药学学报

Compd.	Mol Wt	No. of HA	K_i /μmol·L^-1	Clog P	LE	LLE
4	209	15	7 300	0.8	0.20	1.3
5	223	16	> 10 000	1.0	< 0.17	< 1.0
6	425	31	0.66	0.6	0.27	5.6

Compd.

Mol Wt

No. of HA

K_i /μmol·L^-1

Clog P

LLE

209

7 300

0.8

0.20

1.3

223

> 10 000

1.0

< 0.17

< 1.0

425

0.66

0.6

0.27

5.6

Compd.	Mol Wt	No. of HA	K_i /μmol·L^-1	Clog P	LE	LLE
4	209	15	7 300	0.8	0.20	1.3
5	223	16	> 10 000	1.0	< 0.17	< 1.0
6	425	31	0.66	0.6	0.27	5.6

Compd.

Mol Wt

No. of HA

K_i /μmol·L^-1

Clog P

LLE

209

7 300

0.8

0.20

1.3

223

> 10 000

1.0

< 0.17

< 1.0

425

0.66

0.6

0.27

5.6

Compd.	K_i /μmol·L^-1	ΔT_m/℃ at 12.5 μmol·L^-1	No. of HA	LE
7	4.5	0.08	15	0.49
8	8.8	0.2	16	0.43
9	0.003 6	4.2	22	0.52
10	0.003 5	Not test	27	0.43

Compd.

K_i /μmol·L^-1

ΔT_m/℃ at 12.5 μmol·L^-1

No. of HA

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Not test

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Compd.	K_i /μmol·L^-1	ΔT_m/℃ at 12.5 μmol·L^-1	No. of HA	LE
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K_i /μmol·L^-1

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Compd.	Mol Wt	No. of HA	FGFR3 IC₅₀/μmol·L^-1	LE	VEGFR2 IC₅₀/μmol·L^-1
15	145	11	120	0.49	140
16	245	17	6.5	0.42	0.46
17	375	28	0.33	0.32	5.5
18	361	27	0.012	0.40	0.56
19	446	33	0.003	0.35	0.037

Compd.

Mol Wt

No. of HA

FGFR3 IC₅₀/μmol·L^-1

VEGFR2 IC₅₀/μmol·L^-1

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140

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5.5

361

0.012

0.40

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0.003

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Compd.

Mol Wt

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29	< 1	< 0.5	< 60		0.02	0.35
30	< 1	< 0.5	83	0.18	0.16
31	< 1	< 0.5	< 60	0.016	0.018

Compd.

FP measurement of proteins K_i /μmol·L^-1

FL5.12 cells measurement EC₅₀ /μmol·L^-1

Bcl-2

Bcl-xL

Bcl-xL+10%HS

Bcl-2

Bcl-xL

< 1

< 0.5

< 60

0.02

0.35

< 1

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0.18

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Compd.

FP measurement of proteins K_i /μmol·L^-1

FL5.12 cells measurement EC₅₀ /μmol·L^-1

Bcl-2

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Bcl-2

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0.016

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Cell	Bcl-2 K_i/nmol·L^-1	Bcl-xL K_i/nmol·L^-1	FL5.12 cell Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1	FL5.12 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1	RS4;11/ALL Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1	H146 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1
Activity	< 0.01	48	4	261	8	4 260

Cell

Bcl-2
K_i/nmol·L^-1

Bcl-xL K_i/nmol·L^-1

FL5.12 cell Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1

FL5.12 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1

RS4;11/ALL Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1

H146 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1

Activity

< 0.01

261

4 260

Cell	Bcl-2 K_i/nmol·L^-1	Bcl-xL K_i/nmol·L^-1	FL5.12 cell Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1	FL5.12 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1	RS4;11/ALL Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1	H146 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1
Activity	< 0.01	48	4	261	8	4 260

Cell

Bcl-2
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FL5.12 cell Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1

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H146 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1

Activity

< 0.01

261

4 260

基于片段方法创制的药物

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郭宗儒 ^*

药学学报 | 专家论坛 2023,58(12): 3490-3507

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药学学报 | 专家论坛 2023, 58(12): 3490-3507

基于片段方法创制的药物

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郭宗儒^*

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

通讯作者:

*郭宗儒, E-mail: zrguo@imm.ac.cn

FBDD and drugs originated from FBDD

Zong-ru GUO^*

Affiliations

Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2023-12-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0955

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摘要

收起

小分子药物与靶标的结合大都以非共价键结合, 氢键、静电、疏水和范德华作用以维持结合力, 这些因素越多结合越牢固, 活性越强。但往往伴随分子尺寸变大, 产生过膜吸收代谢等药代问题, 最终影响成药性。基于片段的药物发现(fragment-based drug discovery, FBDD) 是普筛高质量片段以发现苗头分子, 结合结构生物学, 在片段生长、连接和融合中形成先导物, 以及优化出候选物的运行中, 始终兼顾化合物活性和物化性质之间的协调性。基于片段的药物发现与基于靶标结构的药物发现存在密切关系。本文以数个上市的药物简释FBDD的应用原理。

关键词

基于片段的药物发现 / 计算机辅助药物设计 / 配体效率 / 片段生长 / 连接和融合

Abstract

收起

The binding of small molecule drugs to targets is mostly through non-covalent bonds, and hydrogen bond, electrostatic, hydrophobic and van der Waals interactions function to maintain the binding force. The more these binding factors lead to strong bindings and high activities. However, it is often accompanied by the increase of molecular size, resulting in pharmacokinetic problems such as membrane penetration and absorption, as well as metabolism, which ultimately affects the drug success. Fragment-based drug discovery (FBDD) is to screen high-quality fragment library to find hits. Combine with structural biology, FBDD generates lead compounds by means of fragment growth, linking and fusion, and finally drug candidates by the optimization operation. During the value chain FBDD is closely related to structure-based drug discovery (SBDD). In this paper, the principle of FBDD is briefly described by several launched drugs.

Key words

fragment-based drug discovery / computer aided drug design / ligand efficacy / fragment growth / linking and fusion

引用本文

郭宗儒. 基于片段方法创制的药物. 药学学报, 2023 , 58 (12) : 3490 -3507 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0955

Zong-ru GUO. FBDD and drugs originated from FBDD[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (12) : 3490 -3507 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0955

正文

收起

在以靶标为核心的药物创制价值链中, 生物学初始环节是发现靶标, 化学的初始节点是发现苗头化合物(hit), 先导化合物是由苗头演化而成的(hit-to-lead)。基于片段的药物发现(fragment-based drug discovery, FBDD) 是发现苗头并自然过渡到先导化合物的一种技术, 其特点是将低通量筛选低分子量优质片段库, 并以结构生物学和计算机模拟作指导, 演化成先导化合物乃至进一步优化。FBDD与基于靶标结构的药物发现(structure-based drug discovery, SBDD) 常常交集和融合一起。本文拟扼要叙述FBDD的技术要点, 重点讨论以FBDD手段研制成功的上市药物。因为是能够满足患者需求的药物, 其创制构成的合理性毋庸置疑。

1 苗头和先导分子尺寸宜小

收起

就属性而言, 小分子药物有两大支柱, 即活性和成药性。活性含有强度和选择性, 成药性包括过膜性、吸收性、安全性、代谢稳定性, 以及物理化学性质等。溶解性和过膜性大体由类药5原则(RO5) 界定了小分子口服药物的物理化学特征, 虽然也有许多突破RO5的优质药物如大环、寡肽和天然药物等。

以靶标为核心研制药物, 药物分子与靶标结合是呈现药效的原动力, 这就要求分子之间在结合的形状、骨架和功能基团互补或相容(疏水性融合)。药物与靶标之间结合因素越多, 系统自由能变化越大, 结合力越强, 活性越高。但另一方面却因分子尺寸增大, 导致溶解性和过膜性变差, 降低了成药性。这就是大尺寸苗头分子进行结构优化的难处, 因为可修饰的化学空间已窄。因此, 苗头和先导化合物的分子尺寸宜小, 为优化结构预留出足够的化学空间。FBDD就是从低分子量化合物出发的。

2 片段分子特征

收起

为进行FBDD, 筛选的化合物宜遵循片段“三原则”, 即相对分子质量 < 300, 亲脂性(正辛醇/水系统的分配系数log P或pH 7.4缓冲液的分布系数log D) ≤ 3, 氢键给体(N-H, O-H) ≤ 3个, 氢键接受体(N, O) ≤ 3个, 极性表面积≤ 60 Å², 可旋转键为零^[1]。这样就确保了片段的小尺寸, 但因此与靶标结合力也很弱, 浓度通常在100~10 000 μmol·L^-1, 为此需要片段分子有较好的水溶性, 以保障有足够的浓度获得片段分子活性值, 例如K_d或IC₅₀。此外, 片段结构应有可修饰的位点, 作为片段连接和(或) 增长点。这些特征都是为起始物优化预留空间。

3 筛选方法

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由于片段分子的活性较低, 测定活性(结合力) 方法需要有较高灵敏度, 最常用的评价手段是生物物理法, 例如结合生化测定解析配体-靶标复合物的X-射线晶体结构, 其优点是进行基于靶标结构设计化合物时的直观与可视性。

在液相中测定靶标-配体的二维核磁共振谱也是常用的方法, 既可观测蛋白质的结构变化, 也可发现配体的结合状态。为此需要对靶标蛋白的某些原子作同位素标记, 例如¹⁵N和(或) ¹³C以甄别化学位移的变化。

表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR) 也是广泛使用的筛选方法, SPR需将靶标蛋白固定在传感器的芯片上, 例如用生物素标记蛋白, 经链霉亲和素与生物素相结合而固定, 或连接在蛋白侧链上有功能基的氨基酸(例如赖氨酸) 直接固定在芯片上。含有片段溶液流经芯片表面, 当片段分子与靶标蛋白结合, 会改变芯片表面的折射率, 基于片段浓度与折射率变化的关系, 可计算出片段分子的解离常数K_d, 即结合强度。SPR的定量性质也是研究结构类似片段并确定其构效关系和结合动力学的理想方法。

热迁移分析(thermal shift analysis, TSA) 是利用靶标蛋白与配体结合可提高蛋白的热力学稳定性的特性, 评价片段分子与靶标的结合强度。每种蛋白都有自身的热熔曲线, 随着温度的升高, 蛋白发生降解。当靶标蛋白与配体结合, 稳定性增加, 在测定过程中根据蛋白熔解温度(T_m) 的变化判断配体对蛋白的作用强弱。用生物化学方法测定活性, 较少提供三维结构信息, 需辅以结构生物学和分子模拟。

4 配体效率和片段的生长、连接与融合

收起

4.1 配体效率

从物理化学视角看, 药物(配体) 与靶标蛋白结合的驱动力是配体-靶标整体系统的能量降低, 结合能绝对值越大意味着配体活性越强。所以分子的尺寸大、氢键形成多、静电引力强、疏水作用广, 就有利于提高活性。然而过多的这些因素却不利于药代动力学和安全性(ADME/T), 导致成药前景暗淡。

为了限制分子中无用原子的存在, FBDD实践中常常使用配体效率(ligand efficiency, LE) 作为衡量化合物质量的参数, 其定义是每个非氢原子(即重原子, HA) 对活性(或自由能变化) 的贡献。计算方法是, LE = -log K_d(IC₅₀) × 1.37/N_HA计算LE值, 单位是能量kJ或kcal/HA。LE值越大化合物的效率越高, 片段的质量越高。因而LE在一定程度上同时表征了化合物体外活性与成药性的量度。

增加分子的亲脂性可提高配体与靶标的疏水-疏水相互作用, 以熵的形式贡献于活性, 却一定程度损害了药代动力学(代谢复杂性) 和安全性, 因而片段质量可用配体亲脂性效率(ligand lipophilic efficiency, LLE) 加以表征。亲脂性效率的定义是: LLE = -log K_d (IC₅₀) - log P (D), log P或log D代表化合物的分配系数或分布系数, LLE数值越大, 配体的质量越高。在苗头演化中应避免分配系数增大^{[2, 3]}。

4.2 片段的生长

FBDD获得初始苗头后, 常常在结构生物学或分子模拟的指引下增添片段或基团, “生长”成先导物。例如Grünenthal公司为研制治疗自身免疫和炎症疾病的药物, 以组织蛋白酶S (cathepsin S, Cat S) 为靶标, 经FBDD研制Cat S抑制剂, 用¹⁵N-标记的Cat S筛选1 858个多样结构的片段分子, 测定¹⁵N-HSQC NMR二维谱的化学位移变化, 发现了28个苗头分子, 其中化合物1活性K_d = 96 μmol·L^-1, 相对分子质量282, ClogP -0.7 (水溶性强), 配体效率LE = 0.29, 配体亲脂性效率LLE = 4.7。1与Cat S复合物晶体结构显示, 分子只结合于F211和V162组成的疏水腔(S2), 而没有占据F70和G69组成的S3以及催化中心C25.sδ的S1腔, 如图 1a所示。

在三维结构信息的指引下, 经过多轮优化和复合物晶体结构的分析, 1添加片段与基团“生长”成为化合物2, 分子量增加到501, 活性显著提高, K_d = 0.345 nmol·L^-1, 配体效率基本未变LE = 0.292, log D 1.3 (分布系数), 配体亲脂性效率LLE = 6.3, 高于1的4.7。2的甲基异噁唑乙酰胺片段占据了由G69和F70构成的S3腔, 环丙叉氰乙氨基则处于含有催化基团的半胱氨酸C25的S1腔中, 脂肪氰基的弱亲电性足以同腔内亲核性巯基发生可逆性共价结合, 是提高活性的重要因素, 这是片段增长“因地制宜”地加入了共价结合元素(图 1b)。进一步结构优化用叔丁乙酰基替换异噁唑乙酰基, 化合物3分子量降为477, 活性更高, K_d = 0.09 nmol·L^-1, LE = 0.442, ClogP 1.2 (适宜的分配系数), 配体亲脂性效率LLE = 8.7。化合物3现处于临床阶段^[4]。

4.3 片段连接

若FBDD筛选出两个(或多个) 分子结构不同而且结合位点相异的苗头片段, 可以用连接基(linker) 组装成一个分子, 由于降低了熵损失, 可大幅度提高结合性能, 成为优化的起始物。例如默克公司为研制治疗多发性硬化症和心血管疾病的药物, 设定线粒体同种型的亲环素D (cyclophilin D, CypD) 为靶标, 用SPR方法筛选2 688个片段分子, 经SPR反复“浓缩性”遴选, 得到6个结构不同、结合位点也不同的片段, 活性(K_d) 在1.1~10 mmol·L^-1范围。经双片段组合发现片段分子4和5经酰胺连接优化得到的化合物6, 活性提高10 000倍, 体现了FBDD的优势。表 1列出了4~6的活性、疏水性和化合物效率, 显示了两个片段结合成单一分子结合热力学优势。图 2是4和5与组织蛋白酶S复合物三维结构图。

图 3是片段4和5经连接形成的化合物6与亲环素D复合物三维结构图。片段4部分于S2腔中, 与Thr149形成氢键, 还经过两个结构水的介导与多个氨基酸残基发生氢键结合。双环马来酰胺(片段分子5) 处于S1′腔中, 由于单键可旋转180°可采取两种构象(绿色和黄色) 相结合, 此时琥珀酰亚胺的羰基氧与Asn144和His168发生氢键结合, 连接基上的羰基直接与Arg97氢键结合, 并经结构水与Gln116结合^[5]。

4.4 片段的融合

FBDD得到的苗头分子群, 若与靶标蛋白结合的两个片段在空间上有交集, 可将此交集部分精简为共享, 重叠部分融合为一, 这样, 在扩大结合范围的同时还简化了配体结构, 这种片段融合也可视作修剪性的片段连接或生长。

诺华研制胞质金属酶白三烯A4水解酶(LTA4H) 抑制剂, 用于治疗慢性炎症。采用FBDD方法的片段融合策略。差示扫描荧光法(DSF) 测量折叠的纯化蛋白质在与配体结合后发生去折叠而引起温度变化, 作为测试化合物活性的方法。溶剂化变色染料(solvatochomic dye) 随着蛋白外露的疏水部分与配体结合而温度变化, 表明发生了去折叠化。筛选了1 800个片段得到14个苗头分子, 其中化合物7和8与LTA4H复合物晶体结构显示二者的苯环重叠在一起, 都与Phe314发生π-π堆积作用(图 4a), 图 4b是8与LTA4H活性中心的结合模式, 伯氨基本身或经水分子介导与活性中心形成氢键网络。将7和8重叠的苯环融合共用, 生成的化合物9活性提高1 000倍, 差示扫描荧光的温度变化和配体效率也有显著提高, 如表 2数据所示。进一步对9的两端作多轮的结构优化, 得到化合物10 (代号LYS006), 目前处于临床研究阶段^[6]。

下面讨论始自于FBDD的成功药物。

5 维罗非尼

收起

5.1 高效率研制的BRAF^V600E靶向药物

维罗非尼是由Plexxikon公司与大学合作, 率先应用FBDD技术研制成功的药物。从2006年启动项目到2012年批准上市, 用6年时间完成, 体现了高效率。其中FBDD和计算机辅助药物设计(computer aided drug design, CADD) 是确定候选物的卓越实例。

BRAF是人类最重要的原癌基因之一, 表达产物BRAF是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一, 大约8%的肿瘤发生BRAF突变, 多为BRAF^V600E突变体, 突变产物导致下游MEK-ERK信号通路持续激活, 加速肿瘤的生长增殖和侵袭转移, 主要表现于黑色素瘤和结肠癌。

5.2 多种丝/苏氨酸激酶筛选和晶体结构解析

研究团队用生化方法对多种激酶评价了20 000个化合物, 相对分子质量为150~350, 发现其中238个在200 μmol·L^-1浓度下对Pim-1、FRGR-1和B-Raf 3种激酶的抑制率 > 30%。继之将这238种分子与至少1种激酶作共结晶分析, 获得了上百个复合物晶体X-射线衍射数据。

发现3-苯胺基-7-氮杂吲哚(11) 与Pim-1结合位点和结合模式具有新颖性。11对Pim-1的IC₅₀ = 100 μmol·L^-1, 其结合特征是7-氮杂吲哚的两个N原子与激酶铰链区的DFG链形成两个氢键, 分别为氢键给体和接受体(图 5a)。

5.3 晶体结构指导下的片段生长

基于11-Pim-1的晶体结构, 以片段“生长”方式设计合成了12, 12抑制FGFR1活性IC₅₀ = 1.9 μmol·L^-1, 严格说来不同的酶之间虽然没有可比性, 但甲氧基的引入增添了氢键结合(图 5b), 提高活性强度50倍, 也提高配体效率, 对下一步设计有参考价值。

基于12的结合模式, 在苯环的其他部位引入不同基团, 经药物化学的结构优化(原文未展开说明), 得到了化合物13, 对BRAF^V600E的抑制活性IC₅₀ = 0.4 μmol·L^-1。由于非氢原子数的增加, 配体效率略有降低(LE = 0.40)。

化合物13对突变体BRAF^V600E的活性强于野生型BRAF约12倍, 对其他70种激酶的活性甚低, 有较高的选择性。对高表达BRAF^V600E多种细胞系的抑制生长的活性强于野生型细胞数十倍。13的代号为PLX4720, 曾进行了临床研究, 结果却有不足之处^[7]。

5.4 维罗非尼的上市和与靶标的结合模式

分析化合物13与BRAF^V600E激酶的晶体结构(图 5c), 发现7-氮杂吲哚的5位氯原子的方向仍有空间, 以氯原子作为“生长锚点(anchor and grow)”, 连接不同的基团和片段, SAR优化出4-氯苯基取代的化合物(14), 改善了大动物的药代性质, 作为候选药物定名为维罗非尼(vemurafenib), 经临床研究, 证明对发生了V600E突变的BRAF的黑色素瘤有明显疗效, 于2011年经FDA批准上市, 为晚期恶性黑色素瘤患者的治疗药^[8]。

图 6是维罗非尼(14) 与BRAF^V600E的共晶结合模式, 磺酰胺基与DFG-in的Asp594形成氢键网络, 异丙基进入一小疏水腔内, 7-氮杂吲哚5位的氯苯基与Trp531、Gln530和Cys532形成的疏水腔相结合。

6 厄达替尼

收起

6.1 针对膀胱上皮癌的靶标FGFR

成纤维细胞生长因子受体(FGFR) 是受体型酪氨酸激酶, 有4种亚型FGFR 1~4, 与配体FGF结合发生二聚化和自磷酸化, 调节细胞生长和增殖。当FGFR变异(例如基因扩增易位融合等) 而异常活化会发生多种癌症。例如转移性的膀胱上皮癌患者有20%发生FGFR变异。由于FGFR与VEGFR蛋白有较高的同源性, 脱靶于VEGFR会带来不良反应而限制治疗窗口, Astex公司与大学合作, 以FBDD方法启动研制FGFR抑制剂, 后与杨森公司合作研制成功厄达替尼(erdafitinib), 是选择性的泛FGFR抑制剂。

6.2 生化筛选与晶体结构结合的片段生长

Astex用生化方法筛选公司的片段库对FGFR3的抑制活性, 发现6-氨基喹喔啉(15) 有微弱活性IC₅₀ = 120 μmol·L^-1, 因相对分子质量小, 所以有不错的配体效率(LE = 0.49), 但对VEGFR2也有抑制活性(表 3), 需要避免该脱靶作用, 15与FGFR3复合物晶体结构(图 7a) 显示在3位处尚有结合空间, 遂得到3-N-甲基吡唑化合物16, 提高了近20倍, 而VEGFR2脱靶作用降低了300倍, 甲基吡唑提高了化合物的选择性。基于16的复合物晶体结构(图 7b) 作基团虚拟筛选, 6位的氯原子被3′, 5′-二甲氧基苄胺取代, 17的活性提高到0.33 μmol·L^-1, 而且保持了选择性(图 7c)。

6.3 药物化学优化和厄达替尼上市

为提高17的活性, 将二甲氧基苄胺换成二甲氧基苯胺(减少一个sp³杂化碳原子), 18降低了分子柔性, 还更接近门户氨基酸残基后面的疏水腔, 对FGFR3的抑制活性提高到0.012 μmol·L^-1。进一步参考既往研究发现疏水性侧链占据了一定的空间, 如同图 8a紫色所示的位置, 蓝色为化合物18处于的空间, 从而在苯胺的氮原子上引入含有碱性氨基的烷基化合物19, 碱性氮原子与DFG铰链上的Asp641发生静电引力作用, 而且也有助于分子的水溶性。图 8b是19与FGFR3的结合模式, 对FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4各个亚型的IC₅₀分别为0.001 2、0.002 5、0.003和0.005 7 μmol·L^-1, 所以是FGFR泛抑制剂。19定名为厄达替尼(erdafitinib), 2019年美国FDA批准用于FGFR基因发生突变的晚期或转移性尿路上皮癌患者的治疗^[9]。

7 维奈托克

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7.1 概述

美国艾伯维公司和瑞士罗氏旗下的基因泰克公司合作研发生产的维奈托克(venetoclax), 是靶向B细胞淋巴瘤因子2 (Bcl-2) 的选择性抑制剂, 主要针对肿瘤细胞的凋亡途径, 于2015年获得美国FDA批准上市, 用于治疗慢性淋巴细胞白血病与难治性或复发性缺失17p突变基因的患者。

细胞程序化死亡(凋亡) 是机体清除衰老的、受损伤的和无用细胞的首要机制, 许多疾病的发生是由于凋亡过程的损坏, 例如肿瘤、自身免疫疾病和阿尔茨海默病等。B细胞淋巴瘤(Bcl) 蛋白家族中包含有抗凋亡蛋白如Bcl-2和Bcl-xL, 也有促凋亡蛋白如Bak、Bax和Bad, 二者精确地调控表达, 处于平衡状态。肿瘤为了逃逸凋亡, 高表达Bcl-2或Bcl-xL, 因而成为研制抗肿瘤药物的靶标, 通过结合Bcl-2或Bcl-xL, 释放促凋亡蛋白如Bak、Bax和Bad的功能, 达到治疗目的。

7.2 Bcl-2蛋白特征

Bcl-2蛋白家族的三维结构有相同的折叠形式: 两个疏水性螺旋, 由5~7个两亲性的α螺旋包围, 后者形成抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2的疏水性沟槽, 是结合促凋亡蛋白Bak、Bax和Bad的部位。该蛋白-蛋白相互作用的面积广泛(750~1 500 Å²), 表浅且无特征性结合位点, 增加了设计药物的难度。Bak的BH3肽与Bcl-xL的结合面积相对较小, 大约500 Å², 而且结合Bcl-xL的位点是较深的疏水沟槽, Bak蛋白的BH3肽为两亲性螺旋, 占据并结合于疏水沟槽, 这些信息为分子设计提供了线索^[10]。

维奈托克是第一个上市的干扰蛋白-蛋白相互作用的小分子药物。两个蛋白的相互作用, 往往是广泛而表浅的弱结合作用, 难以确定切入点。维奈托克研制历程, 涉及了FBDD、NMR和X-射线衍射等多种技术应用。

7.3 片段连接

艾伯维公司用核磁研究构效关系(SAR by NMR) 平台技术筛选9 000余个片段分子(MW < 210) 对Bcl-xL的结合位点, 得到了第一个结合片段4′-氟-联苯-4-甲酸(20), ¹⁵N-2D-NMR显示20结合于Bcl-xL疏水沟槽内的Gly94和Gly138, K_d为300 μmol·L^-1。

通过比对化合物20与Bcl-xL的复合物与Bak和Bcl-xL复合物的NMR, 发现另处存在第二个结合位点。为发现结合第二位点的苗头分子, 在化合物20的存在下, 用NMR方法筛选了3 500个MW < 150的小分子, 发现21结合于第二个位点, K_d为4 300 μmol·L^-1。

两个片段分子连接成一个分子, 变三元复合物成二元体系, 减少了熵损失, 理论上可提高结合能力。经不同的连接基和连接位点变换, 优化出新的苗头分子22, 经荧光偏振检测化合物抑制Bcl-xL活性K_i 1.4 μmol·L^-1。然而二维核磁谱表明乙烯基并非良好的连接基。

7.4 优化连接基

为此, 用N-酰化的磺酰胺基作为连接基, 以融合处于邻位的乙烯基和羧基的功能, 因为-SO₂-NH-CO-含有两个酰基, 拉电子效应使NH的酸性接近羧基, 合成的120个分子的集中库经荧光偏振测试, 发现化合物23抑制Bcl-xL活性K_i = 0.245 μmol·L^-1, 比22强5倍。图 9是23与Bcl-xL的结合模式, 联苯基处于两个α螺旋之间, Bcl-xL的Phe97区分开两个片段, Phe97的苯基与Tyr194同硝基苯片段发生π-π叠合作用。化合物23可视作3个片段构成: 第一片段是联苯基, 第二片段为硝基苯磺酰胺, 第三片段为苯并异硫代吡喃。

7.5 片段3的优化

对片段3进一步优化, 合成了上百个分子, 其中24活性高达K_i值36 nmol·L^-1。图 10是NMR方法显示的24与Bcl-xL的结合特征, 表明第一和第二片段的位置与23相同, 但第三个片段的硫苯基折返回到硝基苯的下方, 此时硫苯基处在蛋白的Phe97与24的硝基苯之间, 而硝基苯在Tyr194下方, 形成层叠的π-π堆积。这些相互作用说明了24的活性强于以前的化合物^[11]。

7.6 人血清对活性分子的失活

然而24活性虽高, 但介质中若含有人血清则活性下降, 10%血清使其完全失活。后来证明是白蛋白(HSA) 的结合, 是因为HAS-III的结构域与24的酸性基团N-酰化的磺酰胺相结合, 24与HAS-III的结合力K_i < 100 nmol·L^-1。

7.7 类似物的启示

在合成的125个化合物中, 25是24的二甲基取代物。NMR表明25与Bcl-xL和HSA-III的结合模式都与24不同。25的第三片段与HAS-III的结合呈伸展形, 苯硫乙基埋入非极性的氨基酸残基中, 提示Bcl-xL和HSA-III的末端分别为极性(因此24的苯环向回折曲) 和非极性, 因而设想变换乙基为有极性基团不会影响与Bcl-xL的结合, 并促使末端进入溶剂相, 从而削弱与HAS-III的结合力, 例如胺、酰胺或砜基不利于与HAS-III结合^[12]。

24的第一片段与Bcl-xL和HAS-III相结合的氟代联苯基所处的环境不同, Bcl-xL在氟端尚留有空间, 而且发生部分溶剂化, 而HAS-III结合的氟苯基被非极性残基满满地包围, 没有空隙。提示该片段也可加入或变换为极性基团, 以使与Bcl-xL和HAS-III结合的差异化。图 11是化合物24进行分子设计的示意图^[13]。

7.8 氟代联苯基的变换

依照上节的分析, 在氟代联苯基引入含有极性基团的长度不同的碳链, 经构效关系研究得到化合物26, 抑制Bcl-xL活性的K_i 0.019 μmol·L^-1, 介质中含有1%血清对Bcl-xL活性的K_i 0.652 μmol·L^-1, 提示极性基团的引入一定程度克服了与HAS-III的结合。

7.9 另一端苯硫醚基的变换

以化合物26的2′-甲氧基-4′, 4′-二甲基哌啶为固定基团, 变换片段3的结构, 即在乙硫基的α位连接含胺基的侧链, 以提高抑制Bcl-xL的活性和降低HAS-III的结合作用。优化出化合物27, Bcl-xL活性的K_i 0.000 8 μmol·L^-1, 介质中含有10%血清对Bcl-xL活性的K_i 0.36 μmol·L^-1, 还证明R构型是优映体。27具有高抑制Bcl-xL活性和高耐受HAS-III作用, 并证实可促进紫杉醇对非小细胞肺癌(高表达抗凋亡蛋白Bcl-xL) 的杀伤, 表明有促凋亡作用。

7.10 双靶标的研制

然而, R-27对多种人癌细胞的抑制效果不高。推测是基于Bcl-xL结构设计的, 没有考虑对Bcl-2蛋白的抑制, 对人体多种高表达Bcl-2的肿瘤抑制作用很弱, 所以抑瘤谱窄。Bcl-xL与Bcl-2序列的同源性虽然只有49%, 但三维结构却很相似^[14], 例如两个蛋白都有疏水型沟槽, 是结合促凋亡蛋白的BH3结构域的位置。为了提高抗肿瘤活性, 新的目标是对Bcl-xL/Bcl-2双靶标作用。

7.11 化合物28的启示

28是变换片段1时合成的化合物, NMR研究与Bcl-xL结合时, 片段1的苯乙基呈伸展型构象结合于疏水沟槽; 与Bcl-2结合时, 苯乙基则埋入疏水沟槽中。这为设计双靶标抑制剂提供了修饰位置。图 12是28与Bcl-xL (a) 和Bcl-2 (b) 的结合模式。然而28对Bcl-xL /Bcl-2的活性都不强。

7.12 兼有碱性和疏水性的片段1

以28为双靶标苗头分子, 整合26的哌啶单元, 多轮SAR后, 得到29~31三个活性较好的化合物, 对两个蛋白和高表达的细胞抑制活性列于表 4。

29~31都连接了联苯结构, 增加了疏水性, 深入到Bcl-2蛋白的疏水腔穴中, 但不影响与Bcl-xL的结合。化合物31活性显著强于29和30, 用3株高表达Bcl-2蛋白的滤泡性淋巴瘤细胞评价31活性, 即使含有3%胎牛血清, IC₅₀也低于1 μmol·L^-1。移植滤泡性淋巴瘤细胞的小鼠用31、依托泊苷和31加依托泊苷联合用药实验, 表明单独应用31的抑制作用相当于依托泊苷的最大耐受剂量, 联合用药可达到90%的抑制率^[15]。31进入了临床研究(ABT-737)。但由于水溶性很低, 静脉用药有很大困难, 口服的吸收性因人波动性很大。

7.13 改善药代的优势片段组合

优化药代性质的前提是保持活性, 提高对两种靶标蛋白以及高表达细胞的选择性作用, 增加溶解性和吸收性。分别对3个片段的联苯基、硝基和二甲氨基作结构变换, 发现环己烯氯苯、三氟甲磺酰基和N-吗啉乙基是优选的片段, 将这3个片段移植到31上得到化合物32, 保持了对高表达两个蛋白的细胞的抑制活性, 生物利用度达到20%, 进而灌胃小鼠多种移植性肿瘤模型, 表明都有抑制作用。32的代号为ABT-263, 定名navitoclax, 确定为候选化合物, 进入临床试验研究^[16]。

7.14 消除血小板的不良作用

32的II期临床显示有抗肿瘤作用, 但也出现血液毒性, 与临床前试验发现剂量依赖性地降低血小板相吻合, 研究表明是抑制Bcl-xL蛋白的缘故。这个结果对靶标蛋白Bcl-xL提出质疑, 也由此可见首创性药物靶标风险的时刻存在, 因而拟从化学结构上改造, 去除对Bcl-xL抑制作用, 只保留和提高抑制Bcl-2的活性。

Bcl-xL和Bcl-2蛋白与抗凋亡蛋白的BH3结构域的结合模式非常相似, 这是分开两种活性的困难所在, 需深入分析结合的微观特征。丙氨酸扫描提示, Bcl-xL和Bcl-2沟槽中主要结合位点是S2和S4疏水腔, 以及精氨酸与BH3的天冬氨酸残基的静电结合。

Navitoclax与Bcl-2复合物晶体结构显示, 苯硫基进入S4疏水腔中, 还与磺酰胺发生π-π叠合作用。4-氯代苯基环己烯片段结合于S2疏水腔。这并不能分辨Bcl-xL与Bcl-2的结构差异。

7.15 去除苯硫基片段

用试错法(trial and error) 变换既有的片段以消除或削弱对Bcl-xL的活性, 发现去除苯硫基的化合物33对Bcl-2失去了部分活性(K_i 59 nmol·L^-1), 而明显降低了抑制Bcl-xL作用(K_i 5 540 nmol·L^-1), 提示有可能区分两个靶标蛋白的结合。

33与Bcl-2的结合模式与32相似, 但片段3占据的S4腔穴的空间变小。另一个特征是33与Bcl-2二聚体结合, 第2个Bcl-2蛋白的色氨酸残基(Trp30) 嵌入到33结合的S4腔内, 吲哚环与硝基苯形成π-π堆积作用, 与32的苯硫基的π-π堆积相似。Trp30的吲哚氮原子与Bcl-2的Asp103发生氢键结合(Bcl-xL的残基为Glu103)。图 13是33与Bcl-2二聚体的晶体图, 紫色的吲哚环与硝基苯发生π-π堆积, 氮原子与Asp103发生氢键结合。

7.16 片段3连接吲哚环

模拟上述的结合特征将吲哚环经醚键连接在母核苯环上, 化合物34结合Bcl-2的选择性提高, K_i < 0.1 nmol·L^-1, 而与Bcl-xL结合的K_i > 660 nmol·L^-1, 活性相差千倍。与Bcl-2复合物晶体图(图 14) 显示吲哚环处于Trp30的位置, 氮原子与Asp103发生氢键结合, 此外, 吲哚的苯环与Asp107的距离适于氢键结合, 提示可利用该位置换作氮杂吲哚以增强结合作用。

7.17 候选化合物和venetoclax的上市

优化至此, 将原来作用于双靶标蛋白的navitoclax改造成只选择性结合于Bcl-2的化合物。整合的结构因素包括有利于药代性质、不与血浆白蛋白结合、增强对Bcl-2结合和消除对Bcl-xL的作用等结构因素, 经SAR反馈, 优化出化合物35 (ABT-199)。

35选择性抑制Bcl-2蛋白(图 15), 而对Bcl-xL作用很弱, 表 5列出了对靶标蛋白和高表达细胞的作用。例如对Bcl-2高表达的急性淋巴白血病细胞(ALL) EC₅₀ = 8 nmol·L^-1, 而对Bcl-xL高表达的H146细胞EC₅₀ > 4 000 nmol·L^-1。35消除了抑制血小板的不良反应, 小鼠灌胃100 mg·kg^-1 (AUC = 2 261 µg·h·mL^-1), 血小板计数未见变化, 而navitoclax (32) 犬口服5 mg·kg^-1 (AUC = 115 µg·h·mL^-1), 用药后6 h的血小板降低95%, 是由于作用靶标不同的缘故。

化合物35可口服吸收, 6~8 h血药浓度达峰, 半衰期26 h。定为候选化合物, 名为维奈托克(venetoclax), 经临床试验, 证明对17号短臂染色体缺失的慢性淋巴白血病有效, 于2016年4月FDA批准上市^[17]。

8 阿思尼布

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8.1 研制背景

慢性髓细胞白血病(CML) 和成人ALL的发病原因是血液祖细胞的9号和22号染色体发生交互易位, 导致BCR和ABL1基因在费城染色体(Ph) 上融合, 表达的BCR-ABL1融合蛋白具有ABL1激酶的活性结构域, 使得许多信号通路异常活化, 导致白血病的发生、分化、增殖的失控。已有治疗CML的药物如伊马替尼等有效药物, 作用靶标是BCR-ABL1的ATP结合位点。然而持续用药发生BCR-ABL1^T315I的突变而失效。阿思尼布的研究目标不是ATP位点, 而是作用于“远方”的变构位点。

2003年发现豆蔻酰基(十四烷酰基) 参与ABL1的自调节过程^[18], 当豆蔻酰基进入ABL1的C端豆蔻酰基结合腔, 与N端发生共价结合(酰化), 致使ABL1降低了构象的柔性而成非活化态, 这是个天然的自抑制作用。而融合蛋白BCR-ABL1的BCR占据了ABL1的N端帽区的豆蔻酰结合位点, 导致了BCR-ABL1的结构性活化, 致使细胞发生持续性分化增殖而恶性病变。BCR-ABL1的构象与激酶ATP位点不同, 与之结合的抑制剂之间不发生交叉耐药, 这是研制变构抑制剂的分子依据^[19]。

8.2 苗头化合物

寻找苗头分子是依据NMR信号变化而定。方法是先用伊马替尼占据ABL1的ATP结合位点形成复合物, 以确保信号的变化不是因结合ATP位点所致。筛选了500个水溶性和结构多样性小分子, 通过滴定法测定ABL1-伊马替尼复合物特定¹H谱化学位移的变化, 确定变构苗头物与ABL1的结合常数, 或者用滴定法测定受试物竞争性的排代工具药GNF-2 (36) 与ABL1复合物, 36结合于变构域K_d = 7.4 μmol·L^-1 (LE = 0.26)。这两种NMR测定方法有高度重合性。在发现的30个苗头中, 化合物37的亲和力K_d = 6 μmol·L^-1, 相对分子质量MW = 185, 配体效率较高(LE = 0.66), 因而是良好的苗头。

8.3 苗头-先导物演化

首先变换氯原子, 溴代化合物结合性能提高5倍, 然而生化实验没有抑制功能, 对转染融合蛋白的细胞即使在50 μmol·L^-1浓度下也没有活性。研究化合物37-ABL1-伊马替尼三元复合物的晶体结构, 表明37的结合位置与ABL1的螺旋1形成弯曲的抑制态构象是不相容的。图 16a是三元复合物晶体结构示意图, 伊马替尼和化合物37分别结合于ATP腔和变构区豆蔻基结合腔; 图 16b显示了37处于豆蔻酰基的结合位置, 37的甲酯与Helix1的Ile521的侧链阻挡了Helix1转变为非活化构象, 所以没有功能。

基于图 16的信息, 模拟豆蔻基的长链将羧基甲酯置换为正己胺基(38), 提高了结合力(K_d = 4 μmol·L^-1, LE = 0.49), 但仍没有细胞活性。模拟工具药36结合于弯曲型Helix1的药效团, 演化为化合物39 (K_d = 6 μmol·L^-1, LE = 0.24), 但还是没有细胞活性。研制者怀疑用¹H NMR未能反映化合物结合于失活性的弯曲型Helix1构象。因而改用在Helix1上的Val525残基作¹⁵N-标记, 利用¹⁵N, ¹H-HSQC信号峰的强度判断化合物的结合状态, 结果表明, 直线型的Helix1的Val525信号为尖锐高峰, 而弯曲状Helix1的Val525只有平均峰高度。化合物37~39的信号是明显的高尖峰, 而有功能活性的36为平均的峰高度, 从而解释了无功能活性的化合物即便结合于变构区, 并没有影响Helix1的直线型构型, 而36则引起Helix1的弯曲^[20]。

鉴于化合物36的三氟甲氧基变换位置失去功能活性, 推测CF₃O-对于稳定Helix1的弯曲构象是重要的药效团, 因而用CF₃O-基团替换39的二氯原子, 化合物40对ABL1的结合活性K_d = 10 μmol·L^-1, 对野生型BCR-ABL1转染Luk Ba/F3细胞增殖的抑制活性GI₅₀ = 8 μmol·L^-1, 这个结果打开了深入研究的道路。去除苯环上酚羟基和氯原子, 优化脂杂环, 得到的41提高了生化活性K_d = 0.55 μmol·L^-1 (LE = 0.33) 和细胞活性GI₅₀ = 2.93 μmol·L^-1。41可视作里程碑化合物。

8.4 结构生物学指导优化结构

图 17是41-ABL1-伊马替尼三元复合物晶体结构, CF₃O-处于狭窄结合通道的深部, 氟原子与亮氨酸Leu359的羰基发生静电相互作用; 酰胺基的NH经水分子介导与Ala452和Glu481形成氢键网络; 两个芳环都与酶有良好的π-π相互作用; 吗啉环有两种定位: 一是未与酶分子接触, 进入水相(图 17中绿色); 另一是内翻180°, 进入变构域的疏水裂隙中(图 17中黄色), 与Thr453、Met456和Pro480组成的疏水基团发生疏水相互作用, 吗啉环内翻180°的位置提示了进一步设计依据。

为了契合于疏水裂隙的空间, 在苯环B的3位经单键连接嘧啶环, 以可旋转的平面结构适配于疏水裂隙, 4位连接亲水性基团有利于溶解性。优化的目标定为对ABL1的高抑制活性, 对转染野生型和突变型(T315I) BCR-ABL1的细胞有强抑制活性, 以及适宜的物理化学和体外药理学性质。优化出化合物42, 对ABL1酶活性IC₅₀ = 2.3 nmol·L^-1 (LE = 0.32), log P = 3.0, (LLE = 4.50), 对高表达BCR-ABL1^T315I的Luc8/F3细胞抑制活性是GI₅₀ = 0.037 μmol·L^-1, 对大鼠肝微粒体清除率CL = 40 mL·min^-1·kg^-1。图 18是42与ABL1-伊马替尼三元复合物的晶体结构图, 分子处于疏水裂隙中, 以氢键和疏水作用结合, 羟基四氢吡咯处于开口处, 指向溶剂相。

8.5 进一步优化和消除对HERG蛋白的不良反应

然而42对HERG蛋白有一定的抑制作用(IC₅₀ = 9.6 μmol·L^-1), 有潜在心脏毒性, 还得作结构优化。对HERG显示抑制的分子多存在含氮的碱性基团, 这与提高溶解性加入碱性基团相矛盾, 矛盾之中, 仍以提高抑制变构域为主。图 18的晶体结构显示, 三氟甲氧基的结合部位尚有空余空间, 为提高范德华作用应增大基团体积, 可用两种方式修饰, 一是硫原子替换氧原子, 另一是将一个氟原子换成氯。第二处修饰位点是右侧苯环4-羟基四氢吡咯环的取代基变换, 变换吡啶环与3位嘧啶环之间的扭角(构象), 提高活性和溶解性; 第三个修饰位点是嘧啶环的变换, 是由于42的嘧啶环距离Glu481骨架的羰基近, 有可能形成氢键, 但需要有氢键给体, 嘧啶不能提供, 而3-吡唑基的NH可发生氢键结合。综合上述3处的变换, 合成了一系列化合物(结构从略)。在一批高活性化合物中遴选出43。

8.6 候选物确定和阿思尼布的上市

化合物43对ABL1激酶IC₅₀ = 0.5 nmol·L^-1, 相对分子质量416.13, LE = 0.37; 等温滴定量热法(ITC) 测定的抑制ABL1活性IC₅₀也是0.5 nmol·L^-1, 换算成结合能焓(ΔH) 贡献为-72.8 kJ·mol^-1, 熵贡献(-TΔS) 为-65.3 kJ·mol^-1, 说明43与ABL1变构区以特异性结合占优势。对高表达野生型BCR-ABL1激酶的Luc-Ba/F3细胞活性GI₅₀ = 1.0 nmol·L^-1, 突变型BCR-ABL-1^T315I细胞活性GI₅₀ = 25 nmol·L^-1; Clog P 3.3, 亲脂性效率LLE = 5.40; 静脉注射小鼠/大鼠/犬的半衰期(t_1/2) 分别为1.1/2.7/3.7 h; 小鼠/大鼠/犬口服生物利用度(F%) 分别为21/9/66; 在20 μmol·L^-1浓度下对主要的药物代谢酶CYP450没有抑制作用, 此外用吡唑置换嘧啶环消除了对HERG蛋白的抑制作用。随即确定为候选化合物, 定名阿思尼布(asciminib), 经临床研究表明阿思尼布是慢性髓细胞白血病治疗药, 尤其对门户氨基酸发生变异的T315I而产生耐药的患者, 阿思尼布是有效的治疗药物, 美国FDA于2021年批准上市^[21]。

8.7 与BCR-ABL1的结合模式

阿思尼布与BCR-ABL1和伊马替尼三元复合物晶体结构(图 19a) 提示, 两个药物结合在不同的部位, 分别是变构调节域和ATP结合域, 使用这两种药物避免了发生交叉耐药。图 19b是阿思尼布与变构位点的结合模式, 氯代二氟甲氧基结合于小疏水腔, 氟原子与Leu359的骨架羰基发生静电作用(氟键), 左侧苯环与Thr453和Met456发生疏水作用, 酰胺的羰基氧经结构水与Arg351生成氢键, 吡啶的氮原子经水分子介导形成氢键, 吡唑环结合于疏水裂隙, 并与Ala452羰基发生氢键结合, 吡唑处于吡啶的酰基的间位形成U形状是非常必要的。羟基四氢吡咯处于水相边缘, 起到助溶作用。

9 索托雷塞

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9.1 KRAS蛋白及其变异体

人类肿瘤30%是由于癌基因KRAS突变所引起, 是肺癌等许多肿瘤的驱动基因, 肺癌中20%患者KRAS蛋白的Gly12变异成Cys12 (KRAS^G12C)。在生长因子的信号通路中, KRAS的功能是分子开关, 通过与二磷酸鸟苷(GDP) 结合成非活化形态, 或与三磷酸鸟苷(GTP) 结合成活化型的开关循环, 调节下游效应蛋白的增殖。当KRAS发生G12C突变, 损坏了与GTP酶活化蛋白的结合, 使KRAS失活, 导致细胞的持续增生。

KRAS蛋白已知40年, 却长时间未研制出药物, 原因是它的可药性差: 一是KRAS与GDP酶和GTP酶的结合力非常强, K_i值达pmol·L^-1, 抑制剂很难达到与GD(T)P酶发生竞争性结合的程度; 另一是该蛋白缺乏明显的疏水腔, 难以发现设计抑制剂的切入点。

9.2 共价结合的片段确定变构位点

有机二硫化合物具有弱亲电性, 可与亲核性强的巯基发生交换共价结合。Ostrem等^[22]用FBDD方法, 筛选了380个含有二硫键的化合物对KRAS-GDP复合物的结合能力, 用质谱检测全蛋白的MS信号, 发现了化合物44具有结合Cys12的能力。

以44为苗头作先导物演化, 得到了活性较强的化合物45。图 20是45与KRAS^G12C共晶结构, 它结合于KRAS-GDP的变构区域的S-IIP处疏水性沟槽上, 延伸到Cys12以外的腔穴中, 氨基与Gly60羰基形成氢键, 将KRAS固定在非活化的构象上。

9.3 变换亲电性基团为丙烯酰胺

二硫化合物与巯基发生的是可逆性共价结合。为提高抑制活性, 变换为亲电性稍强的丙烯酰胺化合物46, 用LC-MS-MS确证了与KRAS的Cys12发生共价结合, 生化方法测定46抑制KRAS^G2C的速率常数(k_obs/[I]=0.1 (mol·L^-1)^-1·s^-1), 显示一定活性。进而优化活性和过膜性, 47的活性和成药性都得到改善。

然而47与KRAS^G2C共晶结构显示, 哌嗪-氮杂环丁烷-丙烯酰胺链超出了S-IIP的结构域, 从而将迈克尔基团经哌嗪环直接连在母核上; 结构中邻氨基酚和甘氨酸等片段都是代谢不稳定的片段, 将邻氨基酚变换成喹唑啉为骨架, 合成了系列化合物, 优化出化合物48。48的联喹唑啉-苯基邻位都有取代基, 两芳环平面呈正交构象, 由于转动受阻导致有阻转异构体存在, 拆分后S-构型为优映体。图 21是S-48与KRAS^G12C共晶图, 分子以伸展形处于变构区的S-II腔中(Switch-II pocket), 酚羟基经3个结构水与Asp69、Arg68和Gln99形成氢键网络, 喹唑啉N1与His95发生氢键结合, 哌嗪旁的羰基与Lys16氢键结合, 迈克尔基团与Cys12发生共价结合^[23]。S-48没有继续下去, 是因为有了更好的片段, 但揭示的特征在后来得到了应用。

9.4 新的片段组合

安进公司与Carmot公司合作, 利用Carmot拥有化学型演化(chemotype evolution) 技术平台, 用含有迈克尔基团的片段分子与有成药骨架的片段分子缩合成单一化合物组成的化合物库, 进行筛选。图 22是两类片段的代表性结构, 图 22a是含有丙烯酰胺的片段分子, X为片段偶联位点。22b是3 000多个结合于亲电性片段的分子。平台合成出大约两万个单个纳克级目标分子, 用生化和质谱方法快速评价化合物的结合性能, 凡是达到所设定标准的苗头, 制备毫克级的纯净化合物进一步评价, 这样得到苗头化合物49。

图 23是化合物49与KRAS^G12C共晶的X射线衍射图, 结合特征是丙烯酰胺骨架结合于Cys12, 而且羰基氧与Lys16形成氢键, 另一个羰基与Ala56和Tyr96的羟基形成两组氢键。溴苯基深入到疏水腔中, 溴原子被众多疏水残基环绕。异噁唑酰胺处于Gln99侧链和Switch II之间。

9.5 环合母核以稳定构象

将49的溴代苯与旁边的氨酰基环合成吲哚环以稳定构象, 变换吲哚3-位连接的末端片段, 综合评价动力学数据(k_obs/[I])、生化转化活性(IC₅₀) 和细胞活性(IC₅₀), 得到化合物50。50与KRAS^G12C的共晶结构有两个低能构象, 如图 24a、b所示, 图 24a的吲哚环在Arg68侧链的上面, 发生范德华结合, 3位的酰胺平面与吲哚环的CCCO两面角为155°, 几乎呈共面性。5-甲氧基四氢异喹啉(THIQ) 处于Tyr96和Gln99环之间, 与His95的咪唑环发生π-π叠合。图 24b的酰胺平面与吲哚环的CCCO两面角为69°, THIQ所处的位置与图 24a不同, 除了与His95的π-π叠合外, 还与Tyr96发生边-面的π-π叠合。两种共晶的其他部位的结合方式相同, 例如与Lys16和Tyr96的氢键结合以及与Cys12的共价键结合等。

下一步保持甲氧基-THIQ不变, 对吲哚环各个位置作单个和多组合的变换, 优化出化合物51, 抑制细胞活性达到IC₅₀ = 0.219 μmol·L^-1。

图 25是51与KRAS^G12C复合物晶体结构图。51的结合模式与50大体相同, 重要的区别是四氢异喹啉环进入新的“神秘”腔内, 是由于His95的侧链旋转, 形成了由Tyr96、His95和Gln99组成的腔。2-环丙基的引入降低了扭转两面角的能耗, 同时也增加了范德华作用力, 因而活性提高了。吲哚环上7-甲基处于Thr58、Tyr71和Gly60所在结合范围的范德华力, 增加了活性贡献^[24]。

然而化合物51在啮齿类的口服生物利用度较低, 体内的消除率却很高, 仍需作进一步优化。

9.6 骨架的变换

化合物51的结构是各个优势片段的组合, 似乎优化到了尽头。研制者想到前述的S-48。当叠合S-48和51的活性构象, 发现S-48的喹唑啉N1位连接出的疏水片段相当于51的四氢异喹啉所占的位置, 因而合成了以酞嗪和喹啉酮为母核的新类型化合物, 优化得到52, 对酶和细胞活性比51分别提高了3和9倍。图 26是52与KRAS^G12C复合物晶体图, 苯环上异丙基与Tyr95之间的疏水作用是提高活性的主要片段。

共晶结构还显示化合物52的喹唑啉酮环与异丙基苯环的构象呈正交取向, 也由于2-F, 6-OH-苯与喹啉酮环的阻转异构, 存在光学异构体, 经色谱拆分和测定活性发现R-52为优映体, 抑制细胞活性的IC₅₀ = 0.130 μmol·L^-1, 显著高于S-异构体。

52的共晶结构还提示了在哌嗪的C2位置有可与Cys12、Glu62和Tyr96接触的空间; 末端的氟代苯酚处, 还有空间可加入疏水性基团与Val9和Ile100结合, 以及与Arg68和Asp69的极性基团的结合空间。这些都是进一步优化52结构的契机。因为52的水溶性很低, 而且过膜性和生物利用度也较差。52已是通往成药的最后的先导化合物。

9.7 进一步优化

R-52作进一步优化, 包括提高活性和对G12C变异细胞株的选择性, 因而用发生G12S变异的A539细胞作为评价脱靶的量度, 同时还评价化合物的物化性质和药代行为, 结构变化的位置是喹唑啉酮的7位引入疏水基团, 以增强与该空间的疏水性结合。同时探索在哌嗪环的2位甲基取代对活性的影响。此外还考察母核的8位元素CH作N等排变换的作用。合成的众多化合物中优选出53, 53是2′-甲基-8-氮杂-52, 活性和选择性超过52, 8-氮杂电子等排体使酚羟基与8-氮杂形成分子内氢键, 降低了酚羟基为穿越细胞膜需去溶剂化的能量损耗, 结果表明, 53的过膜性显著提高, 也提高了溶解性。53的生物利用度达到33%, 而且细胞活性很高(p-ERK IC₅₀ = 44 nmol·L^-1; MIA PaCa-2活力IC₅₀ = 5 nmol·L^-1)。

9.8 光活体的稳定性和索托雷塞的批准上市

53的母核氮杂喹唑啉酮与异丙基苯的连键由于邻位取代基而形成阻转异构, 发生R和S异构体。图 27是两个对映体互相转化的能量变化和光活体的活性。然而53的光活体在25 ℃下逐渐消旋化, 半衰期为8天, 转化自由能垒ΔG^≠=26 kcal·mol^-1, 所以优映体R-53研制成药物有不稳定之缺点。

解决的办法是变换结构, 途径有三个: 一是提高构型转化的能垒, 使活化自由能ΔG^≠提高到30 kcal·mol^-1以上, 这样在室温下能以稳定的构型存在; 二是将转化能垒降低到20 kcal·mol^-1以下, 成为容易转化的混合物, 研发成消旋体; 三是制备对称的取代基, 消除手性轴。

变换异丙基苯片段设计不同的单或双取代基和苯环变为芳杂环, 评价化合物光活体的化学稳定性用两种方法测定化合物转换构型的能垒。对于慢速转化的化合物用¹H NMR信号随时间的变化得到的阻转异构体的比例的信息, 拟合艾林方程(Eyring equation) 求出活化自由能值ΔG^≠; 快速转化的化合物用变温核磁谱(VT-NMR) 加以确定^[25]。

经过多轮的构效关系和反馈, 化合物R-54 (光活体转化自由能ΔG^≠ > 30 kcal·mol^-1, 在25 ℃半衰期计算为t_1/2 > 180年) 显示高活性和选择性, 药代和物化性质优胜其他分子(数据从略), 因而确定为候选化合物, 定名为索托雷塞(sotorasib), 于2018年开始临床研究, 对KRAS^G12C变异的中晚期肺癌在免疫疗法和化疗无效的患者, 88%症状明显改善, 于2021年5月经美国FDA批准上市^[26]。

9.9 与KRAS的结合模式

索托雷塞与KRAS^G12C的共晶结构(图 28) 显示, 母核氮杂喹唑啉酮环占据了S-II疏水腔, 丙烯酰胺与Cys12的巯基发生共价键结合。S-甲基哌嗪采取扭船式构象, 使2′-甲基与Cys12和Tyr96接触, 吡啶环上的异丙基完全进入S-II疏水腔中, 与Tyr96、His95和Gln99发生范德华作用。吡啶的N原子对手性轴的稳定性没有影响。

10 培西达替尼(pexidartinib)

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10.1 集落刺激因子1及其受体

集落刺激因子1受体(CSF1R) 是调节巨噬细胞生长、增殖和分化的主要生长因子, 是一种跨膜的酪氨酸激酶受体, 与配体CSF1结合形成信号轴, 在细胞发育和生长中起重要作用。当CSF1R异常表达, 引起多种恶性肿瘤发生发展, 因而成为肿瘤治疗药物的靶标。

CSF1R介导的信号通路也是驱动滑膜中异常细胞增生的主要因素。培西达替尼(pexidartinib) 是日本第一/三共制药研制的CSF1R抑制剂, 2019年美国FDA批准上市, 用于治疗症状性腱鞘巨细胞瘤(TGCT) 成人患者。这些患者的疾病造成严重功能性限制, 而且无法通过手术改善疾病症状, 所以培西达替尼成为治疗TGCT的第一个也是迄今唯一获批的药物。只是研制者没有披露信息的药物化学研制过程。

10.2 FBDD的片段生长

Plexxikon公司(维罗非尼的研制单位) 仍是用多种激酶“垂钓”筛选。得到7-氮杂吲哚(55) 对Pim-1显示微弱活性(图 29a), 基于复合物晶体结构, 生长成3-(3′-甲氧基) 苄基-7-氮杂吲哚(56) (图 29b), 进而增长并优化成57 (图 29c)。

进一步优化是在7-氮杂吲哚环的5位引入氯原子得到的58培西达替尼, 图 30是培西达替尼与CSF1R (又称FMS) 复合物晶体结构图。

10.3 研制抗阿尔茨海默病治疗药

CSF1R还表达于脑内的小胶质细胞。小胶质细胞是一种主要分布在中枢神经系统的星形胶质细胞, 其重要作用已成为近年来神经科学研究的热点。神经生物学研究表明, 小胶质细胞可以在野生型和阿尔茨海默病模型小鼠中持续存在, 与淀粉样蛋白β斑块的生成密切关联。研究表明, 通过抑制CSF1R蛋白, 阻断小胶质细胞的功能, 可阻止阿尔茨海默病的发展。

Plexxikon公司以化合物57为先导物, 设计合成可口服吸收和穿越血脑屏障进入大脑的CSF1R抑制剂, 得到化合物59 (PLX5622), 是一种高选择性脑内CSF1R抑制剂。59已证明可以消除大脑中的小胶质细胞。图 31是59与CSF1R复合物晶体结构图, 59骨架与58相同, 二者结合模式大同小异, 基团的变化主要有利于口服吸收和穿越血脑屏障^[27]。

11 结语

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高质量的苗头分子是高效率演化成先导物和优化出候选物的基础, FBDD是从小尺寸分子(作为片段) 出发, 将活性测定与多种生物物理方法相结合, 能够迅速发现苗头和与靶标的结合模式, 从而演化成先导物和优化出候选物, 一路上都是以结构生物学指引的药物化学操作。高质量的片段库是发现优质苗头的前提。片段分子可以与靶标弱键结合, 也可以是可逆的或不可逆的共价结合。配体效率或配体亲脂性效率是监视苗头到先导物质量的重要指标。从维罗非尼2011年第一个FBDD药物上市至今有6个成功药物, 研发的难易不同, 干预蛋白-蛋白相互作用的维奈托克和变构抑制剂索托雷塞比竞争激酶ATP结合位点抑制剂要困难得多, 所以确定靶标、苗头和先导物更须谨慎。

作者贡献: 郭宗儒负责论文的选题、文献调研与撰写。

利益冲突: 作者声明没有利益冲突。

参考文献

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文献

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2023年第58卷第12期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0955

接收时间：2023-08-08
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-12-12

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收稿日期：2023-08-08
修回日期：2023-09-20

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中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

通讯作者:

*郭宗儒, E-mail: zrguo@imm.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Compd.	Mol Wt	No. of HA	K_i /μmol·L^-1	Clog P	LE	LLE
4	209	15	7 300	0.8	0.20	1.3
5	223	16	> 10 000	1.0	< 0.17	< 1.0
6	425	31	0.66	0.6	0.27	5.6

Compd.

Mol Wt

No. of HA

K_i /μmol·L^-1

Clog P

LLE

209

7 300

0.8

0.20

1.3

223

> 10 000

1.0

< 0.17

< 1.0

425

0.66

0.6

0.27

5.6

Compd.	K_i /μmol·L^-1	ΔT_m/℃ at 12.5 μmol·L^-1	No. of HA	LE
7	4.5	0.08	15	0.49
8	8.8	0.2	16	0.43
9	0.003 6	4.2	22	0.52
10	0.003 5	Not test	27	0.43

Compd.

K_i /μmol·L^-1

ΔT_m/℃ at 12.5 μmol·L^-1

No. of HA

4.5

0.08

0.49

8.8

0.2

0.43

0.003 6

4.2

0.52

0.003 5

Not test

0.43

Compd.	Mol Wt	No. of HA	FGFR3 IC₅₀/μmol·L^-1	LE	VEGFR2 IC₅₀/μmol·L^-1
15	145	11	120	0.49	140
16	245	17	6.5	0.42	0.46
17	375	28	0.33	0.32	5.5
18	361	27	0.012	0.40	0.56
19	446	33	0.003	0.35	0.037

Compd.

Mol Wt

No. of HA

FGFR3 IC₅₀/μmol·L^-1

VEGFR2 IC₅₀/μmol·L^-1

145

120

0.49

140

245

6.5

0.42

0.46

375

0.33

0.32

5.5

361

0.012

0.40

0.56

446

0.003

0.35

0.037


29	< 1	< 0.5	< 60		0.02	0.35
30	< 1	< 0.5	83	0.18	0.16
31	< 1	< 0.5	< 60	0.016	0.018

Compd.

FP measurement of proteins K_i /μmol·L^-1

FL5.12 cells measurement EC₅₀ /μmol·L^-1

Bcl-2

Bcl-xL

Bcl-xL+10%HS

Bcl-2

Bcl-xL

< 1

< 0.5

< 60

0.02

0.35

< 1

< 0.5

0.18

0.16

< 1

< 0.5

< 60

0.016

0.018

Cell	Bcl-2 K_i/nmol·L^-1	Bcl-xL K_i/nmol·L^-1	FL5.12 cell Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1	FL5.12 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1	RS4;11/ALL Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1	H146 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1
Activity	< 0.01	48	4	261	8	4 260

Cell

Bcl-2
K_i/nmol·L^-1

Bcl-xL K_i/nmol·L^-1

FL5.12 cell Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1

FL5.12 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1

RS4;11/ALL Bcl-2 EC₅₀/nmol·L^-1

H146 cell Bcl-xL EC₅₀/nmol·L^-1

Activity

< 0.01

261

4 260