21, 22]}。另外, 还评估了PXR、PPARα激动1、2、3、5、7、10天致肝增大的动态变化特点, 给予PXR或PPARα激动剂3天后肝重比增幅较大, 此后趋于平缓, 进入平台期^{[30, 31]}。本研究在前期基础上, 继续沿用前期研究中使用的激动剂及相应剂量, 重点探讨不同时辰给予PXR或PPARα激动剂对肝增大的作用是否有影响, 且在PXR、PPARα激动条件下是否影响肝脏大小的昼夜节律。因此, 本研究选择ZT1作为起点给药时辰, 按照昼夜节律相关研究的惯例, 每隔4 h设置一个给药时辰点^{[4, 6-8, 12, 23, 24]}, 评估连续3天给予PXR或PPARα激动剂所致肝增大的昼夜节律。

生物钟会受到光暗周期、摄食、压力、运动等环境因素影响^[1]。肝脏是昼夜节律基因表达最为丰富的器官, 在正常光照和自由饮食条件下, 其大小本身具有昼夜节律。研究表明, 将摄食时间限制在黑暗(活动) 阶段的小鼠, 肝脏大小的节律会更显著和稳定; 而将摄食时间限制在光照(休息) 阶段的小鼠, 却会消除肝脏大小的昼夜节律^[8]。本研究在正常光照和自由饮食条件下, 给予小鼠PXR或PPARα激动剂, 以促进小鼠生理性肝增大。结果表明, 对照组和给药组小鼠的肝重比均显示出相对平稳的昼夜节律, 整体呈现先下降后上升的趋势, 峰值出现在ZT1或ZT21, 谷值出现在ZT13, 均在光照-黑暗交替时辰(ZT0和ZT12) 附近, 与正常肝脏的昼夜节律基本一致^{[6, 8]}, 这提示PXR或PPARα激动剂可能不影响肝脏大小的昼夜节律。先前研究表明, 肝脏大小昼夜节律性变化可能是由于脂质、糖原及相关代谢酶含量^{[4, 9]}、肝细胞的细胞器结构和数量发生改变^[32]。2017年有研究发现, 肝脏总RNA和总蛋白水平的节律性变化导致肝脏大小的昼夜改变, 进一步研究发现肝脏总蛋白水平的昼夜变化可能与核糖体数量有关; 核糖体RNA在细胞核中发生节律性降解, 导致核糖体数量的昼夜变化, 进而影响肝脏总蛋白质的昼夜合成^[8]。

本研究检测了PXR下游蛋白CYP3A11和CYP2B10、PPARα下游蛋白CYP4A和ACOX1的昼夜表达情况, 以证明不同时辰给予PCN均能激动PXR、不同时辰给予WY-14643均能激动PPARα。细胞色素P450 (cytochrome P450, CYP) 酶是最重要的药物Ⅰ相代谢酶, 作为处置外源性物质的关键酶系, 普遍认为在啮齿类动物活动和进食时表达最高^[33]。本研究检测的CYP酶的表达峰值基本出现在黑暗后期(ZT17和ZT21), 而PCN给药组的CYP3A11表达峰值出现在ZT1。尽管ZT1处于光照期, 但该时辰是由黑暗期刚转变为光照期, 啮齿类动物尚未完全进入静息状态, 因此该蛋白表达也符合规律。ACOX1是脂肪酸β-氧化途径中的一个关键代谢酶, 受到PPARα的直接调控, PPARα表达是在接近黑暗期开始时达到峰值^[34], 本研究中ACOX1表达峰值出现在黑暗前期(ZT13和ZT17), 基本符合PPARα和ACOX1的表达规律。此外, 本研究观察到不同时辰PXR、PPARα下游蛋白上调倍数有差异, 但具体原因还需要进一步研究。

哺乳动物的生物钟分子机制由转录和翻译负反馈环路构成, 其中两条最主要的环路如下: 核心生物时钟因子BMAL1和CLOCK相互结合形成异二聚体后进入细胞核, 启动Per和Cry的转录。当PER和CRY蛋白水平累积到一定程度时, 该环路受到负反馈抑制。另一个环路涉及两个核受体, 分别是REV-ERB和ROR。其中ROR蛋白激活BMAL1转录, 而REV-ERB蛋白抑制BMAL1转录, 由此形成第二个负反馈环路^[35-39]。本研究检测了连续3天不同时辰给予PXR或PPARα激动剂后核心生物钟基因的mRNA表达水平, 部分基因表达水平在个别时辰给药后有所下降, PXR激动引起Bmal1、Per1、Cry1、Rev-erbα、Rorα的mRNA水平下降出现在ZT9、ZT13、ZT17, 即在光照期转变为黑暗期附近, 但未见PXR与变化基因相互作用的报道, 具体原因需要进一步探究; PPARα激动引起Bmal1、Per2、Rev-erbβ、Rorα、Rorγ的mRNA水平下降则出现在ZT13或ZT21, 即在光照-黑暗的两次转变附近, 有研究报道PPARα与部分变化基因有一定程度的相互作用^[40-42], 但为何在本研究中仅在ZT13或ZT21发生mRNA水平下降, 未见相关报道, 具体原因也需要进一步探究。然而, 上述基因的变化仅局限于单一或某些时辰, 且多数基因的变化幅度较小。因此, 从整体节律基因表达水平分析, 本课题组推断PXR、PPARα激动所致肝增大过程中, 生物钟相关基因的表达基本不受影响。

核受体占人类药物靶点的3%, 据统计目前FDA批准的新药有16%靶向核受体, 主要适应症包括过敏、自身免疫性疾病、高脂血症、避孕、激素治疗和癌症等^[43]。临床使用的许多药物具有PXR或PPARα的激动活性, 如利福平、地塞米松、米非司酮、五酯片的活性成分五味子醇乙^[44-46]具有PXR激动活性, 非诺贝特、苯扎贝特、吉非贝齐等则可激动PPARα从而改善脂质代谢^[28]。核受体作为广泛的药物靶点, 了解其昼夜节律模式, 有助于时间疗法的发展^[23]。研究表明, 饮食诱导肥胖的小鼠模型中肝脏的PPARα节律表达被放大, 研究人员分别在PPARα表达峰值和谷值时辰灌胃给予WY-14643; 结果发现, 相比谷值时辰, 在峰值时辰给药可最大限度降低肝脏和血清甘油三酯^[47]。因此, 通过与核受体峰值水平相匹配的给药时间来提高药物疗效, 可能是未来精准个体化用药的发展方向。

综上所述, 本研究证明PXR、PPARα激动所致肝增大的节律与肝脏大小本身的昼夜节律基本一致, 连续3天不同时辰给予PXR或PPARα激动剂基本不影响生物钟相关基因的表达, 为核受体促进肝增大及肝脏大小昼夜节律的基础研究提供数据和参考。

作者贡献: 冼图负责实验设计与实施、结果统计与分析、撰写论文; 田佳宁负责部分实验设计与实施、结果统计与分析; 李宣、蔡承晖、赵鹏飞负责部分实验的实施; 范仕成负责部分实验的设计与指导、修订论文; 黄民和毕惠嫦负责研究思路的提出、实验设计与指导、修订论文。

利益冲突: 本文所有作者之间均不存在利益冲突。

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2024年第59卷第12期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0730

接收时间：2024-07-29
首发时间：2025-11-24
出版时间：2024-12-12

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收稿日期：2024-07-29
修回日期：2024-09-20

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广东省药品监督管理局科技创新项目(2023ZDZ06)

作者信息

1.中山大学药学院, 广东广州 510006

2.南方医科大学药学院, 广东广州 510515

通讯作者:

^*黄民, Tel: 86-20-39943011, E-mail: huangmin@mail.sysu.edu.cn;

毕惠嫦, Tel: 86-20-61648530, E-mail: bihchang@smu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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