药学学报

Compound	IC₅₀/μmol·L^-1	RF^a
Cisplatin	5.50 ± 0.31	43.68 ± 0.71	16.09 ± 1.34	7.94
DN603	16.75 ± 1.22	50.78 ± 4.25	18.07 ± 0.46	/
DN604	31.11 ± 0.74	93.13 ± 5.04	55.50 ± 1.20	/
NBDHEX	5.63 ± 0.13	4.12 ± 0.32	5.58 ± 0.29	/
DN603-NBD	3.77 ± 0.12	2.77 ± 0.23	6.56 ± 0.30	0.73
DN604-NBD	3.94 ± 0.13	2.92 ± 0.19	5.88 ± 0.26	0.74

Compound

IC₅₀/μmol·L^-1

RF^a

A549

A549/cDDP

L02

Cisplatin

5.50 ± 0.31

43.68 ± 0.71

16.09 ± 1.34

7.94

DN603

16.75 ± 1.22

50.78 ± 4.25

18.07 ± 0.46

DN604

31.11 ± 0.74

93.13 ± 5.04

55.50 ± 1.20

NBDHEX

5.63 ± 0.13

4.12 ± 0.32

5.58 ± 0.29

DN603-NBD

3.77 ± 0.12

2.77 ± 0.23

6.56 ± 0.30

0.73

DN604-NBD

3.94 ± 0.13

2.92 ± 0.19

5.88 ± 0.26

0.74

Compound	IC₅₀/μmol·L^-1	RF^a
Cisplatin	5.50 ± 0.31	43.68 ± 0.71	16.09 ± 1.34	7.94
DN603	16.75 ± 1.22	50.78 ± 4.25	18.07 ± 0.46	/
DN604	31.11 ± 0.74	93.13 ± 5.04	55.50 ± 1.20	/
NBDHEX	5.63 ± 0.13	4.12 ± 0.32	5.58 ± 0.29	/
DN603-NBD	3.77 ± 0.12	2.77 ± 0.23	6.56 ± 0.30	0.73
DN604-NBD	3.94 ± 0.13	2.92 ± 0.19	5.88 ± 0.26	0.74

Compound

IC₅₀/μmol·L^-1

RF^a

A549

A549/cDDP

L02

Cisplatin

5.50 ± 0.31

43.68 ± 0.71

16.09 ± 1.34

7.94

DN603

16.75 ± 1.22

50.78 ± 4.25

18.07 ± 0.46

DN604

31.11 ± 0.74

93.13 ± 5.04

55.50 ± 1.20

NBDHEX

5.63 ± 0.13

4.12 ± 0.32

5.58 ± 0.29

DN603-NBD

3.77 ± 0.12

2.77 ± 0.23

6.56 ± 0.30

0.73

DN604-NBD

3.94 ± 0.13

2.92 ± 0.19

5.88 ± 0.26

0.74

Compound	Pt content in 10⁶ cells/ng
Cisplatin	15 ± 0.40	9 ± 0.06
DN603	12 ± 0.25	10 ± 0.12
DN604	13 ± 0.28	11 ± 0.15
DN603-NBD	17 ± 0.40	34 ± 0.50
DN604-NBD	14 ± 0.19	30 ± 0.48

Compound

Pt content in 10⁶ cells/ng

A549

A549/cDDP

Cisplatin

15 ± 0.40

9 ± 0.06

DN603

12 ± 0.25

10 ± 0.12

DN604

13 ± 0.28

11 ± 0.15

DN603-NBD

17 ± 0.40

34 ± 0.50

DN604-NBD

14 ± 0.19

30 ± 0.48

Compound	Pt content in 10⁶ cells/ng
Cisplatin	15 ± 0.40	9 ± 0.06
DN603	12 ± 0.25	10 ± 0.12
DN604	13 ± 0.28	11 ± 0.15
DN603-NBD	17 ± 0.40	34 ± 0.50
DN604-NBD	14 ± 0.19	30 ± 0.48

Compound

Pt content in 10⁶ cells/ng

A549

A549/cDDP

Cisplatin

15 ± 0.40

9 ± 0.06

DN603

12 ± 0.25

10 ± 0.12

DN604

13 ± 0.28

11 ± 0.15

DN603-NBD

17 ± 0.40

34 ± 0.50

DN604-NBD

14 ± 0.19

30 ± 0.48

基于GSTs抑制剂的新型四价铂配合物逆转肺癌耐药作用及机制研究

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陈飞虹 , 吴佳妮 , 温鑫 , 苟少华 ^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(12): 3261-3272

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(12): 3261-3272

基于GSTs抑制剂的新型四价铂配合物逆转肺癌耐药作用及机制研究

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陈飞虹, 吴佳妮, 温鑫, 苟少华^*

作者信息

东南大学化学化工学院, 江苏省生物药物高技术研究重点实验室, 江苏南京 211189

通讯作者:

^*苟少华, Tel: 18013981481, E-mail: sgou@seu.edu.cn

The effect of reversing drug resistance and exact mechanism of novel platinum(Ⅳ) hybrids based on GSTs inhibitors

Fei-hong CHEN, Jia-ni WU, Xin WEN, Shao-hua GOU^*

Affiliations

Jiangsu Province Hi-Tech Key Laboratory for Biomedical Research, Southeast University, Nanjing 211189, China

出版时间: 2024-12-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0384

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摘要

收起

基于八面体的可修饰结构和动力学惰性, Pt(Ⅳ) 配合物成为逆转Pt(Ⅱ) 类药物耐药性和毒性的抗癌前药候选药物。硝基苯并恶二唑衍生物(NBDHEX) 能够抑制谷胱甘肽S转移酶(GSTs) 活性, 将NBDHEX与Pt(Ⅱ) 配合物DN603、DN604接合获得两个Pt(Ⅳ) 配合物DN603-NBD和DN604-NBD。体外实验表明, DN603/DN604-NBD能够有效抑制顺铂敏感A549细胞和耐药A549/cDDP细胞增殖, 对细胞的铂摄取量均高于顺铂, 诱导较高细胞凋亡率和Bax/Bcl-2比值, 激活caspase-3并裂解DNA修复酶(PARP), 诱导线粒体依赖性的细胞凋亡通路。DN603/DN604-NBD能够产生较高活性氧(ROS) 水平, 增强磷酸化H2AX (γ-H2AX) 的荧光强度, 引发严重DNA双链损伤。研究发现, GSTs激酶GSTP1在耐药肿瘤细胞中高表达, DN603/DN604-NBD能够靶向GSTP1并抑制其表达水平。提前给予ROS和c-Jun氨基末端激酶(JNK) 抑制剂后发现, 药物能够显著增加活细胞数量并降低JNK及c-Jun磷酸化水平。结果表明, DN603/DN604-NBD通过上调ROS来激活JNK相关信号通路而诱导细胞凋亡, 产生逆转顺铂耐药作用。动物福利和实验过程均遵循东南大学动物伦理委员会的规定(批准号: 20210303025)。体内研究表明, DN603/DN604-NBD能够抑制A549异种移植瘤生长且无明显毒副作用。所有结果表明, DN603-NBD和DN604-NBD是两种潜在的新型Pt(Ⅳ) 抗肿瘤前药候选药物。

关键词

Pt(Ⅳ) 类前药 / GSTs抑制剂 / 铂药耐药性 / 活性氧 / c-Jun氨基末端激酶 / c-Jun

Abstract

收起

Based on the octahedral modifiable structures and kinetic inertness, platinum (Ⅳ) complexes have become antitumor prodrug candidates to mitigate platinum (Ⅱ) drug resistance and side effects. The nitrobenzoxadiazole derivative (NBDHEX) can inhibit the activity of glutathione S-transferases (GSTs) and be introduced to conjugate with platinum(Ⅱ) complexes DN603 and DN604 to yield two platinum (Ⅳ) complexes DN603/DN604-NBD. In vitro assays demonstrated that DN603/DN604-NBD could significantly inhibit the proliferation of cisplatin-sensitive A549 and resistant A549/cDDP cancer cells. The uptake of DN603/DN604-NBD in A549/cDDP cells was much higher than that of cisplatin, causing a higher rate of cell apoptosis and a greater ratio of Bax/Bcl-2, the activation of caspase-3 and cleavage of DNA repair enzyme (PARP), inducing the mitochondria-dependent cell apoptosis pathway. DN603/DN604-NBD could induce higher reactive oxygen species (ROS) levels, significantly enhance phosphorylation of histone H2AX on Ser-139 (γ-H2AX) fluorescence intensity and cause a greater degree of DNA double-stranded damage. Studies have shown that GSTs kinase GSTP1 was highly expressed in cisplatin-resistant cancer cells. Moreover, DN603/DN604-NBD targeted GSTP1 to suppress its expression level. By using the ROS scavenger NAC and the c-Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor SP600125 in advance, it was found that DN603/DN604-NBD could significantly increase the number of living cells and decrease the phosphorylation levels of JNK and c-Jun. The results indicated that DN603/DN604-NBD could produce higher levels of ROS to activate JNK-mediated signaling pathway, induce apoptosis in tumor cells to overcome cisplatin resistance. All the animal experiments were approved by Animal Ethics Committee of Southeast University (grant No. 20210303025). In vivo assays confirmed that DN603/DN604-NBD could inhibit the growth of A549 xenograft tumors with nearly no toxicity and fewer side effects. Taken together, DN603/DN604-NBD are investigated as two potential novel platinum (Ⅳ) prodrug candidates for anticancer therapy.

Key words

platinum(Ⅳ) prodrug / GSTs inhibitor / cisplatin resistance / reactive oxygen species / c-Jun N-terminal kinase / c-Jun

引用本文

陈飞虹, 吴佳妮, 温鑫, 苟少华. 基于GSTs抑制剂的新型四价铂配合物逆转肺癌耐药作用及机制研究. 药学学报, 2024 , 59 (12) : 3261 -3272 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0384

Fei-hong CHEN, Jia-ni WU, Xin WEN, Shao-hua GOU. The effect of reversing drug resistance and exact mechanism of novel platinum(Ⅳ) hybrids based on GSTs inhibitors[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (12) : 3261 -3272 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0384

正文

收起

肺癌起源于肺部支气管黏膜或腺体, 具有极高发病率和死亡率, 是常见恶性肿瘤之一^[1]。肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC), 其中NSCLC约占肺癌的80%^[2], 晚期NSCLC患者5年预后约为4%^[3]。临床肿瘤治疗方法包括手术、放疗和化疗等, 其中化疗是全身性的治疗手段^[4]。早期NSCLC患者通过手术和辅助铂类化疗来治疗^{[5, 6]}。超过70% NSCLC患者确诊时已发展至晚期, 化疗是晚期NSCLC患者重要的治疗手段。作为晚期NSCLC化疗的首选药物, 铂类药物常与吉西他滨、多西他赛等联合使用^[7]。目前, 获得性耐药已成为临床NSCLC患者治疗失败的主要原因^[8], 因此需要研发新药来克服铂类耐药性^{[9, 10]}。

作为癌症化疗的主要药物^[11], 经典二价铂药以顺铂、卡铂和奥沙利铂为代表被广泛应用于实体瘤化疗。但长期服用铂药会使患者产生耐药性和骨髓抑制、神经毒性等严重毒不良反应^{[12, 13]}。本课题组前期研发新型铂(Ⅱ) 类配合物DN603和DN604 (图 1), 抗肿瘤活性较强, 水溶性较好, 细胞毒性较小且耐药性较低^[14]。在铂(Ⅱ) 配合物基础上合成稳定八面体构型的铂(Ⅳ) 配合物, 具有动力学惰性, 不易与体内亲核物质反应^[15], 对顺铂耐药肿瘤细胞具有细胞毒性, 逐渐成为最有希望克服铂(Ⅱ) 药物耐药性的替代者。

作为一种参与机体解毒功能的同工酶, 谷胱甘肽S转移酶(GSTs) 能够促进体内细胞癌变。研究发现, NSCLC癌组织中GSTs蛋白表达(78.33%) 明显高于癌旁组织(30%)^[16]。NSCLC中GSTs高表达患者的平均生存期低于GSTs低表达患者, 显示NSCLC预后不良^[17]。作为肿瘤耐药基因, GSTs显著降低NSCLC治疗效果。研发靶向GSTs抑制剂有望克服顺铂耐药性。6-(7-硝基-2, 1, 3-苯并恶二唑-4-巯基) 己醇是GSTs激酶家族GSTP1抑制剂NBDHEX, 属于硝基苯并恶二唑(NBD) 衍生物, 能够强效抑制GSTs激酶活性和催化还原型谷胱甘肽(GSH) 与致癌物、药物、毒素等结合作用^{[18, 19]}。本课题组将NBDHEX与Pt(Ⅱ) 类药物DN603和DN604偶联生成DN603/DN604-NBD (图 1), 对顺铂敏感A549细胞和顺铂耐受A549/cDDP细胞进行体外活性研究, 并构建体内A549异种移植瘤模型, 检测DN603/DN604-NBD对体内肿瘤生长作用, 探究其克服顺铂耐药作用的确切机制。

材料与方法

收起

化合物设计

铂(Ⅳ) 配合物由平面上载体基团(Am)、离去基团(L) 和位于轴向上的功能基团组成, 轴向基团一端以丁二酸连接一分子NBDHEX, 另一端为氯离子、羟基或丁二酸连接第二个NBDHEX分子, 如图 2所示。

NBDHEX及其衍生物的合成

以4-氯-7-硝基苯呋咱(1-1) 和6-巯基-1-己醇(1-2) 为起始原料合成NBDHEX (1-3) 及其丁二酸衍生物1-4, 如图 3所示。

NBDHEX (1-3) 的合成: 称取1.0 g化合物1-1于250 mL圆底烧瓶中, 加入80 mL乙醇/0.1 mol·L^-1磷酸钾缓冲液(pH = 7.0, v∶v = 1∶1), 室温下搅拌均匀。量取1.4 mL化合物1-2加入其中, 用1 mol·L^-1氢氧化钾溶液调节pH至中性, 容器密闭, 室温搅拌反应6 h。反应完毕后, 称取1.3 g 3-溴丙酮酸加入上述反应体系, 室温搅拌10 min, 静置1 h, 过滤收集沉淀, 适量水洗, 40 ℃真空干燥, 得金黄色化合物1.20 g, 产率80.5%。ESI-MS (m/z): [M-H]^- = 296.09。¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8.42 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.69 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.89 (m, 2H), 1.70~1.45 (m, 6H), 1.40 (s, 1H)。将0.1 mol·L^-1磷酸氢二钾溶液61.5 mL和0.1 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液38.5 mL混合, 即可配制成0.1 mol·L^-1磷酸钾缓冲液100 mL (pH = 7.0)。

化合物1-4的合成: 称取1.2 g化合物1-3, 1.2 g丁二酸酐和1.4 g 4-二甲氨基吡啶于100 mL圆底烧瓶中, 加入适量二氯甲烷(DCM) 作溶剂, 回流反应6 h, 薄层色谱法(TLC) (DCM∶MeOH = 10∶1, v∶v) 监测反应。待化合物1-1反应完全后, 冷却至室温, 以1 mol·L^-1盐酸溶液洗涤1次, 饱和氯化钠溶液洗涤2次, 无水硫酸钠干燥后硅胶柱层析纯化, 洗脱液为PE∶DCM∶MeOH = 20∶10∶1 (v∶v∶v), 得黄色化合物1.3 g, 产率81.3%。ESI-MS (m/z): [M-H]^- = 396.08。¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8.43 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.14 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.73~2.61 (m, 4H), 1.95~1.82 (m, 2H), 1.75~1.67 (m, 2H), 1.67~1.53 (m, 2H), 1.53~1.42 (m, 2H)。

铂(Ⅳ) 抗肿瘤配合物的合成与表征

以DN603和DN604为起始原料, 在纯化水中以N-氯代丁二酰亚胺(NCS) 作为氧化剂制备铂(Ⅳ) 配合物前体。铂(Ⅳ) 抗肿瘤配合物DN603-NBD (1-5) 和DN604-NBD (1-6) 的合成方法如图 4所示, 目标化合物的结构采用高分辨质谱(ESI-MS)、元素分析(EA)、氢谱(¹H-NMR)、碳谱(¹³C-NMR) 和铂谱(¹⁹⁵Pt-NMR) 进行表征。

化合物DN603-NBD (1-5) 的合成: 黄色固体243.9 mg, 产率54.2%。ESI-MS (m/z): [M-H]^- = 896.14。Anal. calcd (%): C 37.48, H 4.04, N 7.81, found: C 37.53, H 4.09, N 7.79。¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.57 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.50~7.55 (DACH-NH₂, 4H), 7.52 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.00 (t, J =7.5 Hz, 2H), 3.51~3.42 (4H), 3.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.75~2.52 (m, 4H), 2.15~1.95 (m, 2H), 1.83~1.72 (m, 2H), 1.65~1.00 (m, 14H)。¹³C-NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 203.42, 178.76, 175.90, 175.78, 172.23, 149.12, 142.60, 139.93, 132.25, 132.04, 122.16, 63.79, 61.60, 61.27, 59.64, 59.02, 45.69, 31.30, 31.03, 30.82, 30.56, 30.48, 29.47, 27.89, 27.75, 27.27, 24.80, 23.44。¹⁹⁵Pt-NMR (129 MHz, DMSO-d₆) δ = 1 004.17。

化合物DN604-NBD (1-6) 的合成: 黄色固体278.0 mg, 产率68.1%。ESI-MS (m/z): [M - H]^- = 816.07, [M + Cl]^- = 852.05。Anal. calcd (%): C 32.34, H 3.45, N 8.57, found: C 32.42, H 3.48, N 8.61。¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.57 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.25 (-NH₃, 6H), 4.01 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.51 (4H), 3.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.40~2.60 (m, 4H), 1.85~1.70 (m, 2H), 1.65~1.30 (m, 6H)。¹³C-NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 203.50, 177.84, 175.62, 172.23, 149.12, 142.60, 139.95, 132.26, 132.04, 122.15, 63.77, 59.76, 59.22, 45.46, 30.56, 30.45, 29.65, 27.87, 27.75, 27.27, 24.81。¹⁹⁵Pt-NMR (129 MHz, DMSO-d₆) δ = 1 338.67。

细胞

NSCLC细胞株A549、A549/cDDP购自上海ATCC细胞库。

动物

BALB/c裸鼠, 周龄为6~7周, 体重18~22 g, 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司, 实验动物生产许可证: SCXK (沪) 2013-0018; 合格证编号: 2013001803704。实验动物使用许可证: SYXK (苏) 2012-0047。本实验获得东南大学动物实验伦理委员会批准(批准号: No. 20210303025)。本课题中动物实验严格按照《中华人民共和国动物伦理指南》操作。

药物

DN603和DN604、DN603-NBD和DN604-NBD皆由本课题组制备获得。

试剂与仪器

PBS缓冲液、胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、多聚甲醛溶液、细胞通透液Triton X-100、RIPA裂解液、PMSF、DAPI、MTT、凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI)、周期检测试剂盒(RNase A/PI)、活性氧(ROS) 荧光探针(DCFH-DA) 和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) 均购自江苏凯基生物技术有限公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司; DMSO购自阿拉丁试剂公司。

MTT细胞毒检测

收集处于对数生长期的细胞, 将细胞与适量的RPMI-1640完全培养基混合均匀后, 接种于96孔板, 每孔的细胞数目保持在5 000个左右, 置于5% CO₂、37 ℃恒温培养箱内培养24 h, 待细胞贴壁后, 更换培养基并将呈浓度梯度的药物稀释液加入到96孔板内, 孵育72 h后, 每孔加入10 μL浓度为5 mg·mL^-1 MTT溶液, 孵育4 h后, 吸去上清液, 每孔加入130 μL DMSO溶解MTT甲臜沉淀, 置于摇床上5 min使沉淀完全溶解, 使用酶标仪测定490 nm条件下每个孔吸光度值(A), 并通过SPSS软件计算出半数抑制浓度(IC₅₀), 最终结果取3次平行实验的平均值。抑制率的计算方法: 抑制率(%) = (A_空白组 - A_给药组)/A_空白组。

铂摄取

为探究药物积累与细胞毒作用的关联, 本研究检测铂类配合物细胞摄取作用。将细胞接种于6孔板, 37 ℃孵育过夜。贴壁后吸去旧培养基, 每孔加入培养基配置的顺铂、DN603和DN604、DN603/DN604-NBD (15 μmol·L^-1, 2 mL)。12 h后收集细胞, 加入1 mL PBS后计数。离心弃上清, 每组加入200 μL浓硝酸, 65 ℃裂解过夜, 用ICP-MS检测铂含量。

Annexin V-FITC/PI双染法

将A549和A549/cDDP细胞复苏并于RPMI-1640培养基中培养过夜。将细胞接种于6孔板中培养12 h, 每孔分别加入顺铂、DN603、DN604、NBDHEX和DN603/DN604-NBD (10 μmol·L^-1)。将细胞收集于离心管中, 1 500 r·min^-1离心5 min, 弃上清重复2次。加入binding buffer缓冲液500 μL重悬, 加入Annexin V-FITC和PI各5 μL, 避光染色15 min, 使用流式细胞仪进行凋亡检测。

免疫印迹

为探究DN603/DN604-NBD诱导细胞凋亡机制, 本研究检测两种新型铂(Ⅳ) 配合物对凋亡蛋白表达水平的影响。将细胞接种至6孔板中, 贴壁后加入预先配制的药物(10 μmol·L^-1)。作用24 h后收集细胞, 加入裂解液冰上裂解50 min, 13 300 r·min^-1离心30 min, 收集上清液, 用BCA蛋白试剂盒测定蛋白含量。取适量蛋白样品于SDS-PAGE凝胶中电泳, 将目的蛋白转移至PVDF膜。用一抗处理和漂洗, 再用标记的二抗进行酶免疫定位。用X-ray底片曝光进行显影分析。

周期阻滞研究

将细胞接种至6孔板, 孵箱孵育12 h。弃上清换液, 分别加入10 μmol·L^-1顺铂、DN603、DN604、NBDHEX、DN603-NBD与DN604-NBD。作用24 h后将上清转到离心管中, 用胰蛋白酶消化细胞并收集, 1 000 r·min^-1离心5 min。弃上清, 用PBS洗涤细胞(2 000 r·min^-1离心5 min)。加入500 μL预冷的75%乙醇, 4 ℃固定过夜。PBS洗涤细胞(1 000 r·min^-1离心3 min), 加入500 μL染液(RNase A∶PI = 1∶9) 避光染色45 min。使用流式细胞仪检测并分析细胞周期分布情况。

ROS水平研究

通过检测ROS产生来探究DN603/DN604-NBD抗肿瘤作用机制。细胞接种至6孔板中孵育12 h至贴壁。吸去上清并加入10 μmol·L^-1 DN603-NBD与DN604-NBD作用24 h。去除培养液, 每孔加入10 μmol·L^-1 DCFH-DA 1 mL混匀染色30 min, 洗涤细胞, 荧光显微镜拍照观察, 流式细胞仪分析ROS水平。

彗星实验

6孔板接种适量细胞, 待贴壁后给药。药物终浓度为10 μmol·L^-1, 作用24 h。将细胞消化, PBS洗涤并离心, 再将细胞重悬。载玻片第一层为正常熔点琼脂糖NMA, 第二层为混有细胞的低熔点琼脂糖LMA, 第三层铺上低熔点琼脂糖LMA。加入裂解缓冲液裂解50 min。将载玻片放入碱性缓冲液(1 mmol·L^-1 EDTA, 300 mmol·L^-1 NaOH) 静置30 min, 促进DNA解旋。25 V电压下电泳30 min, 0.4 mmol·L^-1 Tris-HCl (pH 7.5) 缓冲液中和3次, PI染色, 使用共聚焦显微镜进行荧光拍照。

免疫荧光实验

DNA双链断裂(DSB) 是最具致死性损伤类型^{[20, 21]}。磷酸化的H2AX (phosphorylation of histone H2AX on Ser-139, γ-H2AX) 募集诱导双链DNA修复^{[22, 23]}。通过检测γ-H2AX来研究DN603/DN604-NBD对DNA损伤修复作用。取预先浸泡在75%乙醇48 h的盖玻片, 铺在6孔板后接种细胞, 孵育至贴壁, 加入10 μmol·L^-1 DN603/DN604-NBD继续孵育24 h。弃上清用PBS洗涤, 加入4%多聚甲醛固定, 20 min后用PBS洗涤。加入0.5% TritonX-100进行细胞透化, 20 min后用PBS洗涤3次。5% BSA封闭处理40 min, 加入一抗4 ℃孵育过夜, PBST清洗3次。加入相应二抗避光孵育1 h, DAPI染色10 min, 荧光显微镜拍照分析图像。

GSTP1表达水平和活性检测

GSTP1通过抑制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK) 而减少细胞凋亡^[24]。DN603/DN604-NBD轴向偶联NBDHEX, 本研究通过免疫印记检测A549和A549/cDDP中GSTP1表达水平来评估药物对GSTP抑制作用。GSTs能够催化GSH与1氯-2, 4-二硝基苯结合。使用GSTs激酶试剂盒研究DN603-NBD和DN604-NBD对GSTP1的调控作用。预先配置A、B、C、D工作液。取30 μL基质液(A工作液∶1 mmol·L^-1 GSH标准品溶液= 1∶1) 加入96孔板。用DMSO溶解DN603/DN604-NBD并配制成不同浓度: 0.1、0.5、1、2.5、5 µmol·L^-1。取20 nmol·L^-1 GSTP1蛋白分别与5种浓度溶液配置成10 µL混合液, 37 ℃水浴反应10 min。每组加入200 µL C液和50 µL D液, 空白组加入200 µL B液, 标准组加入200 µL GSH标准品溶液(20 µmol·L^-1) 均匀混合。室温反应15 min, 412 nm测定各组A值。以NBDHEX为阳性组, 计算药物对GSTP1激酶抑制率。

JNK信号通路研究

顺铂通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 信号通路而诱导细胞凋亡^{[24, 25]}。研究表明GSTs同工酶GSTP1与MAPK JNK结合并抑制其活化^{[26, 27]}。本课题组研究药物对JNK及c-Jun的磷酸化水平影响, 引入外源性JNK抑制剂吡唑蒽酮(1, 9-pyrazoloanthrone, SP600125) 及ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC) 来探究GSTP1调节JNK信号通路的确切机制。通过活死细胞双染试剂盒(calcein AM/PI双染) 检测SP600125和NAC预处理后给药诱导细胞增殖情况。通过免疫印记检测JNK及c-Jun的蛋白和磷酸化水平, 采用SP600125和NAC处理来探究药物对JNK通路作用。

裸鼠移植瘤体内药效实验

构建A549裸鼠异种移植瘤模型, 观察肿瘤大小及形态学变化。收集处于对数生长期的A549细胞, PBS清洗2次后计数, 将细胞重悬并接种于裸鼠右侧腋下。当肿瘤体积增长到150 mm³时, 将裸鼠随机分成7组, 每组5只。每周1次腹腔注射给药(8 mg·kg^-1), 共4次。测量肿瘤长宽等指标, 计算肿瘤体积: V=0.5LW² (V/mm³, L/mm, W/mm), 绘制生长曲线。处死小鼠, 检测瘤重和瘤体积来评估药物抗肿瘤活性。收集重要脏器和肿瘤组织进行免疫组化IHC分析。以小鼠体重和状态为全身毒性指标。

统计学方法

通过SPSS 16.0进行统计学分析, 计量数据为x ± s, 组间采用独立样本t检验, 多组间采用单因素方差分析。P < 0.05为数据差异, 有统计学意义。

结果

收起

1 DN603/DN604-NBD对顺铂敏感A549和顺铂耐药A549/cDDP细胞生长抑制作用

与其他受试化合物相比, DN603/DN604-NBD对A549细胞生长抑制作用较强, 且显著抑制A549/cDDP细胞生长作用(表 1)。在A549细胞中, DN603-NBD IC₅₀值为3.77 μmol·L^-1, 细胞毒作用优于DN603和NBDHEX的4.44和1.49倍。DN604-NBD IC₅₀值为3.94 μmol·L^-1, 优于DN604和NBDHEX的7.90和1.43倍。DN603-NBD和DN604-NBD的A549/cDDP细胞毒性分别强于DN603和DN604, 并以15.77和14.96倍强于顺铂, 耐药因子RF从7.94降至0.73和0.74。结果表明, 相较于其他4种化合物, DN603-NBD和DN604-NBD能有效抑制A549和A549/cDDP增殖, 表明二者能够克服顺铂耐药性。对于人正常肝癌细胞L02, DN603-NBD和DN604-NBD细胞毒性较低。结果表明, DN603-NBD和DN604-NBD具有优于其他化合物的抗肿瘤活性, 可能的原因是在铂(Ⅳ) 前药中引入了NBDHEX。

2 DN603/DN604-NBD对A549和A549/cDDP铂摄取作用

给药12 h后, A549细胞对DN603和DN604的摄取量低于顺铂, 但A549/cDDP细胞对DN603和DN604的摄取量高于顺铂, 说明DN603和DN604具有潜在克服顺铂耐药作用。而DN603-NBD在A549和A549/cDDP摄取量是顺铂的1.13和3.78倍。A549/cDDP中DN604-NBD的铂摄取量是顺铂的3.33倍, 且DN603-NBD和DN604-NBD积累量远高于顺铂, 在10⁶个细胞中分别达到34和30 ng。结果表明, 顺铂耐药肿瘤细胞对铂摄取量增加是Pt(Ⅳ) 配合物克服耐药的原因之一, DN603-NBD和DN604-NBD能够克服顺铂耐药作用(表 2)。

3 DN603/DN604-NBD诱导A549和A549/cDDP细胞凋亡作用

与对照组相比, 顺铂引起A549细胞较高凋亡率(61.30%), DN603与DN604诱导凋亡低于顺铂, DN603/DN604-NBD能够引发较高凋亡率(96.37%, 95.10%), 而NBDHEX产生的凋亡率最高(97.61%)。此外, 顺铂诱导A549/cDDP细胞的凋亡率明显降低(12.95%)。DN603和DN604诱导凋亡率略低于顺铂, NBDHEX诱导凋亡率为93.23%。DN603-NBD能够显著诱发细胞凋亡(95.38%) 且优于DN604-NBD (89.95%) (图 5)。结果表明, DN603/DN604-NBD均可诱导A549细胞凋亡。DN603-NBD诱导A549/cDDP凋亡作用强于DN604-NBD, 与细胞摄取量呈正相关。

4 DN603/DN604-NBD对A549和A549/cDDP细胞凋亡相关蛋白调控作用

在A549细胞中, 顺铂能够提高促凋亡蛋白Bax并下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平。而DN603/DN604-NBD作用程度与顺铂相当且优于其他化合物。顺铂通过激活半胱氨酸蛋白酶caspase-3并上调其表达, 裂解与DNA修复相关的聚(ADP) 核糖聚合酶(PARP) 而诱导细胞凋亡。在A549/cDDP细胞中, 顺铂对Bcl-2表达水平的下调作用降低。DN603/DN604-NBD能显著提高Bax/Bcl-2比例和caspase-3的表达水平, 使PARP裂解而诱导顺铂耐药细胞凋亡(图 6)。DN603-NBD和DN604-NBD诱导A549/cDDP细胞凋亡效果优于DN603、DN604和顺铂, 表明两者具有较强的克服顺铂耐药能力。

5 DN603/DN604-NBD阻滞A549和A549/cDDP细胞周期作用

顺铂诱导细胞周期阻滞在S期, DN603和DN604诱导细胞阻滞在S或G2/M期。NBDHEX诱导A549细胞阻滞S期, 诱导A549/cDDP细胞阻滞在S或G2/M期。研究表明, DN603-NBD和DN604-NBD诱导细胞周期阻滞在S期, 它们将A549细胞中处于S期的细胞由17.97%提高至51.07%和42.30%, 提升幅度较大(图 7)。DN603-NBD和DN604-NBD将细胞周期主要阻滞在S期, 阻滞效果优于NBDHEX。

6 DN603/DN604-NBD调控A549和A549/cDDP的ROS水平

在A549细胞中, 顺铂显著提高ROS水平, 而DN603和DN604提高ROS水平作用较弱。在A549细胞中, NBDHEX激活ROS作用低于顺铂; 而在A549/cDDP中强于顺铂, 表明NBDHEX具有潜在克服顺铂耐药作用。DN603-NBD和DN604-NBD引起较强荧光强度, 诱导A549和A549/cDDP细胞ROS水平显著增加, 并高于顺铂(图 8)。结果表明, DN603-NBD和DN604-NBD通过提高细胞ROS水平来诱导A549和A549/cDDP细胞凋亡, 具有潜在克服顺铂耐药作用。

7 DN603/DN604-NBD诱导A549和A549/cDDP的DNA损伤作用

顺铂能够显著诱导A549细胞DNA损伤, 该作用在A549/cDDP细胞中明显减弱。用DN603-NBD和DN604-NBD处理过的细胞都呈现明显拖尾现象, 尤其在耐药细胞中更长(图 9), 表明由于铂在细胞中积累增加, 导致药物作用顺铂耐药细胞后的DNA损伤水平显著增加。

8 DN603/DN604-NBD调控A549和A549/cDDP细胞中γ-H2AX水平作用

顺铂能够引起γ-H2AX磷酸化水平增加, 而DN603/DN604-NBD能够提高γ-H2AX磷酸化水平, 其中DN603-NBD组最为显著(图 10)。结果表明, 相比顺铂及NBDHEX, DN603-NBD和DN604-NBD更能够引起A549和A549/cDDP的DNA双链断裂损伤。

9 DN603/DN604-NBD对A549和A549/cDDP细胞GSTP1蛋白水平影响

研究表明, GSTP1在A549细胞中表达水平高于正常细胞L02, 且在A549/cDDP细胞中表达水平最高(图 11A)。结果表明, GSTP1过表达是NSCLC细胞产生耐药性的原因之一。

A549/cDDP细胞的GSTP1绿色荧光较A549更强。顺铂作用后肿瘤细胞绿色荧光均明显减弱。DN603及DN604组的荧光强度强于顺铂但弱于对照组。给药处理后A549细胞的绿色荧光要强于A549/cDDP, 表明顺铂、DN603和DN604能够抑制A549/cDDP细胞GSTP1表达。A549的NBDHEX组与顺铂组的绿色荧光水平相当, 而A549/cDDP的NBDHEX组基本无绿色荧光, 表明NBDHEX靶向并抑制GSTP1。而DN603-NBD和DN604-NBD处理后基本无绿色荧光表达, 表明DN603/DN604-NBD能够靶向GSTP1并抑制其表达, 且效果优于NBDHEX及二价铂配合物(图 11B、C)。

如图 11D所示, DN603/DN604-NBD能够显著抑制GSTs活性, 呈浓度依赖性降低。DN603-NBD对GSTs抑制作用要优于DN604-NBD。结果表明, NBDHEX与二价铂类衍生物偶联后能够提高对GSTs激酶抑制作用。

钙黄素标记绿色荧光(活细胞), 碘化丙啶标记红色荧光(死细胞)。DN603-NBD和DN604-NBD组红色荧光明显增强, 且DN603-NBD红色荧光较强, 表明二者有效抑制细胞增殖并诱导细胞死亡。经ROS抑制剂NAC及JNK抑制剂SP600125预处理后活细胞数量有所增加, 表明ROS及JNK表达水平对新型Pt(Ⅳ) 配合物诱导细胞死亡至关重要(图 12)。结果表明, 新型Pt(Ⅳ) 配合物对A549和A549/cDDP细胞均有较强杀伤作用, 而SP600125及NAC预处理能够减弱新型Pt(Ⅳ) 配合物杀死肿瘤细胞能力, 表明新型Pt(Ⅳ) 配合物通过产生过量ROS来诱导JNK信号通路活化而诱导肿瘤细胞死亡。

10 DN603/DN604-NBD对A549和A549/cDDP的JNK信号通路蛋白水平影响

结果表明, 顺铂促进JNK及c-Jun磷酸化水平上调, Pt(Ⅳ) 配合物显著提高其磷酸化水平, 降低JNK-GSTP1复合物表达水平, 激活JNK信号通路而引发细胞凋亡。用NAC及SP600125预处理细胞后JNK及c-Jun磷酸化水平显著降低, 表明NAC能抑制GSTP1多聚体形成, 抑制GSTP1与JNK-c-Jun解离, 维持JNK活性。在A549/cDDP细胞中, 顺铂提高JNK及c-Jun蛋白的磷酸化水平, 新型Pt(Ⅳ) 配合物显著引起JNK及其下游靶蛋白活化。NAC使GSTP1保持对JNK的抑制活性, 维持JNK活性水平(图 13)。结果证实, GSTP1能够参与肿瘤细胞应激反应, 调节JNK信号通路。DN603-NBD和DN604-NBD产生过量ROS, 抑制GSTP1-JNK-c-Jun复合物形成, 激活JNK并促进c-Jun磷酸化, 诱导肿瘤耐药细胞凋亡。DN603-NBD和DN604-NBD不仅保留Pt(Ⅱ) 类药物与NBDHEX的抗肿瘤活性, 还增加细胞铂摄取, 诱导DNA损伤, 抑制GSTP1而激活JNK信号通路, 克服铂药耐药性而诱导细胞凋亡。

11 DN603/DN604-NBD对体内异种移植瘤的抗肿瘤作用和机制研究

如图 14A所示, DN603、DN604及NBDHEX实验组的肿瘤体积增速明显降低, 表明DN603、DN604及NBDHEX能有效抑制肿瘤生长, 顺铂对实体瘤抑制作用最佳。DN604-NBD虽能明显抑制肿瘤体积增长, 却略微弱于顺铂。和DN604-NBD相比, DN603-NBD抑瘤率更高, 且与顺铂相当。图 14B表明, 相同剂量下, 顺铂抑瘤率达到59.83%, DN603和DN604抑瘤率分别为14.41%和9.09%。DN604-NBD抑瘤率达到30.75%, 与NBDHEX (31.69%) 相当。而DN603-NBD抑瘤率为48.32%, 优于DN604-NBD。结果表明, DN603-NBD治疗体内实体瘤的效果与顺铂相当。由于顺铂处理后裸鼠体重降低, 因此本研究还监测了DN603-NBD和DN604-NBD对裸鼠异种移植瘤模型的毒性作用。从图 14C看出, DN603/DN604-NBD对小鼠体重无明显作用。DN603/DN604-NBD具有显著体内抗肿瘤作用且无明显毒副作用。

讨论

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人非小细胞肺癌NSCLC约占肺癌的80%, 晚期NSCLC患者5年预后较低。临床NSCLC治疗方法主要包括手术治疗、放疗和化疗。早期NSCLC患者使用手术治疗和辅助铂类化疗等手段。化疗是晚期NSCLC患者重要治疗手段。其中, 铂类药物成为晚期NSCLC患者化疗的首选药物。作为肿瘤化疗主要手段, 铂类药物通常与其他药物如吉西他滨、多西他赛等联合使用。但铂药诱发的获得性耐药成为临床NSCLC患者治疗失败的重要原因, 亟需研发新型药物来克服铂类耐药作用。本研究将GSTs抑制剂NBDHEX与两种铂(Ⅱ) 配合物DN603和DN604轴向配位, 合成两种新型铂(Ⅳ) 配合物DN603-NBD和DN604-NBD。这两种铂(Ⅳ) 配合物既具有GSTP1激酶抑制作用, 又保留了铂药抗肿瘤效果。和顺铂相比, DN603-NBD和DN604-NBD显著抑制A549和A549/cDDP细胞增殖, 通过产生过量ROS来诱导更严重DNA双链断裂损伤。研究表明, GSTP1能够诱导体内细胞癌变。NSCLC中GSTP1高表达患者显示肿瘤预后不良。因此, GSTP1过表达是导致人肿瘤细胞对铂类药物耐药的重要原因, 抑制GSTP1的表达和活性能够逆转铂药耐药作用。DN603-NBD和DN604-NBD靶向GSTP1并抑制其表达, 从而克服铂耐药。两种铂(Ⅳ) 配合物通过产生过量ROS来阻止GSTP1-JNK-c-Jun复合物形成, 诱导JNK信号通路活化而引发肿瘤细胞死亡。此外, 两种铂(Ⅳ) 配合物能够显著抑制体内异种移植瘤生长, 且无明显毒副作用。

综上所述, 将GSTs抑制剂NBDHEX与铂(Ⅱ) 类药物的铂(Ⅳ) 衍生物接合, 得到具备研究潜力的新型抗肿瘤化合物DN603-NBD和DN604-NBD。这两种化合物不仅保留了NBDHEX对耐药因子GSTP1的抑制作用, 同时继承铂(Ⅱ) 类药物的抗肿瘤效果。尽管DN603-NBD和DN604-NBD在体内表现显著的抗肿瘤效果, 展现出作为新型抗癌药物的巨大潜力, 但为了充分证实它们的研究与应用价值, 仍需开展更多的体内异种移植瘤模型实验和体外实验, 进一步研究其克服化疗耐药作用和机制。

作者贡献: 陈飞虹负责实验研究、文章撰写与修改; 吴佳妮负责体外实验研究; 温鑫负责体内实验研究; 苟少华负责实验方案设计、实验指导、文章撰写、修改与审核。

利益冲突: 所有作者声明无利益冲突。

基金

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国家自然科学基金面上资助项目(82173852)
国家自然科学基金面上资助项目(21571033)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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2024年第59卷第12期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0384

接收时间：2024-04-19
首发时间：2025-11-24
出版时间：2024-12-12

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收稿日期：2024-04-19
修回日期：2024-06-22

基金

国家自然科学基金面上资助项目(82173852)

国家自然科学基金面上资助项目(21571033)

作者信息

东南大学化学化工学院, 江苏省生物药物高技术研究重点实验室, 江苏南京 211189

通讯作者:

^*苟少华, Tel: 18013981481, E-mail: sgou@seu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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