药学学报

基于细胞的TMPRSS2抑制剂高通量筛选模型建立与应用

PDF下载

尤宝庆 , 周雯雯 , 李妍 , 张晶 ^* , 司书毅 ^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(12): 3273-3281

收起

药学学报 | 研究论文 2024, 59(12): 3273-3281

基于细胞的TMPRSS2抑制剂高通量筛选模型建立与应用

全屏

尤宝庆, 周雯雯, 李妍, 张晶^*, 司书毅^*

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院, 医药生物技术研究所, 北京 100050

通讯作者:

^*张晶, Tel: 86-10-63180623, E-mail: jingjing-506@hotmail.com;

司书毅, Tel: 86-10-63180604, E-mail: sisyimb@hotmail.com

Establishment and application of a cell-based high-throughput screening model for TMPRSS2 inhibitors

Bao-qing YOU, Wen-wen ZHOU, Yan LI, Jing ZHANG^*, Shu-yi SI^*

Affiliations

Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2024-12-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0518

文章导航

摘要

收起

跨膜丝氨酸蛋白酶2 (transmembrane serine protease 2, TMPRSS2) 是人体中广泛存在的细胞表面蛋白, 参与严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 等多种病毒的感染和前列腺癌细胞侵袭、肿瘤生长和转移过程等。本研究使用Boc-Gln-Ala-Arg-AMC作为表征TMPRSS2切割活性的底物, 在过表达TMPRSS2的Vero E6细胞(Vero E6/TMPRSS2) 中建立了TMPRSS2抑制剂细胞筛选模型, 通过对国家新药(微生物) 筛选实验室天然与合成化合物纯品库进行高通量筛选, 得到了7个具有TMPRSS2抑制活性的低毒化合物。表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) 检测证明所得抑制剂均可与TMPRSS2发生中等强度的结合, 且呈现浓度依赖性; 细胞-细胞融合实验表明, 所得抑制剂可通过抑制TMPRSS2切割SARS-CoV-2 S蛋白, 抑制SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合的发生, 呈现浓度依赖性; 假病毒活性评价结果显示, 小分子抑制剂对野生型SARS-CoV-2假病毒感染Opti-HEK-293T-ACE2受体细胞表现出不同程度的抑制活性。本研究成功建立了细胞模型用于TMPRSS2抑制剂的高通量筛选, 并初步证实筛选所得的抑制剂具有体外抗TMPRSS2活性的作用, 为抗SARS-CoV-2的新药研发提供了新结构骨架。

关键词

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 / 跨膜丝氨酸蛋白酶2 / 高通量筛选模型 / 表面等离子共振 / 细胞-细胞融合

Abstract

收起

Transmembrane serine protease 2 (TMPRSS2) is a cell surface protease widely present in the human body. It is involved in the infection of various viruses such as severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), and in the cell invasion, tumor growth and metastasis processes of prostate cancer. This study used Boc-Gln-Ala-Arg-AMC as the fluorescent substrate to determine the cleavage activity of TMPRSS2 towards SARS-CoV-2 S protein. Then cell-based screening model for TMPRSS2 inhibitors was established in Vero E6 cells overexpressing TMPRSS2 (Vero E6/TMPRSS2). Seven compounds exhibiting TMPRSS2 inhibitory activities with low toxicity were obtained through high-throughput screening (HTS) from natural and synthetic compound pure product library of National Center for Screening Novel Microbial Drugs. Surface plasmon resonance (SPR) has shown that the obtained inhibitors could bind to TMPRSS2 with moderate affinity in a dose dependent manner. Cell-cell fusion experiments have shown that the obtained inhibitors can inhibit the occurrence of S protein mediated cell-cell fusion by inhibiting TMPRSS2 cleavage of SARS-CoV-2 S protein in a concentration dependent manner. Preliminary pseudovirus experiment showed that the inhibitors may reduce the pseudovirus infection into Opti-HEK-293T-ACE2 cells to varying degrees. In a word, this study successfully established a cell-based HTS model for TMPRSS2 inhibitor and preliminarily confirmed that the seven screened inhibitors possessed in vitro anti-TMPRSS2 activities, providing new structural scaffolds for the development of new drugs against SARS-CoV-2.

Key words

severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 / transmembrane serine protease 2 / high-throughput screening model / surface plasmon resonance / cell-cell fusion

引用本文

尤宝庆, 周雯雯, 李妍, 张晶, 司书毅. 基于细胞的TMPRSS2抑制剂高通量筛选模型建立与应用. 药学学报, 2024 , 59 (12) : 3273 -3281 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0518

Bao-qing YOU, Wen-wen ZHOU, Yan LI, Jing ZHANG, Shu-yi SI. Establishment and application of a cell-based high-throughput screening model for TMPRSS2 inhibitors[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (12) : 3273 -3281 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0518

正文

收起

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 是2019年末发现的新型冠状病毒, 自发现至今, SARS-CoV-2已在全球范围内造成超7亿人感染, 超700万人死亡(https://data.who.int/dashboards/covid19/cases), 对全民健康造成了严重危害。

跨膜丝氨酸蛋白酶2 (transmembrane serine protease 2, TMPRSS2) 是人体中广泛存在的细胞表面蛋白, 主要在前列腺中表达, 同时在肺、结肠、肝脏、肾脏和胰腺中也有分布^[1], 参与多种疾病的发生发展过程。在SARS-CoV-2感染过程中, TMPRSS2通过对SARS-CoV-2刺突蛋白(spike protein, S) S2′位点的切割, 参与病毒与宿主细胞的膜融合过程^[2-4]。除SARS-CoV-2外, TMPRSS2还参与了多种病毒的感染过程, 包括引发了全球大流行性疾病的非典型肺炎病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV) 和中东呼吸综合征冠状病毒^[5]、其他冠状病毒如HCoV-HKU1^[6]和HCoV-229E^[7]、流感病毒如H1N1、H7N9^{[1, 8]}和人类偏肺病毒^[9]等。因此, 作为病毒侵入过程中的重要作用靶点, 筛选TMPRSS2抑制剂将有助于发现广谱抗病毒药物。此外, TMPRSS2在前列腺癌细胞侵袭、肿瘤生长和转移过程中均起重要作用^[10]。

TMPRSS2可水解荧光底物(Boc-Gln-Ala-Arg-AMC acetate) 产生游离的7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin, AMC), 被释放的AMC的荧光可在激发波长(Ex) 340 nm、发射波长(Em) 440 nm的条件下被酶标仪检测到, 通过96孔板中荧光强度的变化判断TMPRSS2的活性变化, 目前此方式已广泛应用于TMPRSS2抑制剂的活性评价^[11-13]。本研究选择此荧光底物作为活性指示标记建立TMPRSS2抑制剂细胞筛选模型, 对国家新药(微生物) 筛选实验室天然与合成化合物纯品库进行高通量筛选, 获得了7个具有TMPRSS2抑制活性的化合物, 并对筛选所得抑制剂进行了初步的体外活性评价, 以期为抗病毒感染或抗前列腺癌药物的发现提供新思路。

材料与方法

收起

试剂与材料

过表达TMPRSS2的Vero E6细胞(Vero E6/TMPRSS2) 购自Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell Bank, 使用10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1%青链霉素混合液和2%遗传霉素(geneticin, G418) 的DMEM培养; HEK-293T-ACE2过表达细胞(货号41107ES03) 购自上海翌圣生物科技股份有限公司, 使用10% FBS、1%青链霉素混合液和0.75 μg·mL^-1嘌呤霉素的DMEM培养; HEK-293T、Vero E6细胞使用10% FBS、1%青链霉素混合液的DMEM培养; 甲磺酸卡莫司他(camostat mesylate, 货号T2391) 购自上海陶术生物科技有限公司; Boc-Gln-Ala-Arg-AMC acetate (货号HY-134432B) 购自美国MedChemexpress生物科技公司; CCK-8试剂盒(货号BS350B)、PBS磷酸盐缓冲液干粉(货号BL601A) 购自合肥白鲨生物科技有限公司; 20× PBS Tween-20 (货号28352)、DMEM (货号C11995500BT)、FBS (货号10270-106)、geneticin (货号10131-035) 购自美国Thermo Scientific公司; 胰酶(货号T1300)、青链霉素混合液(货号P1400) 和Hoechst 33342 (货号B8040) 购自北京索莱宝科技有限公司; 转染试剂LipoMax (货号32012) 购自南京南晶生物科技有限公司; pAAV-IRES-EGFP质粒(货号LM8151) 购自上海联迈生物工程有限公司; pAAV-IRES-EGFP-SARS-CoV-2-S质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司全合成; 化合物假病毒活性由南京金斯瑞蓬勃生物科技有限公司检测。

实验仪器

微孔板恒温振荡器(北京佳源兴业科技有限公司); EnVision多功能酶标仪、Operetta CLS高内涵细胞成像与分析系统(美国PerkinElmer公司); SR8600表面等离子共振仪(美国Reichert Technologies公司)。

TMPRSS2抑制剂细胞筛选模型的建立

Vero E6/TMPRSS2细胞以每孔100 μL均匀铺于白底、透明盖的96孔板中, 在37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h, PBS洗涤3次, 每孔加入100 μL终浓度为400、200、150、100、50、25、12.5、6.25 μmol·L^-1的荧光底物Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, 3组复孔。设置多功能酶标仪Ex为340 nm, Em为440 nm, 每30 s读取1次相对荧光强度(relative fluorescence unit, RFU)。使用GraphPad Prism 9.5.1软件拟合米氏方程, 计算TMPRSS2的米氏常数(Michaelis constant, K_m) 与最大反应速度(V_max) 以确定模型的可用性和最佳底物浓度。

选择TMPRSS2抑制剂camostat mesylate验证模型的可靠性, 细胞培养方式同上。用PBS梯度稀释的camostat mesylate以每孔50 μL加至96孔板中, 室温(room temperature, RT) 孵育30 min, 再加入终浓度为50 μmol·L^-1的Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, 微孔板恒温振荡器中RT避光孵育1 h, 酶标仪检测RFU的变化, GraphPad Prism 9.5.1计算半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)。

细胞筛选模型重复性分析。将96孔板分为两部分, 其一为Vero E6/TMPRSS2细胞(阳性对照), 另一组仅含DMEM (阴性对照), 其他处理方式同上。向96孔板中加入终浓度为50 μmol·L^-1的Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, 微孔板恒温振荡器中RT避光孵育1 h后检测RFU。按照公式(1) 计算Z因子, SD为对照组的标准差, μ为对照组的平均值。

(1)

$ Z=1-\frac{3\times (\mathrm{S}{\mathrm{D}}_{\mathrm{阳}\mathrm{性}\mathrm{对}\mathrm{照}}-\mathrm{S}{\mathrm{D}}_{\mathrm{阴}\mathrm{性}\mathrm{对}\mathrm{照}})}{\left|{\mu }_{\mathrm{阳}\mathrm{性}\mathrm{对}\mathrm{照}}-{\mu }_{\mathrm{阴}\mathrm{性}\mathrm{对}\mathrm{照}}\right|} $

TMPRSS2抑制剂高通量筛选

细胞培养方式同“TMPRSS2抑制剂细胞筛选模型的建立”。所筛选的化合物来自国家新药(微生物) 筛选实验室天然与合成化合物纯品库, 化合物(10 mg·mL^-1) 储存于4 ℃环境中, 取1 μL化合物加至49 μL PBS中, 与细胞RT孵育30 min, 随后加入终浓度为50 μmol·L^-1的荧光底物Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, RT避光孵育1 h, 酶标仪检测RFU, 按照公式(2) 计算抑制率。DMSO处理的Vero E6/TMPRSS2细胞为阳性对照组, 仅含DMEM的组别为阴性对照。

(2)

$ \begin{array}{l}\mathrm{化}\mathrm{合}\mathrm{物}\mathrm{抑}\mathrm{制}\mathrm{率}\left(\mathrm{\%}\right)=\\ \left(1-\frac{\mathrm{R}\mathrm{F}{\mathrm{U}}_{\mathrm{化}\mathrm{合}\mathrm{物}\mathrm{组}}-\mathrm{R}\mathrm{F}{\mathrm{U}}_{\mathrm{阴}\mathrm{性}\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{组}}}{\mathrm{R}\mathrm{F}{\mathrm{U}}_{\mathrm{阳}\mathrm{性}\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{组}}-\mathrm{R}\mathrm{F}{\mathrm{U}}_{\mathrm{阴}\mathrm{性}\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{组}}}\right)\times 100\mathrm{\%}\end{array} $

选择初筛浓度(100 μg·mL^-1) 下抑制率高于75%的化合物进行不同浓度抑制率的检测, 计算IC₅₀。

TMPRSS2抑制剂细胞毒评价

使用CCK-8试剂盒对复筛所得小分子抑制剂进行细胞毒性检测。HEK-293T、Vero E6细胞经胰酶消化后, 8×10³个/孔接种到96孔细胞培养板中, 生长至对数期后, 吸出培养基, 使用无FBS的培养基倍比稀释化合物(100~0.78 μg·mL^-1), 每孔100 μL加入到96孔细胞培养板中, 每个浓度3个复孔。化合物处理细胞24 h后, 每孔加入10 μL CCK-8检测试剂避光培养2 h, 酶标仪读取450 nm处的吸光度(A)。实验重复3次, 按照公式(3) 计算细胞存活率。DMSO处理的细胞作为对照组, 选择不含细胞的DMEM作为空白组。

(3)

$ \mathrm{细}\mathrm{胞}\mathrm{存}\mathrm{活}\mathrm{率}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{{A}_{\mathrm{化}\mathrm{合}\mathrm{物}\mathrm{组}}-{A}_{\mathrm{空}\mathrm{白}\mathrm{组}}}{{A}_{\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{组}}-{A}_{\mathrm{空}\mathrm{白}\mathrm{组}}}\times 100\mathrm{\%} $

表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)

利用SPR检测小分子抑制剂与TMPRSS2的相互作用^[14-16]。使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 1∶1进行全芯片激活, 用pH 4.5的乙酸钠溶液稀释TMPRSS2至80 μg·mL^-1, 固定在左通道, 右通道作为空白对照。当蛋白质被固定到所需信号值时, 注入1 mol·L^-1乙醇胺(pH 8.5) 阻断芯片表面上未与蛋白质结合的区域。用0.22 μm滤膜过滤的含有5% DMSO的PBST缓冲液稀释化合物, 使其终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 μmol·L^-1。样品加载过程0.5 min, 自然解离2.5 min, 样品流速设置为25 μL·min^-1。观察不同浓度的小分子抑制剂与芯片上固定蛋白的结合情况, 使用Trace Drawer软件计算平衡结合常数(K_D)^[17]。

SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合实验

细胞融合实验可在细胞水平上间接检测筛选所得小分子抑制剂对TMPRSS2功能的影响^[18]。在SARS-CoV-2感染宿主细胞的过程中, S蛋白与宿主细胞表面血管紧张素转化酶2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2) 结合, TMPRSS2通过对S蛋白切割参与病毒膜与宿主细胞膜的融合过程^[19]。使用转染TMPRSS2的HEK-293T-ACE2细胞作为靶细胞, 转染pAAV-IRES-EGFP-SARS-CoV-2-S的HEK-293T细胞作为供体细胞, 这两种细胞共培养作为融合对照, 靶细胞与转染pAAV-IRES-EGFP的HEK-293T细胞共培养作为非融合对照^{[17, 20]}。HEK-293T-ACE2/TMPRSS2细胞经胰酶消化后, 用含10% FBS的DMEM培养基稀释至10⁵个/孔, 转移至96孔板中, 并在加药处理30 min后加入供体细胞, 37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养24 h, RT下加入终浓度为1 μg·mL^-1的Hoechst 33342对细胞核进行染色, 活细胞高内涵图像分析系统拍照, 选择3个视野统计分析, 带有EGFP的细胞在Em为488 nm时呈现绿色, 细胞核经染色后在Em为461 nm时呈现蓝色, 以此计算融合细胞的比例。

TMPRSS2抑制剂假病毒活性评价

Opti-HEK-293T-ACE2细胞2×10⁴个/孔铺于96孔板中, 将野生型SARS-CoV-2假病毒(SC2087A) 和不同浓度的小分子化合物(IMB-4524的浓度为15、7.5 μmol·L^-1; 其余化合物浓度为50、10 μmol·L^-1) 或阳性对照ACE2-Fc加入至96孔板中, 于37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育48 h。去除培养基, 立即加入Fire-Lumi^TM检测试剂(GenScript, L00877C), RT孵育3~5 min, 酶标仪中检测结果。

统计学分析

采用GraphPad Prism 9.5.1进行统计分析, 数据以x ± s表示。组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, one-way ANOVA), 以P < 0.05为差异具有统计学意义。

结果

收起

1 TMPRSS2抑制剂细胞筛选模型建立

利用通用底物Boc-Gln-Ala-Arg-AMC检测Vero E6/TMPRSS2细胞内源性TMPRSS2切割SARS-CoV-2 S蛋白的活性(图 1A), 经计算K_m为37.36 μmol·L^-1, V_max为15.60 RFU·min^-1 (图 1B), 证明内源性TMPRSS2可用于建立细胞筛选模型。在此模型上, 加入不同浓度的TMPRSS2抑制剂camostat mesylate拟合IC₅₀为13.47 ± 6.60 nmol·L^-1 (图 1C), 与文献^[21]报道的活性相当。通过细胞筛选模型重复性分析计算此细胞模型的Z因子为0.73 (图 1D), 符合高通量筛选模型的要求^[22]。

2 TMPRSS2小分子抑制剂的筛选

采用Vero E6/TMPRSS2细胞筛选模型对国家新药(微生物) 筛选实验室的化合物库进行4 000样次高通量筛选, 初筛浓度为100 μg·mL^-1, 抑制率大于75%的化合物认定为初筛阳性, 进行复测确定IC₅₀, 得到7个具有TMPRSS2抑制活性的化合物(结构见图 2, 活性见图 3), 分别为IMB-4524 (IC₅₀=5.17 ± 1.53 μmol·L^-1)、IMB-5155 (IC₅₀=8.18 ± 0.84 μmol·L^-1)、IMB-0297 (IC₅₀=19.57 ± 2.12 μmol·L^-1)、IMB-0028 (IC₅₀=94.68 ± 19.31 μmol·L^-1)、IMB-0029 (IC₅₀=294.40 ± 14.85 μmol·L^-1)、IMB-6290 (IC₅₀=58.32 ± 3.47 μmol·L^-1) 和IMB-8010 (IC₅₀=21.40 ± 3.02 μmol·L^-1), 其中, IMB-4524、IMB-5155、IMB-0297和IMB-8010对TMPRSS2的抑制作用较强。

3 小分子抑制剂细胞毒评价

使用CCK-8试剂盒评价筛选得到的小分子抑制剂在HEK-293T和Vero E6细胞上的毒性(图 4)。结果显示, IMB-4524在HEK-293T和Vero E6细胞上具有一定的毒性, 半数细胞毒性浓度(concentration of cytotoxicity 50%, CC₅₀) 分别为31.92 ± 0.48和27.7 ± 3.07 μmol·L^-1, 其余6个化合物在工作浓度下均无细胞毒性。

4 小分子抑制剂与TMPRSS2亲和力检测

使用SPR技术检测小分子抑制剂与TMPRSS2的结合活性。结果发现, 筛选所得小分子抑制剂均可与TMPRSS2呈浓度依赖性结合, 结合强度中等(图 5)。其中, 化合物IMB-0028和IMB-0029与TMPRSS2呈现快结合快解离, 能够迅速达到稳态; IMB-4524、IMB-0297、IMB-6290和IMB-8010与TMPRSS2的结合特征为快结合慢解离; IMB-5155与TMPRSS2呈现快结合不解离的动力学特征。

5 小分子抑制剂对SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合的影响

转入pAAV-IRES-EGFP-SARS-CoV-2-S的HEK-293T细胞与过表达TMPRSS2的HEK-293T-ACE2细胞共培养(融合对照), 因HEK-293T细胞表面表达SARS-CoV-2 S蛋白后, 会识别HEK-293T-ACE2/TMPRSS2细胞表面ACE2受体并与其结合, 通过TMPRSS2对SARS-CoV-2 S蛋白的切割引发两种细胞融合。因此, 如图 6所示, 两种细胞共培养后体积明显增大、绿色荧光强度减弱, 通过Hoechst 33342将细胞核染色后, 能在视野中观察到一个绿色荧光区域内有多个染成蓝色的细胞核; 而转入pAAV-IRES-EGFP的HEK-293T细胞, 由于未表达S蛋白不能识别并结合HEK-293T-ACE2/TMPRSS2细胞表面的ACE2, 与HEK-293T-ACE2/TMPRSS2细胞共培养(非融合对照) 后两种细胞呈现出分散均匀、体积一致、荧光强度均一等特征。在HEK-293T/pAAV-IRES-EGFP-SARS-CoV-2-S与HEK-293T-ACE2/TMPRSS2共培养细胞中加入不同浓度的小分子抑制剂处理后, 所呈现的细胞形态与非融合对照组趋于一致, 表明小分子抑制剂通过抑制TMPRSS2对SARS-CoV-2 S蛋白的切割降低了细胞融合的发生, 并呈现浓度依赖性。

6 TMPRSS2抑制剂假病毒活性评价结果

检测小分子抑制剂对野生型SARS-CoV-2假病毒感染Opti-HEK-293T-ACE2受体细胞的抑制活性。如图 7所示, IMB-4524在7.5 μmol·L^-1浓度时, 对假病毒的抑制率为94.20%。IMB-0028和IMB-0029在50 μmol·L^-1浓度时, 假病毒抑制率高于95%, 10 μmol·L^-1时, 抑制率较低。IMB-0297、IMB-6290和IMB-8010在50 μmol·L^-1浓度时, 存在一定的假病毒抑制活性。

讨论

收起

SARS-CoV-2引发的全球大流行疾病使TMPRSS2抑制剂得到了更多的关注。TMPRSS2广泛分布于人体组织器官中, 是与依赖S蛋白感染人体的病毒感染和前列腺癌等疾病密切相关的丝氨酸蛋白酶。在SARS-CoV-2感染人体的过程中, SARS-CoV-2 S蛋白的S2′位点可被位于靶细胞表面的TMPRSS2所切割, 介导病毒与宿主细胞的膜融合过程^[23]。有研究证明敲除tmprss2后小鼠仍能正常生长, 表明抑制TMPRSS2的活性不会影响机体的正常生理活动^[24], 加之SARS-CoV-2作为RNA病毒, 突变速度快^{[25, 26]}, 因此开发靶向宿主蛋白酶TMPRSS2的药物可有效减轻突变株带来的耐药性^{[12, 27, 28]}。

目前已有的TMPRSS2抑制剂包括camostat mesylate^[29]、nafamostat mesylate^[30]、bromhexine hydrochloride^[31]、α₁-antitrypsin^[32]、HAI-2^[33]、N-0385^[12]、omicsynin B4^[13]等, 其中camostat mesylate、nafamostat mesylate和bromhexine hydrochloride正在进行临床研究, 但目前具有抑制SARS-CoV-2感染活性的TMPRSS2抑制剂仍然缺乏^[34-36]。总之, 筛选并获得更多新骨架的TMPRSS2抑制剂以对抗未来可能出现的冠状病毒疫情仍具有深远的意义。

本研究建立了基于Vero E6/TMPRSS2细胞的TMPRSS2抑制剂筛选模型。通过高通量筛选得到的小分子抑制剂中, 包含2个已知化合物withaferin A (IMB-4524) 和diminazene aceturate (IMB-5155), 文献报道withaferin A具有抗肿瘤^[37]、抗炎^[38]活性, 可与SARS-CoV-2 S蛋白结合发挥抗病毒活性^[39]。Diminazene aceturate是具有抗锥虫活性的化合物, 有研究通过分子对接发现diminazene aceturate可通过与TMPRSS2相互作用发挥抗SARS-CoV-2的作用^[40]。IMB-6290是本课题组此前筛选得到的组织蛋白酶L (cathepsin L, CTSL) 抑制剂, IC₅₀为11.53 ± 0.68 μmol·L^-1[16]。CTSL位于内体中, 可同时识别并切割S蛋白的S1-S2和S2′位点^[41], 介导“内吞途径”, 与TMPRS2介导的“膜融合途径”共同参与病毒感染宿主的过程^[42-44]。本研究发现这个化合物也对TMPRSS2存在抑制活性, 同时抑制CTSL与TMPRSS2的活性可彻底阻断病毒进入宿主细胞, 是可深入研究的双靶点抑制剂。其余4个化合物均为本次筛选得到的具有TMPRSS2抑制活性的新结构。

本研究对这7个小分子抑制剂进行了初步的活性评价。SPR结果表明, 这7个小分子抑制剂均可通过不同的结合模式与TMPRSS2呈中等强度的结合, 并能够在细胞水平上抑制由SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合。同时, IMB-4524、IMB-0028、IMB-0029和IMB-8010对野生型SARS-CoV-2假病毒均有一定的抑制活性, 其中IMB-0028和IMB-0029在低于对TMPRSS2的IC₅₀值下即能表现出对假病毒感染Opti-HEK-293T-ACE2受体细胞大于95%的抑制率, 不排除还具有其他靶点抑制活性的可能性。作为TMPRSS2和CTSL的双靶点抑制剂, IMB-6290对野生型假病毒感染Opti-HEK-293T-ACE2受体细胞抑制作用不明显, 可能与其对CTSL的抑制活性更高有关, 而野生型SARS-CoV-2更依赖于膜融合途径完成对靶细胞的感染^{[42, 45]}, 这就造成了其在野生型假病毒实验中对靶细胞感染的抑制作用不够明显。下一步可在此工作的基础上, 通过结构改造获得毒性更低、活性更优的小分子抑制剂。

总之, 本研究通过建立TMPRSS2细胞筛选模型为靶向TMPRSS2小分子抑制剂发现提供了思路, 尤其是具有双靶点抑制活性的IMB-6290, 但这些小分子抑制剂对依赖TMPRSS2感染人体的病毒和前列腺癌等疾病的治疗活性仍需进一步的深入评价。

作者贡献: 尤宝庆完成整体实验、数据分析和论文撰写; 周雯雯协助实验完成和论文修改; 李妍和张晶负责实验设计与指导和基金支持; 司书毅负责基金支持和论文修改。

利益冲突: 所有作者均声明无利益冲突。

基金

收起

中国医学科学院医学与健康科技创新工程重大协同创新项目(2021-I2M-1-054)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Shen LW, Mao HJ, Wu YL, et al. TMPRSS2: a potential target for treatment of influenza virus and coronavirus infections [J]. Biochimie, 2017, 142: 1-10.

[2]

Jackson CB, Farzan M, Chen B, et al. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2022, 23: 3-20.

[3]

Bestle D, Heindl MR, Limburg H, et al. TMPRSS2 and furin are both essential for proteolytic activation of SARS-CoV-2 in human airway cells [J]. Life Sci Alliance, 2020, 3: e202000786.

[4]

Belouzard S, Chu VC, Whittaker GR. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106: 5871-5876.

[5]

Iwata-Yoshikawa N, Okamura T, Shimizu Y, et al. TMPRSS2 contributes to virus spread and immunopathology in the airways of murine models after coronavirus infection [J]. J Virol, 2019, 93: e01815-18.

[6]

Saunders N, Fernandez I, Planchais C, et al. TMPRSS2 is a functional receptor for human coronavirus HKU1 [J]. Nature, 2023, 624: 207-214.

[7]

Bertram S, Dijkman R, Habjan M, et al. TMPRSS2 activates the human coronavirus 229E for cathepsin-independent host cell entry and is expressed in viral target cells in the respiratory epithelium [J]. J Virol, 2013, 87: 6150-6160.

[8]

Sato K, Hayashi H, Shimotai Y, et al. TMPRSS2 activates hemagglutinin-esterase glycoprotein of influenza C virus [J]. J Virol, 2021, 95: e0129621.

[9]

Shirogane Y, Takeda M, Iwasaki M, et al. Efficient multiplication of human metapneumovirus in Vero cells expressing the transmembrane serine protease TMPRSS2 [J]. J Virol, 2008, 82: 8942-8946.

[10]

Pettersson A, Lis RT, Meisner A, et al. Modification of the association between obesity and lethal prostate cancer by TMPRSS2: ERG [J]. J Natl Cancer Inst, 2013, 105: 1881-1890.

[11]

Ko CJ, Hsu TW, Wu SR, et al. Inhibition of TMPRSS2 by HAI-2 reduces prostate cancer cell invasion and metastasis [J]. Oncogene, 2020, 39: 5950-5963.

[12]

Shapira T, Monreal IA, Dion SP, et al. A TMPRSS2 inhibitor acts as a pan-SARS-CoV-2 prophylactic and therapeutic [J]. Nature, 2022, 605: 340-348.

[13]

Li Y, Wang K, Sun H, et al. Omicsynin B4 potently blocks coronavirus infection by inhibiting host proteases cathepsin L and TMPRSS2 [J]. Antiviral Res, 2023, 214: 105606.

[14]

Yang R, Liu L, Jiang D, et al. Identification of potential TMPRSS2 inhibitors for COVID-19 treatment in Chinese medicine by computational approaches and surface plasmon resonance technology [J]. J Chem Inf Model, 2023, 63: 3005-3017.

[15]

Olaru A, Bala C, Jaffrezic-Renault N, et al. Surface plasmon resonance (SPR) biosensors in pharmaceutical analysis [J]. Crit Rev Anal Chem, 2015, 45: 97-105.

[16]

Ye B, Gao SH, Song LT, et al. Screening methods of SARS-CoV-2 main protease inhibitors and current applications [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2023, 58: 1528-1539.

[17]

Zhou WW, You BQ, Zheng YF, et al. Anti-SARS-CoV-2 activity of small molecule inhibitors of cathepsin L [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2024, 59: 600-607.

[18]

Hu LD, Liu CF, Li P, et al. Recent advances in drug screening methods of SARS-CoV-2 spike protein [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2024, 59: 298-312.

[19]

Yu S, Zheng X, Zhou B, et al. SARS-CoV-2 spike engagement of ACE2 primes S2' site cleavage and fusion initiation [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2022, 119: e2111199119.

[20]

Chan SW. Fusion assays for screening of fusion inhibitors targeting SARS-CoV-2 entry and syncytia formation [J]. Front Pharmacol, 2022, 13: 1007527.

[21]

Shrimp JH, Kales SC, Sanderson PE, et al. An enzymatic TMPRSS2 assay for assessment of clinical candidates and discovery of inhibitors as potential treatment of COVID-19 [J]. ACS Pharmacol Transl Sci, 2020, 3: 997-1007.

[22]

Yan G, Li D, Lin Y, et al. Development of a simple and miniaturized sandwich-like fluorescence polarization assay for rapid screening of SARS-CoV-2 main protease inhibitors [J]. Cell Biosci, 2021, 11: 199.

[23]

Abbasi AZ, Kiyani DA, Hamid SM, et al. Spiking dependence of SARS-CoV-2 pathogenicity on TMPRSS2 [J]. J Med Virol, 2021, 93: 4205-4218.

[24]

Kim TS, Heinlein C, Hackman RC, et al. Phenotypic analysis of mice lacking the Tmprss2-encoded protease [J]. Mol Cell Biol, 2006, 26: 965-975.

[25]

Sanjuan R, Domingo-Calap P. Mechanisms of viral mutation [J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73: 4433-4448.

[26]

Torii S, Kim KS, Koseki J, et al. Increased flexibility of the SARS-CoV-2 RNA-binding site causes resistance to remdesivir [J]. PLoS Pathog, 2023, 19: e1011231.

[27]

Wu A, Shi K, Wang J, et al. Targeting SARS-CoV-2 entry processes: the promising potential and future of host-targeted small-molecule inhibitors [J]. Eur J Med Chem, 2024, 263: 115923.

[28]

De Clercq E, Li G. Approved antiviral drugs over the past 50 years [J]. Clin Microbiol Rev, 2016, 29: 695-747.

[29]

Sakr Y, Bensasi H, Taha A, et al. Camostat mesylate therapy in critically ill patients with COVID-19 pneumonia [J]. Intensive Care Med, 2021, 47: 707-709.

[30]

Li K, Meyerholz DK, Bartlett JA, et al. The TMPRSS2 inhibitor nafamostat reduces SARS-CoV-2 pulmonary infection in mouse models of COVID-19 [J]. mBio, 2021, 12: e0097021.

[31]

Maggio R, Corsini GU. Repurposing the mucolytic cough suppressant and TMPRSS2 protease inhibitor bromhexine for the prevention and management of SARS-CoV-2 infection [J]. Pharmacol Res, 2020, 157: 104837.

[32]

Wettstein L, Weil T, Conzelmann C, et al. Alpha-1 antitrypsin inhibits TMPRSS2 protease activity and SARS-CoV-2 infection [J]. Nat Commun, 2021, 12: 1726.

[33]

Tomita Y, Matsuyama S, Fukuhara H, et al. The physiological TMPRSS2 inhibitor HAI-2 alleviates SARS-CoV-2 infection [J]. J Virol, 2021, 95: e00434-21.

[34]

Kinoshita T, Shinoda M, Nishizaki Y, et al. A multicenter, double-blind, randomized, parallel-group, placebo-controlled study to evaluate the efficacy and safety of camostat mesilate in patients with COVID-19 (CANDLE study) [J]. BMC Med, 2022, 20: 342.

[35]

Quinn TM, Gaughan EE, Bruce A, et al. Randomised controlled trial of intravenous nafamostat mesylate in COVID pneumonitis: phase 1b/2a experimental study to investigate safety, pharmacokinetics and pharmacodynamics [J]. EBioMedicine, 2022, 76: 103856.

[36]

Tolouian R, Mulla ZD, Jamaati H, et al. Effect of bromhexine in hospitalized patients with COVID-19 [J]. J Investig Med, 2023, 71: 691-699.

[37]

Kakar SS, Parte S, Carter K, et al. Withaferin A (WFA) inhibits tumor growth and metastasis by targeting ovarian cancer stem cells [J]. Oncotarget, 2017, 8: 74494-74505.

[38]

Liang Y, Jiang Q, Zou H, et al. Withaferin A: a potential selective glucocorticoid receptor modulator with anti-inflammatory effect [J]. Food Chem Toxicol, 2023, 179: 113949.

[39]

Straughn AR, Kakar SS. Withaferin A: a potential therapeutic agent against COVID-19 infection [J]. J Ovarian Res, 2020, 13: 79.

[40]

Santos ES, Silva PC, Sousa PSA, et al. Antiviral potential of diminazene aceturate against SARS-CoV-2 proteases using computational and in vitro approaches [J]. Chem Biol Interact, 2022, 367: 110161.

[41]

Zabiegala A, Kim Y, Chang KO. Roles of host proteases in the entry of SARS-CoV-2 [J]. Anim Dis, 2023, 3: 12.

[42]

Padmanabhan P, Desikan R, Dixit NM. Targeting TMPRSS2 and cathepsin B/L together may be synergistic against SARS-CoV-2 infection [J]. PLoS Comput Biol, 2020, 16: e1008461.

[43]

Liu T, Luo S, Libby P, et al. Cathepsin L-selective inhibitors: a potentially promising treatment for COVID-19 patients [J]. Pharmacol Ther, 2020, 213: 107587.

[44]

Yang H, Zhou JN, Zhang XM, et al. Nanoengineered red blood cells loaded with TMPRSS2 and cathepsin L inhibitors block SARS-CoV-2 pseudovirus entry into lung ACE2⁺ cells [J]. Adv Mater, 2024, 36: e2310306.

[45]

Wang H, Yang Q, Liu X, et al. Structure-based discovery of dual pathway inhibitors for SARS-CoV-2 entry [J]. Nat Commun, 2023, 14: 7574.

2024年第59卷第12期

PDF下载

178

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0518

接收时间：2024-05-30
首发时间：2025-11-24
出版时间：2024-12-12

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2024-05-30
修回日期：2024-09-29

基金

中国医学科学院医学与健康科技创新工程重大协同创新项目(2021-I2M-1-054)

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院, 医药生物技术研究所, 北京 100050

通讯作者:

^*张晶, Tel: 86-10-63180623, E-mail: jingjing-506@hotmail.com;

司书毅, Tel: 86-10-63180604, E-mail: sisyimb@hotmail.com

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2024-0518

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT