药学学报

Group	Diet	Drug	Dose/mg·kg^-1
CTRL-vehicle	ND	/	/
CTRL-LCA-L		LCA	5
T2DM-vehicle	HFD	/	/
T2DM-LCA-L		LCA	5
T2DM-LCA-H			10
T2DM-MET		MET	200

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Gene	Sequences (5'-3')
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甘草查尔酮A缓解2型糖尿病所致异常糖异生及内质网应激分子机制研究

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许文镨 ¹^,^# , 张佳瑜 ¹^,^# , 汪逗逗 ¹ , 丁文文 ¹ , 陈姿伊 ¹ , 肖瑶 ²^,^* , 刘颖 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(12): 3291-3303

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(12): 3291-3303

甘草查尔酮A缓解2型糖尿病所致异常糖异生及内质网应激分子机制研究

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许文镨¹^,^#, 张佳瑜¹^,^#, 汪逗逗¹, 丁文文¹, 陈姿伊¹, 肖瑶²^,^*, 刘颖¹^,^*

作者信息

1.北京中医药大学生命科学学院, 北京 102488

2.北京中医药大学中药学院, 北京 102488

通讯作者:

^*肖瑶, Tel: 86-10-53912136, E-mail: xiaoyao9510@126.com;

刘颖, Tel: 86-10-53912163, E-mail: liuyliwd@bucm.edu.cn

Molecular mechanism underlying the effects of licochalcone A on abnormal gluconeogenesis and endoplasmic reticulum stress induced by type 2 diabetes mellitus

Wen-pu XU¹, Jia-yu ZHANG¹, Dou-dou WANG¹, Wen-wen DING¹, Zi-yi CHEN¹, Yao XIAO²^,^*, Ying LIU¹^,^*

Affiliations

1. School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

2. School of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

出版时间: 2024-12-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0809

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摘要

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本文旨在探讨甘草查尔酮A (licochalcone A, LCA) 缓解2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM) 引起的异常糖异生及内质网应激的分子机制。体内研究采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠, 高脂高糖饲料喂养结合腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 构建T2DM动物模型。腹腔注射LCA (5、10 mg·kg^-1) 治疗, 以二甲双胍(metformin, MET) (200 mg·kg^-1) 为阳性对照, 间隔3天给药, 持续3周, 动物实验方案经北京中医药大学实验动物伦理委员会审核并批准(批准号: BUCM-4-2021061701-2060)。体外实验以人肝癌细胞HepG2为实验细胞系, 采用棕榈酸钠(sodium palmitate, SP) 诱导胰岛素抵抗细胞模型, 采用衣霉素(tunicamycin, TM) 诱导内质网应激细胞模型。采用实时荧光定量PCR法(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 和蛋白质印迹法(Western blot, WB) 检测糖异生和内质网应激相关靶点的转录和蛋白水平; 利用分子对接和分子动力学模拟对LCA和关键靶点的相互作用进行验证。结果表明, LCA可通过抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK) 和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6P) 的转录和酶活, 抑制丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PC) 的酶活, 提高6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2, 6-二磷酸酶3 (6-phosphofructokinase-2/fructose-2, 6-bisphosphatase 3, PFKFB3) 的转录和蛋白水平, 抑制糖异生。同时, LCA可通过下调真核翻译起始因子2α (eukaryotic initiation factor 2 subunit α, eIF2α)、肌醇依赖酶1α (inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)、X-框结合蛋白1 (X-box binding protein 1, XBP1)、c-Jun氨基末端激酶1 (c-Jun N-terminal kinase 1, JNK1) 和活化转录因子6α (activating transcription factor 6α, ATF6α) 的转录水平, 降低葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78) 的转录和蛋白水平, 抑制蛋白质激酶RNA样端激活因子(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK) 的转录和磷酸化, 抑制内质网应激。综上, LCA可缓解T2DM所致异常糖异生和内质网应激, 从而改善代谢紊乱。

关键词

甘草查尔酮A / 2型糖尿病 / 糖异生 / 内质网应激 / 代谢紊乱

Abstract

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The aim of this study is to investigate the molecular mechanism of licochalcone A (LCA) in alleviating abnormal gluconeogenesis and endoplasmic reticulum (ER) stress caused by type 2 diabetes mellitus (T2DM). In the in vivo study, 8-week-old male C57BL/6J mice were fed with a high-fat and high-sugar diet and injected intraperitoneally with streptozotocin (STZ) to establish a T2DM model. LCA (5 and 10 mg·kg^-1) was administered at an interval of 3 days for 3 weeks with metformin (MET, 200 mg·kg^-1) as a positive control drug. The animal experiment protocol was reviewed and approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Beijing University of Chinese Medicine (approval number: BUCM-4-2021061701-2060). Human hepatoma cell line HepG2 was used as the experimental cell line for in vitro experiments. Sodium palmitate (SP) was used to induce the insulin resistance cell model and tunicamycin (TM) was applied to establish the ER stress cell model. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blot (WB) were used to detect the mRNA and protein levels of gluconeogenesis and ER stress-related targets, respectively. Molecular docking and dynamics simulations were used to verify the interaction between LCA and key targets. The results showed that LCA inhibits gluconeogenesis by reducing phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and glucose-6-phosphatase (G6P) and increasing 6-phosphofructokinase-2/fructose-2, 6-bisphosphatase 3 (PFKFB3) at both the mRNA and protein levels, as well as suppressing the activity of pyruvate carboxylase (PC). Additionally, LCA alleviates ER stress by downregulating the transcription of eukaryotic initiation factor 2 subunit α (eIF2α), inositol-requiring enzyme 1α (IRE1α), X-box binding protein 1 (XBP1), c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1), and activating transcription factor 6α (ATF6α), inhibiting the transcription and protein expression of glucose-regulated protein 78 (GRP78), and suppressing the phosphorylation of protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). In conclusion, LCA alleviates abnormal gluconeogenesis and ER stress, thereby ameliorating the abnormal metabolism induced by T2DM.

Key words

licochalcone A / type 2 diabetes mellitus / gluconeogenesis / endoplasmic reticulum stress / metabolic disorder

引用本文

许文镨, 张佳瑜, 汪逗逗, 丁文文, 陈姿伊, 肖瑶, 刘颖. 甘草查尔酮A缓解2型糖尿病所致异常糖异生及内质网应激分子机制研究. 药学学报, 2024 , 59 (12) : 3291 -3303 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0809

Wen-pu XU, Jia-yu ZHANG, Dou-dou WANG, Wen-wen DING, Zi-yi CHEN, Yao XIAO, Ying LIU. Molecular mechanism underlying the effects of licochalcone A on abnormal gluconeogenesis and endoplasmic reticulum stress induced by type 2 diabetes mellitus[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (12) : 3291 -3303 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0809

正文

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糖尿病是一种在世界范围内对人类健康造成巨大威胁的疾病, 其中, 2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM) 发病人数约占全球糖尿病患病总人数的90%^[1]。T2DM的典型特征是由胰岛素抵抗(insulin resistance, IR) 引起的高血糖, 会产生葡萄糖摄取紊乱、代谢紊乱等一系列不良反应^[2]。我国的T2DM患病率呈逐年上升趋势, 2002年成人患病率为2.6%^[3], 至2023年已达到11.9%, 超1.25亿人^[4], 严重威胁公共健康。

甘草性甘, 味平, 归心、肺、脾、胃经, 可用于改善脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短等症状, 同时可调和诸药, 缓解其他药物的烈性^[5]。甘草中含有种类丰富、结构多样的黄酮类化合物, 二氢黄酮类和查尔酮类是最具代表性的类型, 如甘草苷(liquiritin)、甘草素(liquiritigenin)、异甘草苷(isoliquiritin)、异甘草素(isoliquiritigenin) 和甘草查尔酮A (licochalcone A, LCA) 等。本课题组近年来一直致力于甘草黄酮类化合物的生物活性研究, 尤其关注其抗T2DM的效果^[6-9]。本课题组的前期研究发现, LCA可显著降低高糖高脂饮食诱导的T2DM小鼠的空腹血糖水平, 改善其葡萄糖耐量, 并通过激活5'-磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate activated protein kinase, AMPK) 和抑制哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白复合体1 (mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1), 提高胰岛素敏感性, 表现出改善T2DM糖脂代谢紊乱的良好潜力。

糖异生是一种由非糖化合物转变为葡萄糖或糖原的过程, 是机体在饥饿状态下血糖的主要来源之一, 主要在肝脏进行, 是调节葡萄糖代谢平衡的关键^[10]。肝脏糖异生占空腹状态下产生葡萄糖总量的一半, 是T2DM患者血糖升高的主要原因^[11]。临床常用药二甲双胍(metformin, MET) 的作用机制就包括降低患者糖异生水平^[12]。内质网(endoplasmic reticulum, ER) 是蛋白质折叠加工与脂类合成与分泌的主要场所, 其稳态平衡与细胞功能的维持密不可分^[13]。长期高血糖状态会引起细胞内质网扩张, 导致内质网应激, 激活未折叠蛋白响应(unfolded protein response, UPR), 是引起胰岛β细胞损伤、代谢稳态破坏的重要原因^[14]。因此, 本文拟在前期研究的基础上, 以糖异生和内质网应激为出发点, 补充完善LCA改善T2DM异常代谢的分子机制, 为其应用提供理论依据。

材料与方法

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实验动物

SPF级C57BL/6J小鼠(8周龄, 雄性), 斯贝福(北京) 生物技术有限公司。实验动物生产许可证号: SCXK (京) 2019-0010; 实验动物使用许可证号: SYXK (京) 2020-0033; 实验动物质量合格证编号: No.110324211104663385。

实验细胞系

人肝癌细胞HepG2, 北京协和医学院细胞资源中心。

试剂

LCA (纯度: 99.92%, 批号: 151015, 成都曼思特生物科技有限公司); 4-苯丁酸(4-phenyl butyrate acid, 4-PBA, 纯度≥ 99%, 批号: P132032, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 链脲佐菌素(streptozotocin, STZ, 色谱纯, 批号: BN30130, 北京百瑞极生物科技有限公司); MET (纯度: 98%, 批号: S30880)、衣霉素(tunicamycin, TM, 纯度≥ 98%, 批号: S17119) 购自上海源叶生物科技有限公司; DMEM高糖培养基、青霉素-链霉素双抗和胰酶为美国Gibco产品; 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 为美国Corning产品; 一站式DNA/RNA/蛋白提取试剂盒购自中国生工生物工程(上海) 股份有限公司; NovoScript^® Plus All-in-one 1st Strand cDNA Sythesis SuperMix (gDNA Purge) 试剂盒和NovoStrat^® SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒购自中国近岸蛋白科技有限公司; 葡萄糖含量(葡萄糖氧化酶法) 检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所; 2-NBDG葡萄糖摄取检测试剂盒为美国APExBIO公司产品; 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PC)、果糖1, 6-二磷酸酶(fructose-1, 6-bisphosphatase, FBP) 和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6P) 活性检测试剂盒以及BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒和PVDF膜购自中国北京索莱宝科技有限公司; 6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2, 6-二磷酸酶3 (6-phosphofructokinase-2/fructose-2, 6-bisphosphatase 3, PFKFB3)、葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78) 和C/EPB同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP) 酶联免疫试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司; 超敏ECL化学发光试剂盒购自北京永泰兴成商贸有限公司; β-actin、蛋白质激酶RNA样端激活因子(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK) 和phospho-PERK (Thr980) 对应一抗购自美国Cell Signalling Technology公司; GRP78/BIP对应一抗购自美国Proteintech公司。

仪器

酶标仪(EPOCH, 美国Biotek Epoch公司); RT-qPCR仪(QuantStudio^TM 6 Flex, 美国Applied Biosystems公司); 低温高速离心机(Centrifuge 5424 R, 德国Eppendorf公司); CO₂恒温培养箱(MCO-18AIC, 日本SANYO公司); Mini-PROREAN^® Tetra电泳槽(1658004)、PowerPac基础电泳仪(1645050)、多功能分子成像系统(ChemiDocmp), 美国Bio-Rad公司。

T2DM小鼠模型构建、分组给药、取材

经北京中医药大学动物伦理委员会批准(批准号: BUCM-4-2021061701-2060), 于大学屏障环境动物室(22 ± 2 ℃, 60% ± 10%相对湿度, 12 h/12 h光暗循环) 饲养实验动物并开展相关研究。适应喂养1周后, 将小鼠随机分为两组, 分别采取高脂高糖饮食(high-fat-high-sugar diet, HFD) 和普通维持饲料(normal diet, ND) 喂养, 持续3周。禁食12 h, HFD组小鼠腹腔注射STZ溶液(30 mg·kg^-1), ND组小鼠则注射等体积溶媒(柠檬酸盐缓冲液, pH = 4.5), 持续5天。检测空腹7 h血糖水平, 连续3次≥ 11.1 mmol·L^-1, 即为造模成功。如表 1所示, 将造模成功的HFD组小鼠随机分为模型组(T2DM-vehicle)、LCA治疗组(T2DM-LCA-L和T2DM-LCA-H) 和阳性药组(T2DM-MET)^[6-9]; 将ND组小鼠随机分为空白组(CTRL-vehicle) 和空白给药组(CTRL-LCA-L)。给药结束后, 摘眼球处死, 分离肝脏, 于-80 ℃保存备用。

细胞培养及分组给药

采用DMEM培养基+10% FBS+1%青霉素-链霉素双抗培养HepG2细胞(37 ℃, 5% CO₂)。将状态良好的细胞接种于6孔板(3.5×10⁵个/孔), 当细胞融合率达到80%进行分组给药, 设置LCA浓度梯度为0、5、10、20、40 μmol·L^-1; 以MET (10 mmol·L^-1) 作为检测糖异生相关指标的阳性药对照^{[7, 15]}, 以4-PBA (1 mmol·L^-1) 作为检测内质网应激相关指标的阳性药对照^{[16, 17]}。

胰岛素抵抗模型构建

采用棕榈酸钠(sodium palmitate, SP) 诱导IR模型, 采用噻唑蓝(methylthiazoletetrazolium, MTT) 比色法进行SP剂量范围筛选, 设置SP浓度梯度为0、0.125、0.25、0.5、1 mmol·L^-1, 每组6个平行。

细胞葡萄糖消耗测定

采用0.25 mmol·L^-1 SP溶液孵育HepG2细胞24 h, 以构建IR细胞模型; 给予LCA (0、5、10、20、40 μmol·L^-1) 和MET (10 mmol·L^-1) 处理24 h, 加入终浓度为1 μmol·L^-1胰岛素溶液, 孵育0.5 h, 每组3个平行; 取上清, 采用葡萄糖含量检测试剂盒检测各组培养基中的葡萄糖水平, 以反映细胞的葡萄糖消耗情况。

细胞葡萄糖摄取测定

采用上述相同方法构建IR细胞模型; 其后改用无糖DMEM培养基给予LCA (0、5、10、20、40 μmol·L^-1) 和MET (10 mmol·L^-1) 处理18 h, 加入终浓度为1 μmol·L^-1胰岛素溶液, 孵育0.5 h, 每组3个平行; 弃上清, 加入适量2-NBDG, 37 ℃避光孵育20 min, 采用荧光酶标仪检测各组细胞样品在Ex/Em = 485/535 nm的吸收值, 以反映细胞的葡萄糖摄取能力。

细胞葡萄糖输出测定

采用上述相同方法构建IR细胞模型; 其后改用无血清无糖DMEM培养基给予LCA (0、5、10、20、40 μmol·L^-1) 和MET (10 mmol·L^-1) 处理18 h, 加入终浓度为100 mmol·L^-1胰高血糖素和10 mmol·L^-1丙酮酸钠溶液, 孵育4 h, 每组3个平行; 取上清, 采用葡萄糖含量检测试剂盒检测各组培养基中的葡萄糖水平, 以反映细胞的葡萄糖输出能力。

细胞内质网应激模型构建

将HepG2细胞接种于6孔板(密度: 3.5×10⁵个/孔), 采用含10% FBS的高糖DMEM培养, 当细胞融合率达到80%时, 改用含2% FBS的高糖DMEM孵育, 设置空白组、模型组、LCA给药组(5、10、20、40 μmol·L^-1) 以及阳性药4-PBA组(1 mmol·L^-1), 孵育24 h后, 加入终浓度为2 μg·mL^-1 TM, 孵育4 h, 诱导内质网应激^[18]。

转录水平检测

收集各组细胞样品, 提取样品总RNA, 逆转录为cDNA。以β-actin为内参基因, 进行RT-qPCR分析, 检测糖异生相关基因G6P、PC、PEPCK、PFKFB3、FBP和内质网应激相关基因GRP78、CHOP、c-Jun氨基末端激酶1 (c-Jun N-terminal kinase 1, JNK1)、X-框结合蛋白1 (X-box binding protein 1, XBP1)、活化转录因子6α (activating transcription factor 6α, ATF6α)、PERK、真核翻译起始因子2α (eukaryotic initiation factor 2 subunit α, eIF2α)、肌醇依赖酶1α (inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α) 的转录水平, 引物序列见表 2, 反应程序: 95 ℃ 1 min, 95 ℃ 20 s, 60 ℃ 1 min (40个循环)。

ELISA检测

采用ELISA试剂盒测定小鼠肝脏和HepG2细胞样品中PFKFB3、GRP78和CHOP的蛋白含量。

酶活检测

采用酶活性检测试剂盒检测小鼠肝脏和HepG2细胞样品中PC、PEPCK、FBP和G6P的活性。

蛋白质印迹法(Western blot, WB) 检测

收集各组细胞样品, 提取细胞蛋白, BCA法测定总蛋白浓度。各孔取20 μg蛋白上样, 通过SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离, 再将蛋白电转至PVDF膜。用5%脱脂奶粉/5%牛血清白蛋白溶液封闭, 与相应一抗4 ℃下孵育过夜; 次日, 将蛋白带与二抗孵育, 彻底洗涤后按ECL试剂盒说明进行曝光显影。以内参蛋白β-actin为参照, 检测GRP78和PERK的蛋白水平以及PERK的磷酸化水平, 用Image J软件分析条带灰度。

分子对接

在PubChem数据库下载LCA (PubChem CID: 5318998) 的2D结构, 使用AVOGADR 1.2.0对其进行3D建模, 并在MMFF94力场下进行能量最小化; 在RCSB数据库下载PEPCK、G6P、GRP78和PERK的3D结构; 采用AutoDock Vina 1.1.2软件进行分子对接, 通过分子与蛋白质之间的相互作用分析, 鉴定关键蛋白与LCA之间的结合能力。

分子动力学模拟

使用分子动力学软件gromacs 2021.6进行模拟, 利用Multiwfn计算复合物小分子的RESP2电荷, 在GAFF力场生成拓扑文件, 在AMBER14SB_PARMBSC1力场生成相应参数化文件; 以复合物为中心, 添加SPC/E水模型分子, 生成立方体水盒子, 向复合物水盒子里添加相应离子保持模拟体系的电中性; 使用共轭梯度法进行能量最小化, 使体系充分稳定; 采用正则系综(NVT), Berendsen热浴法控制温度为298.15 K, 模拟50 000步, 步长2 fs; 采用等温等压系综(NPT), Parrinello-Rahman控压, 1个大气压, 模拟50 000步, 步长2 fs; 进行mdrun, 步长2 fs, 模拟25 000 000步, 进行总计50 ns的分子动力学模拟。

统计学分析

采用IBM SPSS statistic 26.0统计分析软件, 进行单因素方差分析(ANOVA), 以平均数±标准差(x ± s) 表示数据。组间比较P < 0.05为差异具有统计学意义。

结果

收起

1 LCA提高HepG2细胞糖摄取水平并抑制其糖异生水平

不同浓度LCA对HepG2细胞活力的影响如图 1A所示: 80 μmol·L^-1及以上浓度的LCA对HepG2细胞具有细胞毒性。结合文献^[19]报道, 后续细胞实验设置LCA梯度浓度为5、10、20、40 μmol·L^-1。SP工作浓度筛选结果如图 1B所示: 0.5 mmol·L^-1及以上浓度的SP对HepG2细胞具有细胞毒性。结合文献^{[20, 21]}报道, 最终选取0.25 mmol·L^-1为SP造模剂量。

胰岛素刺激的细胞葡萄糖消耗检测结果如图 1C所示: 相较于正常细胞, IR模型组细胞培养基上清中葡萄糖水平显著升高, 表明IR导致HepG2细胞的糖消耗减少。LCA和MET处理后正常组及IR模型组细胞培养基上清中葡萄糖水平均显著降低, 表明LCA和MET可提高细胞的葡萄糖消耗能力。

胰岛素刺激的细胞葡萄糖摄取检测结果如图 1D所示: 相较于正常细胞, IR模型组细胞对2-NBDG的吸收值显著下降, 表明IR导致HepG2细胞的糖摄取能力下降。LCA和MET处理后正常组及模型组细胞对2-NBDG的吸收值均显著升高, 表明LCA和MET可提高细胞的葡萄糖摄取能力, 改善其胰岛素敏感性。

细胞葡萄糖输出检测结果如图 1E所示: 相较于正常细胞, IR模型组细胞培养基上清中葡萄糖水平显著升高, 表明IR导致细胞的糖异生水平升高, 有更多葡萄糖释放入培养基。LCA和MET处理后正常组及模型组细胞培养基上清中葡萄糖水平均显著降低, 表明LCA和MET可降低细胞的葡萄糖输出水平, 缓解糖异生。

2 LCA可显著抑制T2DM小鼠肝脏和HepG2细胞糖异生

PEPCK可催化草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸, G6P可催化6-磷酸葡萄糖水解为葡萄糖, 此两步反应为糖异生途径的关键限速步骤^{[22, 23]}。本课题组前期研究发现, LCA治疗可显著降低T2DM小鼠肝脏PEPCK和G6P的酶活^[7]。本文进一步开展了PEPCK和G6P的体外转录水平和酶活检测, 结果分别如图 2A、B所示: 与空白对照组相比, LCA处理显著下调HepG2细胞内PEPCK的转录水平, 并剂量依赖性抑制PEPCK酶活性; 同时, LCA可显著抑制HepG2细胞内G6P的转录水平和酶活性; 阳性药MET也表现出对二者的抑制效果。此结果与前期体内研究相吻合。

PC是一种生物素依赖性多功能酶, 位于丙酮酸代谢途径的分支点上, 可催化丙酮酸转化为草酰乙酸, 为糖异生途径的限速步骤^{[24, 25]}。如图 2C所示: 与空白组相比, 模型组小鼠肝脏PC的酶活显著升高, 而LCA和MET给药治疗均可显著降低T2DM小鼠肝脏中PC的活性。体外检测结果如图 2D所示: 与空白组相比, 各浓度LCA对HepG2细胞内PC的转录水平均不产生影响, 但可显著抑制PC酶活; 而MET干预HepG2细胞后细胞内PC的转录水平及酶活性均无显著变化。此结果提示LCA可抑制PC活性, 但其调控并不通过转录来实现。

FBP存在于细胞质中, 可将果糖-l, 6-二磷酸转变成果糖-6-磷酸, 是糖异生途径的关键酶^[26]。PFKFB3可促进2, 6-二磷酸果糖(fructose 2, 6 diphosphate, 2, 6-FD) 的生成, 2, 6-FD为FBP的变构抑制剂^[27], 可抑制FBP的酶活性^[28]。本文首先检测了PFKFB3的转录和蛋白水平, 发现低、高剂量LCA治疗和阳性药MET治疗均可显著提高T2DM小鼠肝脏中PFKFB3的蛋白含量(图 2E); 同时, 与空白组相比, LCA可提高HepG2细胞中PFKFB3的转录和蛋白水平(图 2F), 体内外结果相吻合。进一步检测了FBP的转录水平和酶活, 体内检测结果如图 2G所示: 与空白组相比, 模型组小鼠肝脏FBP的酶活性显著升高, 而LCA低、高剂量组虽在一定程度上降低了小鼠肝脏中FBP的酶活性, 但无显著性差异; 体外检测结果如图 2H所示: 不同浓度LCA可显著抑制HepG2细胞内FBP的转录水平, 但对其酶活不产生影响。综合上述PFKFB3和FBP的检测结果, LCA对PFKFB3转录及蛋白水平具有上调作用, 但未能引起FBP酶活的显著变化。

3 LCA对HepG2细胞内质网应激的调控作用

GRP78可促进蛋白质的折叠和组装, 控制蛋白质的质量, 并通过Ca²⁺与ER结合来调节ER应激信号^[29]。与空白组相比, 模型组小鼠肝脏GRP78的蛋白含量显著升高, 而LCA和MET给药治疗均可显著降低T2DM小鼠肝脏中GRP78的蛋白水平(图 3A); 体外转录水平检测结果显示: TM处理细胞4 h后, 内质网应激模型组细胞中GRP78的转录水平显著上升, 5~40 μmol·L^-1 LCA预处理可显著抑制其转录; 体外ELISA蛋白水平检测结果显示: 内质网应激模型组细胞中GRP78的蛋白水平显著上升, 10~40 μmol·L^-1 LCA预处理可显著降低其蛋白水平(图 3B); WB检测结果(图 3C) 与ELISA检测结果一致。

CHOP在内质网应激诱导的细胞凋亡中发挥着重要的作用, 其上调会引发细胞凋亡^[30]。如图 3D所示, 各组别小鼠肝脏中的CHOP含量无显著差异, 表明LCA和MET治疗对CHOP水平不产生显著影响; 体外检测结果如图 3E所示: 内质网应激模型组细胞中CHOP的转录与蛋白水平显著升高, 各剂量组LCA和MET对CHOP的转录和蛋白水平均无显著影响。

PERK是一种内质网应激传感器, 一旦被激活, 可对错误折叠蛋白质的积累做出反应^[31]; eIF2α可导致整体mRNA翻译减弱, 同时选择性增强转录因子ATF4的翻译^[32]; IRE1α是一个关键的内质网应激传感器和信号传感器^[33]; XBP1可促进内质网相关蛋白降解和磷脂生物合成通路成分的转录^[34]; JNK1是ER胞质信号传导介质^[35]; ATF6α可以在细胞核内与内质网应激响应元件(ER stress response element, ERSE) 结合, 启动下游负责蛋白质折叠或降解的基因的转录^[36]。上述基因的转录水平检测结果如图 3F所示: 与空白组相比, 内质网应激模型组细胞中的PERK、eIF2α、IRE1α、XBP1、JNK1、ATF6α的转录水平均显著上升, LCA可显著下调这些基因的转录水平。

本研究进一步对PERK的蛋白水平和磷酸化水平进行WB检测, 结果如图 3G所示: 在内质网应激状态下, HepG2细胞中PERK的蛋白水平显著上升, 而LCA给药后可显著降低其蛋白水平, 在20 μmol·L^-1时达到最大抑制效果; 同时, LCA可剂量依赖性抑制PERK的磷酸化, 进而抑制其活性。

以上结果表明, LCA可下调内质网应激关键基因的转录水平, 降低GRP78的蛋白水平, 抑制PERK的活性, 从而缓解细胞内质网应激压力, 恢复细胞内质网稳态。

4 LCA与糖异生关键调控靶点的分子对接及分子动力学模拟

根据上述糖异生相关靶点检测结果, 选择PEPCK和G6P 2个关键蛋白, 通过分子对接进一步验证LCA与其相互作用。结果显示: LCA与PEPCK和G6P蛋白的结合亲和能分别为-7.0和-7.2 kcal·mol^-1, 均低于-5 kcal·mol^-1, 提示LCA与PEPCK和G6P蛋白均具备较为理想的结合效果。

PEPCK-LCA复合物的蛋白小分子3D、2D相互作用结果分别如图 4A、B所示, 在复合物PEPCK-LCA中, LCA结合在PEPCK蛋白上由ALA506、LEU508、LYS507、ILE544、LYS510、PRO509、SER449、GLU446、ALA447、ILE511和TRP450围绕而成的口袋中, 其中与ALA447、ILE511和TRP450形成氢键作用, 与ALA506、LEU508、LYS507、ILE544、LYS510、PRO509、SER449和GLU446形成疏水作用。LCA与PEPCK的分子动力学模拟如图 4C所示: 在PEPCK-LCA复合物中, PEPCK相对于LCA的位置在25 ns后趋于稳定, 体系的RMSD值全程趋于稳定, PEPCK-LCA复合物模拟可达到平衡。PEPCK蛋白467~471号氨基酸区域柔性大, PEPCK-LCA复合物虽有波动, 但总体不大。在模拟过程中, PEPCK-LCA在模拟的大部分时间保留着2个以上的氢键。

G6P-LCA复合物的蛋白小分子3D、2D相互作用图分别如图 4D、E所示, 在复合物G6P-LCA中, 小分子LCA结合在G6P蛋白上由THR145、PHE253、PRO172、GLY174、ARG175、LEU183、ARG182、PRO144、GLU148、SER179氨基酸围绕而成的口袋中, 其中与GLU148、SER179形成氢键作用, 与THR145、PHE253、PRO172、GLY174、ARG175、LEU183、ARG182、PRO144形成疏水作用。LCA与G6P的分子动力学模拟如图 4F所示: 在LCA-G6P复合物中, G6P相对于LCA的位置在5 ns后趋于稳定, 且在模拟进行到30 ns后, 体系RMSD值相对平稳, G6P-LCA复合物模拟可达到平衡。G6P蛋白在末端loop区506~513号氨基酸附近波动大、柔性高, G6P-LCA复合物虽有波动, 但总体不大。G6P-LCA在模拟的大部分时间, 保留着1个以上的氢键。

5 LCA与内质网应激关键调控靶点的分子对接及分子动力学模拟

根据上述内质网应激相关靶点检测结果, 选择关键蛋白GRP78和PERK, 通过分子对接进一步验证LCA与其相互作用, 基于AutoDock Vina对接获得LCA-蛋白结合亲和力评估, LCA与GRP78和PERK蛋白的结合亲和能分别为-6.6和-8.4 kcal·mol^-1, 提示LCA与GRP78和PERK均具备较为理想的结合效果。

GRP78-LCA复合物的蛋白小分子3D、2D相互作用图分别见图 5A、B, 在复合物GRP78-LCA中, 小分子LCA结合在GRP78蛋白上由LEU474、ASN472、HIS473、GLU463、THR251、ARG101、PHE176、ASP471、TYR175、HIS252、GLN180、ASN177氨基酸围绕而成的口袋中, 其中与ASP471、TYR175、HIS252、GLN180、ASN177形成氢键作用, 与LEU474、ASN472、HIS473、GLU463、THR251、ARG101、PHE176形成疏水作用。LCA与GRP78的分子动力学模拟如图 5C所示: 在GRP78-LCA复合物中, 复合物体系在20 ns后趋于稳定, 观察LCA相对于蛋白GRP78的位置也可发现, 二者结合状态在15 ns后趋于稳定, 复合物模拟可达到平衡。GRP78蛋白两端区域24~25号、569~629号氨基酸附近柔性大。Rg考察主要选择平衡时状态进行, 因此主要选择后10 ns进行分析, GRP78-LCA的Rg数值则在18 ns后趋于稳定, 结构致密。模拟过程中, GRP78-LCA在模拟的大部分时间, 保留着2个以上的氢键。

PERK-LCA复合物的蛋白小分子3D、2D相互作用图分别见图 5D、E, 在复合物PERK-LCA中, 小分子LCA结合在PERK蛋白上由PHE956、ALA620、ILE651、LEU646、LEU643、VAL652、ILE886、ASP955、LYS622、MET888、GLU639氨基酸围绕而成的口袋中, 其中与GLU639形成氢键作用, 与PHE956、ALA620、ILE651、LEU646、LEU643、VAL652、ILE886、ASP955、LYS622、MET888形成疏水作用。LCA与PERK的分子动力学模拟如图 5F所示: 在PERK-LCA复合物中, 复合物体系在30 ns后趋于稳定, 观察LCA相对于蛋白PERK的位置也可发现, 二者结合状态在20 ns后趋于稳定, 复合物模拟可达到平衡。PERK蛋白585~600号、628~645号、956~960号、1 078~1 087号氨基酸附近柔性大。主要选择后10 ns进行Rg分析, 可看出PERK-LCA复合物虽有动态波动, 但变动范围小, 趋于稳定, 结构致密。模拟过程中, PERK-LCA在模拟的大部分时间, 保留着2个以上的氢键。

讨论

收起

IR是T2DM的主要特征之一, 在此条件下机体胰岛素敏感性降低, 引起T2DM患者糖异生水平显著升高^{[37, 38]}。糖异生途径是非糖类化合物(如乳酸、甘油、生糖氨基酸等) 转化为葡萄糖的过程, 受多个关键酶调控, 包括PC、PEPCK、FBP和G6P等。糖异生是内源性葡萄糖的主要来源, 而过度糖异生是T2DM患者空腹异常血糖升高的主要原因^[39]。临床上可通过抑制T2DM患者的肝脏糖异生来达到降血糖的效果^[40], 如一线抗糖尿病药物MET可下调G6P和PEPCK的转录水平, 抑制糖异生, 从而缓解T2DM引起的糖代谢紊乱^[41]。此外, 在高脂饮食诱导的T2DM大鼠中, 梓醇和小檗碱可以抑制肝脏PEPCK和G6P的表达, 减少葡萄糖生成, 从而降低T2DM大鼠的血糖水平^{[42, 43]}; 在高脂饮食诱导的T2DM小鼠中, 靶向抑制PC的表达可减轻小鼠的肥胖症状并提高其胰岛素敏感性^[44]。同时, 大量研究表明PFKFB3可以通过催化FBP的变构抑制剂2, 6-FD的生成来抑制FBP的活性^{[26, 45]}, 而抑制FBP的活性则可改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠的全身性胰岛素抵抗^{[46, 47]}。以上研究证实了PC、PEPCK、G6P、FBP和PFKFB3等关键酶在缓解T2DM导致的异常糖异生及胰岛素抵抗中的重要作用。因此, 本文在前期研究的基础上, 进一步分析了LCA对以上关键酶的调控作用, 结果显示: LCA可下调PEPCK和G6P的转录水平, 并抑制其酶活性, 同时对PC的酶活也表现出显著的抑制效果。此外, LCA还可提高PFKFB3的转录和蛋白水平, 从而间接抑制糖异生。综上, LCA可通过抑制糖异生来改善T2DM引起的糖代谢紊乱。

T2DM的发病机制与内质网应激密切相关, 在代谢紊乱的条件下, 内质网的折叠能力不足以应对未折叠和错误折叠蛋白产生的高负荷, 为确保正确的蛋白质折叠而激活UPR反应, 导致内质网应激^[48]。同时, 由于胰岛素的天然结构是在内质网形成的, 长期的内质网应激会致使胰岛β细胞损伤, 进而引起胰岛素抵抗, 因此维持内质网内稳态也是维持胰岛β细胞正常代谢功能的必要条件^[49-51]。发生内质网应激时, IRE1、PERK和ATF6通路被激活^[52], 在T2DM患者中可观察到GRP78、CHOP、PERK、XBP1、IRE1α和ATF6的转录与蛋白水平显著高于对照组健康受试者^[53]。前人研究发现, 连续4周灌胃石榴花多酚提取物(50和100 mg·kg^-1) 可以下调PERK、ATF6、IRE1α、XBP1和CHOP的转录水平, 抑制IRE1α-XBP1通路, 缓解内质网应激, 改善胰岛素抵抗, 从而降低高脂饮食和STZ联合诱导的T2DM大鼠空腹血糖和血脂水平^[54]。因此, 本文也针对以上内质网应激相关通路, 进一步分析了LCA对T2DM引起的内质网应激的调控作用, 研究发现: LCA可下调PERK、eIF2α、IRE1α、XBP1、JNK1、ATF6α、GRP78的转录水平, 降低内质网应激标志蛋白GRP78的转录及蛋白水平, 抑制PERK的蛋白表达和磷酸化, 从而缓解内质网应激压力, 恢复内质网稳态。

课题组前期研究已观察到LCA可显著降低高糖高脂饮食诱导的T2DM小鼠的空腹血糖水平, 促进其肝糖原合成, 缓解肝脏脂肪变性, 并恢复线粒体稳态^[7], 本文是前期工作的延续, 评价了LCA对T2DM引起的异常糖异生和内质网应激的缓解效果, 进一步完善了LCA改善代谢的分子机制, 为LCA治疗T2DM的应用奠定了理论基础。

作者贡献: 许文镨和张佳瑜负责实验研究过程并撰写论文, 二人同等贡献; 刘颖和肖瑶提出实验思路、设计研究方案并修改论文; 汪逗逗、丁文文和陈姿伊协助进行实验数据采集与分析; 所有作者均阅读并参与修改。

利益冲突: 本文作者均没有利益冲突。

参考文献

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文献

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2024年第59卷第12期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0809

接收时间：2024-08-20
首发时间：2025-11-24
出版时间：2024-12-12

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收稿日期：2024-08-20
修回日期：2024-09-27

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1.北京中医药大学生命科学学院, 北京 102488

2.北京中医药大学中药学院, 北京 102488

通讯作者:

^*肖瑶, Tel: 86-10-53912136, E-mail: xiaoyao9510@126.com;

刘颖, Tel: 86-10-53912163, E-mail: liuyliwd@bucm.edu.cn

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2024-0809

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Group	Diet	Drug	Dose/mg·kg^-1
CTRL-vehicle	ND	/	/
CTRL-LCA-L		LCA	5
T2DM-vehicle	HFD	/	/
T2DM-LCA-L		LCA	5
T2DM-LCA-H			10
T2DM-MET		MET	200

Group

Diet

Drug

Dose/mg·kg^-1

CTRL-vehicle

CTRL-LCA-L

LCA

T2DM-vehicle

HFD

T2DM-LCA-L

LCA

T2DM-LCA-H

T2DM-MET

MET

200

Gene	Sequences (5'-3')
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CHOP	F: TTGCCTTTCTCCTTCGGGAC
	R: CAGTCAGCCAAGCCAGAGAA
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Gene

Sequences (5'-3')

GRP78

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F: TTGCCTTTCTCCTTCGGGAC

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JNK1

F: ACACCACAGAAATCCCTAGAAG

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XBP1

F: ATGGATTCTGGCGGTATTGAC

R: GAGAAAGGGAGGCTGGTAAGG

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F: AGCAGCACCCAAGACTCAAAC

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F: TAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGA

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PFKFB3

F: ATTGCGGTTTTCGATGCCAC

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β-actin

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R: GATAGCACAGCCTGGATAGCAA