药学学报

Group	Diastolic percentage/%
DMSO	1.97 ± 2.45	-13.03 ± 6.84	3.03 ± 4.58	0.30 ± 1.77
Ach	67.81 ± 5.41^***	-8.93 ± 4.75	5.20 ± 4.12	7.09 ± 11.01
TMYX 25 μg·mL^-1	10.67 ± 4.92^**	-16.18 ± 7.93^###	5.86 ± 6.38	2.91 ± 0.63
TMYX 50 μg·mL^-1	17.44 ± 7.16^**	-11.16 ± 9.07^###	3.82 ± 6.65^#	7.55 ± 5.94
TMYX 100 μg·mL^-1	20.17 ± 7.17^***	-13.19 ± 8.83^###	3.88 ± 5.40^##	10.48 ± 4.12
TMYX 200 μg·mL^-1	24.39 ± 6.17^***	-15.96 ± 10.35^###	3.53 ± 4.61^###	16.40 ± 2.81^#

Group	Diastolic percentage/%
DMSO	1.97 ± 2.45	-13.03 ± 6.84	3.03 ± 4.58	0.30 ± 1.77
Ach	67.81 ± 5.41^***	-8.93 ± 4.75	5.20 ± 4.12	7.09 ± 11.01
TMYX 25 μg·mL^-1	10.67 ± 4.92^**	-16.18 ± 7.93^###	5.86 ± 6.38	2.91 ± 0.63
TMYX 50 μg·mL^-1	17.44 ± 7.16^**	-11.16 ± 9.07^###	3.82 ± 6.65^#	7.55 ± 5.94
TMYX 100 μg·mL^-1	20.17 ± 7.17^***	-13.19 ± 8.83^###	3.88 ± 5.40^##	10.48 ± 4.12
TMYX 200 μg·mL^-1	24.39 ± 6.17^***	-15.96 ± 10.35^###	3.53 ± 4.61^###	16.40 ± 2.81^#

通脉养心丸通过上调GPER激活HIF-1α/eNOS信号通路减轻心肌缺血再灌后无复流的作用机制研究

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陈婷 , 刘海瑞 , 张燕燕 , 张伟 ^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(11): 3311-3320

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通脉养心丸通过上调GPER激活HIF-1α/eNOS信号通路减轻心肌缺血再灌后无复流的作用机制研究

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陈婷, 刘海瑞, 张燕燕, 张伟^*

作者信息

湖南中医药大学, 中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室, 湖南长沙 410208

通讯作者:

*张伟, Tel: 86-731-88458862, E-mail: zhangwei1979@hnucm.edu.cn

Mechanism of Tongmai Yangxin pill to reduce the no-reflow after myocardial ischemia and reperfusion by activating HIF-1α/eNOS signaling pathway up-regulated by GPER

Ting CHEN, Hai-rui LIU, Yan-yan ZHANG, Wei ZHANG^*

Affiliations

Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-cerebral Diseases, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

出版时间: 2023-11-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1419

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摘要

收起

基于整合药理学及实验验证探讨通脉养心丸(Tongmai Yangxin pill, TMYX)对心肌缺血再灌后无复流(no-reflow, NR)的心脏保护作用及其分子机制。首先采用心肌NR大鼠(心肌缺血2 h后再灌注2 h)证实TMYX减轻NR的作用; 再通过整合药理学分析、NR大鼠离体冠脉微血管体外研究和NR大鼠体内研究, 揭示TMYX改善NR的主要成分、靶点和途径。本实验获得湖南中医药大学伦理委员会批准(LLBH-202212160001)。结果发现, TMYX通过改善心脏结构和功能, 减少无复流、缺血心肌面积和心肌细胞病理损伤, 降低心肌肌钙蛋白Ⅰ (cardiac troponin Ⅰ, cTnⅠ)含量, 对NR有治疗作用。此外, 整合药理学预测TMYX改善NR机制与缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)、核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)信号通路有关。在体内, TMYX增加G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor, GPER)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase, p-ERK)和HIF-1α的表达。在体外, TMYX增强冠脉微血管的舒张功能, 然而此作用被GPER、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)及一氧化氮受体(soluble guanylate cyclase, sGC)阻断剂抑制。本研究通过整合药理学和实验评估, 揭示TMYX通过上调GPER激活HIF-1α/eNOS信号通路, 舒张冠状动脉微血管, 从而显著改善NR。

关键词

心脏保护作用 / 分子机制 / 整合药理学 / 冠脉微血管 / GPER/HIF-1α/eNOS

Abstract

收起

The Tongmai Yangxin pill (TMYX) has potential clinical effects on no-reflow (NR); however, the effective substances and mechanisms by which this occurs remain unclear. This study evaluates the cardioprotective effects and molecular mechanisms of TMYX against NR. We used a myocardial NR rat model (2 h after myocardial ischemia and 2 h after reperfusion) to confirm the effect and mechanism of action of TMYX in alleviating NR. In vitro studies in isolated coronary microvasculature of NR rats and in silico network pharmacology analyses were performed to reveal the underlying mechanisms of TMYX and determine the main components, targets, and pathways of TMYX, respectively. The experiment was approved by the Ethics Committee of Hunan University of Chinese Medicine (LLBH-202212160001). TMYX showed therapeutic effects on NR by improving cardiac structure and function, reducing NR, ischemic areas, and cardiomyocyte injury, and decreasing the content of cardiac troponin Ⅰ (cTnⅠ). Moreover, the mechanism of TMYX predicted by network pharmacology is related to the hypoxia inducible factor-1 (HIF-1), nuclear factor kappa-B (NF-κB), and tumor necrosis factor (TNF) signaling pathways. TMYX increased the expression of G protein-coupled estrogen receptor (GPER), phospho-extracellular signal-regulated kinase (p-ERK), and HIF-1α. In vitro, TMYX enhanced the diastolic function of coronary microvascular cells; however, this effect was inhibited by GPER inhibitor (G-15), eNOS inhibitor (L-NAME), and sGC inhibitor (ODQ). This study integrates pharmacology and experimental evaluation to reveal that TMYX activates HIF-1α/eNOS signaling pathway by upregulating GPER to relax coronary microvessels, thereby significantly alleviating NR.

Key words

cardioprotective effect / molecular mechanism / network pharmacology / coronary microvasculature / GPER/HIF-1α/eNOS

引用本文

陈婷, 刘海瑞, 张燕燕, 张伟. 通脉养心丸通过上调GPER激活HIF-1α/eNOS信号通路减轻心肌缺血再灌后无复流的作用机制研究. 药学学报, 2023 , 58 (11) : 3311 -3320 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1419

Ting CHEN, Hai-rui LIU, Yan-yan ZHANG, Wei ZHANG. Mechanism of Tongmai Yangxin pill to reduce the no-reflow after myocardial ischemia and reperfusion by activating HIF-1α/eNOS signaling pathway up-regulated by GPER[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (11) : 3311 -3320 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1419

正文

收起

无复流(no-reflow, NR) 是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI) 患者在经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI) 或溶栓治疗后, 虽已解除心外膜冠状动脉的机械性阻塞, 但心肌组织再灌注并不完全, 甚至无再灌注的现象, 表现为冠脉血流减慢或无血流^{[1, 2]}。心肌组织灌注不良或无灌注会导致恶性心律失常、心力衰竭等, 严重影响患者预后, 甚至危及患者生命。临床上AMI患者PCI术后无复流发生率高达30%^{[3, 4]}, 因此积极寻找有效的治疗药物和方法, 减少无复流现象的发生率具有重要意义。

通脉养心丸(Tongmai Yangxin pill, TMYX) 由经典配方“炙甘草汤”和“生脉饮”组成, 组方由君药地黄、甘草, 臣药党参、制何首乌、麦冬、五味子, 佐药鸡血藤、醋龟甲、阿胶, 使药桂枝和大枣组成, 具有益气养阴、通脉止痛之功效, 达到通养结合、标本兼治的效果, 可用于NR^{[5, 6]}。TMYX的活性成分主要包括类黄酮、皂苷和木脂素^[7]。临床试验表明, TMYX能有效改善冠心病和房性心律失常患者的临床症状, 防止心脏重塑和功能障碍的发生^[8]。TMYX在冠心病治疗中的抗炎活性与雌激素受体和核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB) 信号通路有关^[9]。TMYX通过改善心肌能量供应障碍和氨基酸功能障碍, 减轻氧化应激和炎症, 对稳定型心绞痛具有治疗作用^[10]。此外, 前期研究证实, TMYX可以显著改善NR, 其作用与降低血清中的心肌酶活性、氧化应激、心脏后负荷和心肌病理损伤有关^{[5, 6]}。因此, TMYX对NR具有潜在的治疗作用, 但其治疗NR的具体作用机制尚未研究清楚。

整合药理学方法是从生物网络的整体角度阐释疾病机制和药物作用机制的新兴方法^{[11, 12]}。本研究通过整合药理学和实验验证来阐明TMYX在心肌缺血再灌注后NR中的潜在机制。首先, 本研究采用NR大鼠验证TMYX (4.0 g·kg^-1)^[13]的心脏保护作用; 然后构建“潜在活性成分-关键靶点-通路”网络, 以预测TMYX的活性成分、潜在靶点和作用通路。最后, 采用NR大鼠模型和体外冠状动脉微血管实验, 验证TMYX减轻NR的机制。

材料与方法

收起

TMYX活性成分与靶点获取 在中药系统药理数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP) (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)和Batman-TCM (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)^[14], 对中药材“地黄”“鸡血藤”“麦冬”“甘草”“何首乌”“阿胶”“五味子”“党参”“大枣”“桂枝”“龟甲”进行检索, 对检索到的成分以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%^[15]和类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18^[16]为标准进行筛选, 得到其潜在活性成分, 建立TMYX的化学成分数据库。从TCMSP和Batman-TCM数据库下载TMYX靶点信息, 获得TMYX作用靶点数据库。

TMYX治疗NR潜在靶点获取 以“no reflow after myocardial ischemia and reperfusion”为关键词, 物种设置为“homo sapiens”, 从GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD数据库搜索NR靶点, 再将NR靶蛋白和TMYX靶蛋白名称在UniProt网站(http://www.uniprot.org) 转换成相应的基因名称。最后, 采用韦恩图筛选TMYX的药物靶点与NR靶点的交集靶点, 即TMYX治疗NR的潜在靶点^[17]。

构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络 为了阐明潜在靶点的相互作用并识别核心基因, 本研究将靶基因导入STRING (version 11.0, https://string-db.org/) 数据库, 物种设置为“homo sapiens”, 并将参数设置为最高置信度0.900, 以获得PPI数据, 并通过拓扑分析确定了核心基因。再使用Cytoscape软件进行PPI网络可视化^[18]。

潜在靶点基因本体(gene ontology, GO) 和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 富集分析 为深入了解TMYX治疗NR潜在靶点的功能及信号通路, 运用R 4.0.0软件中的bioconductor生物信息软件包对潜在靶点进行GO和KEGG富集分析, 分析结果以P < 0.05作为筛选条件, 并通过微生信作图网站(www.bioinformatics.com.cn) 进行可视化处理^[19]。

化合物-核心靶点相互作用验证 核心蛋白的三维(3D) 结构从PDB数据库(https://www.rcsb.org/) 下载。使用AutoDockTools-1.5.6通过去除配体、除水和加氢来处理核心蛋白。候选化合物的三维结构可从PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 下载。使用AutoDockTools将蛋白质受体和配体转换为PDBQT格式。最后, 使用AutoDock Vina软件进行分子对接, 并使用PyMOL和Discovery Studio 2016选择最低自由能模型进行可视化分析, 对接分数 < -5表示具有良好的结合亲和力^[20]。

实验动物 雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠(250 ± 10 g) 购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[证书编号: SCXK（湘）2019-0004]。所有实验方案均按照湖南中医药大学动物护理委员会批准的指南进行(LLBH-202212160001)。动物标准饲养, 自由摄食饮水, 实验前12 h禁食, 不禁水。

大鼠NR模型制备 适应性饲养大鼠1周, 术前禁食不禁水12 h, 实验组大鼠腹腔内注射0.3%戊巴比妥钠(10 mL·kg^-1) 进行麻醉, 麻醉后胸前手术备皮(用剃毛机将大鼠胸前区鼠毛脱去, 使手术视野充分暴露), 将大鼠用皮筋仰卧位固定四肢及头部于鼠板。在胸骨左缘0.5 cm处, 自胸骨左缘第3~4肋间开胸, 逐层钝性分离皮下组织、肌肉, 将心脏压出胸壁外。找到冠状动脉左前降支(left anterior descending artery, LAD), 用5/0缝合线在左心耳根部下方2 mm处, 以深1.5~2 mm、宽2~3 mm穿过心肌表层, 打一松结, 松结内放入2/0棉线。而后将冠脉及棉线一起进行结扎, 第二结为滑结, 造成心肌缺血。结扎后, 迅速将心脏送回胸腔, 并挤出胸腔内空气, 用一把直头止血钳夹闭皮肤及肌肉层, 造成假关胸。阻断冠状动脉左前降支2 h后^[6], 松开止血钳, 轻轻提起结扎的线头, 用一把显微镊顺势轻轻拔出棉线, 剪断胸腔外的结扎线, 恢复血流灌注并缝合, 其中假手术组只穿线不结扎。以结扎后LAD支配区域心肌颜色发绀或心尖变白、心脏搏动减弱且射血分数(ejection fraction, EF) 值< 50%为手术结扎成功的标志, 注射硫黄素S染色后心肌可见明显的荧光暗区为无复流模型成功的标志^{[21, 22]}。

分组和给药 再灌注2 h后, 根据大鼠EF值(< 50%) 将大鼠随机分为: 假手术组(Sham)、无复流组(NR)、TMYX (4.0 g·kg^-1) 和硝普钠(sodium nitroprusside, SNP, 5.0 mg·kg^-1, 阳性对照组) (n = 16)。Sham和NR组大鼠给予相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose, CMC-Na) (批号C8621, 北京索莱宝科技有限公司) 溶剂, SNP组大鼠进行腹腔注射, 其余各组大鼠灌胃给药。每日1次, 连续给药7天, 给药体积为10 mL·kg^-1, 大鼠每隔2天称重1次, 根据体重变化及时调整给药体积。第一次给药时间为造模后4 h。

药物制备和成分测定 TMYX (批号1070353) 由天津中新药业乐仁堂制药厂提供。实验前称取25.6 g TMYX, 加64 mL含0.5% CMC-Na超纯水浸泡, 待其软化后进行震荡充分溶解, 配制成0.4 g·mL^-1药液。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析TMYX的化学成分^[5]。根据分子片段峰、对照保留时间和二级光谱, 共鉴定出32种中药单体^[6]。实验前称取32 mg硝普钠(批号71778-25G, Sigma-Aldrich公司), 加64 mL超纯水配制成0.5 mg mL^-1药液。

无复流心肌面积及缺血心肌面积评估 给药7天后, 每组随机选择5只大鼠, 下腔静脉注入6%硫磺素S (1 mL·kg^-1), 硫磺素S经过的区域365 nm波长光源下发亮紫色荧光, 代表复流区范围, 无荧光区域为无复流区。硫磺素S注入完毕1 min后原位结扎LAD, 下腔静脉注入2% Evans Blue (1 mL·kg^-1), 1 min后取出心脏置于-40 ℃冰箱冷冻10~15 min, 再从结扎线下1 mm平行均匀将心脏切成5片, 于荧光显微镜365 nm拍照用于观察无复流心肌面积。心肌切片再于1% TTC溶液37 ℃水浴锅中孵化30 min, 于普通光照下拍照观察缺血心肌面积。普通光照下, 蓝染的区域为非缺血心肌区, 浅红色区域为缺血未梗死心肌区, 灰白色区域为梗死心肌区^[23], 用Image-Pro Plus 6.0软件测定各区面积。计算公式: 无复流心肌面积百分数=无复流心肌面积/心脏面积×100%; 缺血心肌面积百分数=缺血心肌面积/心脏面积×100%。

大鼠心脏血流动力学及结构的超声测定 使用小动物超声仪测量大鼠心脏的功能和结构^[6] (Vevo 2100, VisualSonics, 加拿大)。测量指标包括左心室EF、左室短轴缩窄率(left ventricular fractional shortening, FS)、流出道峰值血流速度(left ventricular outflow tract peak, LVOT peak) 和每搏输出量(left ventricular stroke volume, LVSV)。所有测量值均为3个心脏周期的平均值。

大鼠血清心肌肌钙蛋白Ⅰ (cardiac troponin Ⅰ, cTnⅠ) 含量检测 第3天给药1 h后, 每组大鼠进行目内眦取血, 采血1.0 mL, 静置30 min后, 4 ℃离心机3 500 r·min^-1离心10 min, 分离血清并分装于EP管中, 采用大鼠cTnⅠ检测试剂盒(批号: SEA478Ra, 武汉云克隆科技股份有限公司) 检测血清cTnⅠ含量, 评估心肌损伤程度^[24]。

HE染色 对大鼠实施安乐死, 并取出心脏。采用常规HE染色^[6], 于显微镜下对病理切片进行观察、选取合适视野拍照, 然后进行专业描述与分析。

Western blot 如前所述, 提取心脏左心室总蛋白, 进行蛋白质印迹定量分析^[6]。使用的抗体包括兔单克隆G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor, GPER) (1∶1 000稀释; 批号: bs-1380R) 购自北京博奥森生物科技有限公司; 兔单克隆磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho extracellular signal-regulated kinase, p-ERK) (1∶1 000稀释, 批号: 9106S)、兔单克隆GAPDH (1∶1 000稀释, 批号: 5174T)、抗兔IgG (1∶5 000稀释, 批号: 7074P2), 均购自美国Cell Signaling Technology公司; 兔多克隆缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α) (1∶1 000稀释, 批号: 340462, 湖南科航生物科技股份有限公司)。

NR大鼠离体冠脉微血管舒张功能的检测 将NR大鼠左前降支微血管环穿于两根直径40 μm、长2 cm的钨丝上, 谨慎固定于浴槽内两个钳夹上。浴槽内提前放置5 mL 37 ℃预热的PSS缓冲液并持续通气(95% O₂和5% CO₂), 温度控制在37 ℃。血管平衡后, 调节螺旋测微器使血管张力达到1 mN, 平衡后进行血管活性检测。先用5 mL KPSS溶液刺激血管环达坪台期后用PSS缓冲液换洗2次, 每次10 min; 反复2次KPSS刺激血管, 收缩张力 > 2 mN, 则认为该血管环活性良好。通过微血管张力传感器(DMT 620 M, Danish Myo Technology A/S) 记录血管张力变化情况。在内皮存在的情况下, 加入5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT) (10^-6 mol·L^-1) 使血管环达最大收缩状态, 平衡后采用每隔5 min累积给药法加入TMYX和阳性药乙酰胆碱(acetylcholine, Ach), 观察不同浓度TMYX (25、50、100、200 μg·mL^-1) 对血管环的舒张作用, 通过微血管张力信息采集系统(powerlab, AD instruments) 记录血管张力变化。血管环通过内皮活性功能检测后, 5-HT预处理使血管环达最大收缩状态, 平衡后, 每组血管环分别加入5 μL GPER阻断剂(G-15, 1 μmol·L^-1, 批号1161002-05-6, MCE公司)、eNOS阻断剂(L-NAME, 10^-4 mol·L^-1, 批号N5751, Sigma公司) 和sGC抑制剂(ODQ, 3 μmol·L^-1, 批号O3636, Sigma公司) 平衡30 min, 然后再每隔5 min累积加入不同浓度TMYX, 观察TMYX在G-15、L-NAME和ODQ预处理的情况下对微血管舒张功能的影响, 采用Labchart数据分析软件进行数据分析。

统计学分析 应用SPSS 21.0版进行数据统计分析, 所有数据以平均值±标准差表示, 数据符合正态分布时通过单因素方差分析(ANOVA) 进行分析, 数据不符合正态分布时使用非参数检验, 当P值小于0.05时, 差异被认为具有统计学意义。

结果

收起

1 “潜在活性成分-关键靶点-通路”网络的构建

从GeneCard、OMIM、PharmGkb和TTD数据库中总共获得了447个NR靶点。此外, TMYX和NR靶点的交集—69个重叠基因, 即TMYX改善NR的潜在靶点。运用Cytoscape软件构建“潜在活性成分-关键靶点-通路”网络, 网络包含162个节点(TMYX中的92个成分和69个潜在靶点) 和230条边。在PPI网络中, 利用拓扑分析计算了潜在靶点的度中心性(DC) 和中间中心性(BC)。DC和BC反映了整个网络中相应节点的影响。DC和BC值的组合已被证实对筛选可靠靶点有效^[11]。通过DC和BC值筛选后, 69个靶点中筛选出8个核心靶点, 其对应基因为NOS3、ALB、CXCL8、IL10、MMP9、IL6、CAT和TNF。不同的活性成分作用于这8个靶点(图 1), 反映了TMYX多成分、多靶点的特征。其中, 槲皮素、木犀草素、山柰酚和赖氨酸的度值(degree) 分别为6、4、2和2, 表明它们是网络中最重要的活性成分。

2 潜在靶点的GO富集分析和KEGG通路分析及分子对接验证

GO富集分析结果表明, TMYX改善NR的靶点与主要的生物过程有着密切的关系, 包括心脏收缩、氧化应激、代谢过程和血液循环调节。KEGG通路富集分析结果(图 2) 表明, TMYX可能通过调节HIF-1、cGMP-PKG、NF-κB和TNF信号通路对NR产生治疗作用。本文采用分子对接方法预测活性化合物与主要靶点(NOS3和TNF) 的结合亲和力, 如图 3所示, 活性化合物和主要靶点(NOS3和TNF) 的构象表现出良好的结合相互作用。

3 TMYX对NR大鼠NR心肌面积和缺血心肌面积的影响

为了研究TMYX是否具有减轻NR的作用, 本文采用硫黄素S、伊文思蓝和TTC染色观察无复流心肌面积和缺血心肌面积。结果表明, NR组无复流心肌面积和缺血心肌面积分别为88.4%和52.9% (P < 0.001, 图 4)。与NR组相比, TMYX组无复流心肌面积和缺血心肌面积分别减少至61.6%和31.1% (P < 0.001), SNP组无复流心肌面积和缺血心肌面积分别减少至54.0%和19.8% (P < 0.001), 表明TMYX具有减轻NR的作用。

4 TMYX对NR大鼠心脏结构和功能的影响

为了研究TMYX是否改善NR大鼠心脏结构和功能, 本文采用小动物超声仪测量大鼠心脏的功能和结构。如图 5所示, 与Sham组相比, NR组EF、FS、LVOT峰值和LVSV显著降低(P < 0.001)。然而, TMYX和SNP组的EF、FS、LVOT峰值和LVSV显著高于NR组(P < 0.01, P < 0.001)。结果表明, TMYX可以改善NR大鼠的心脏结构和功能。

5 TMYX对NR大鼠心肌酶活性的影响

在AMI中, cTnⅠ是心肌细胞坏死的生物标志物, 可作为评估心肌损伤的指标。如图 6A所示, NR组的cTnⅠ含量显著高于Sham组(P < 0.05)。与NR组相比, TMYX组和SNP组的cTnⅠ含量显著降低(P < 0.05)。数据表明, TMYX可以减轻心肌损伤, 起到保护心肌组织的作用。

6 TMYX对NR大鼠心肌组织病理损伤的影响

为了进一步观察TMYX对心肌组织病理损伤的影响, 本文进行了HE染色。Sham组呈现完整的心肌细胞, 心肌纤维排列整齐且紧密(图 6B)。NR组心肌细胞紊乱, 核固缩溶解, 肌纤维肿胀, 大量炎性细胞浸润。TMYX和SNP组心肌损伤程度明显减轻, 病变面积缩小, 水肿减轻, 可见少量炎性细胞浸润和间质水肿, 偶见空泡细胞。

7 TMYX对NR大鼠心肌GPER、ERK、HIF-1α蛋白表达的影响

如图 7所示, 与Sham组相比, NR组GPER、p-ERK和HIF-1α蛋白的表达显著降低(P < 0.05, P < 0.01)。TMYX治疗组GPER、p-ERK和HIF-1α蛋白的表达水平增加(P < 0.01)。结果表明, TMYX可以活化GPER蛋白的表达, 以激活HIF-1α信号传导。

8 TMYX通过激活HIF-1α/eNOS通路对离体冠脉微血管舒张功能的影响

如表 1所示, 与DMSO组相比, TMYX在体外增强了冠脉微血管的舒张功能(P < 0.01, P < 0.001), 但这种作用被G-15、L-NAME和ODQ抑制(P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001)。表明TMYX可以活化GPER激活HIF-1α/eNOS通路, 舒张冠脉微血管功能达到缓解NR的作用。

讨论

收起

NR现象是一个复杂的病理过程, 始于缺血阶段, 恶化于再灌注阶段, 以心肌微循环障碍为病理核心。临床上, NR由4种致病因素的可变组合引起: 远端动脉粥样硬化血栓栓塞、缺血损伤、再灌注损伤和冠状动脉微循环障碍^[2]。目前, NR的预防和治疗方法主要包括药物和器械疗法^{[25, 26]}。然而, 临床治疗NR的有效药物很少。

前期研究表明, TMYX通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(phospha-tidyinositol-3-kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase, PI3K/Akt/eNOS)、环磷酸腺苷/蛋白激酶A (cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A, cAMP/PKA) 和一氧化氮/环磷酸鸟苷酸蛋白酶(nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate, NO/cGMP) 通路, 调节细胞凋亡, 进一步上调NO活性, 舒张冠状微血管, 从而改善NR。这一结果表明, TMYX具有通过多成分、多靶点和多途径降低NR的作用。整合药理学是一门基于系统生物学的新兴学科, 用于分析生物系统网络以选择特定的信号节点, 从而可以准确确定药物和靶点之间的潜在相互作用^[17]。本研究通过整合药理学确定了TMYX的活性成分、潜在靶点和信号通路, 并通过实验验证了TMYX对NR的改善作用及机制。

在本研究中, 通过整合药理学分析最终得出TMYX中含有92个活性成分和69个潜在靶点, 表明TMYX通过多成分和多靶点在NR治疗中发挥作用。槲皮素、木犀草素、山柰酚和赖氨酸被评估为活性最高的成分。现有研究表明, 槲皮素通过下调高迁移率族蛋白B1-Toll样受体4-核因子κB (high-mobility group box 1-Toll-like receptor 4-nuclear factor-kappa B, HMGB1-TLR4-NF-κB) 信号通路来减轻心肌缺血再灌注损伤^[27], 通过沉默信息调节因子1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α (silent information regulator 1-peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α, Sirt1/PGC-1α) 信号通路在体内外改善缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡^[28]。此外, 槲皮素处理后通过PI3K/Akt通路减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤^[29]。木犀草素通过Sirt1/NLRP3/NF-κB通路和过氧化物酶原Ⅱ的激活减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤^{[30, 31]}, 还可以改善受损的线粒体形态, 调节丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 通路^[32], 下调TLR4介导的NF-κB/NLRP3炎症小体, 以缓解心肌缺血再灌注损伤^[33]。山柰酚可以通过激活PI3K/Akt/GSK-3β通路^{[34, 35]}来减轻心肌缺血/再灌注损伤。赖氨酸抑制含有赖氨酸甲基转移酶7的蛋白SET结构域, 通过下调Kelch样ECH相关蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1) 和促进核转录因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2) 介导的抗氧化信号通路, 减轻心肌细胞缺氧/复氧诱导的损伤^[36]。数据表明, SIRT1介导的赖氨酸脱乙酰化在急性缺血预处理中起重要作用^[37]。心肌缺血再灌注损伤可导致3种严重并发症: 恶性心律失常、心肌顿抑和NR。总的来说, TMYX通过多成分和多靶点在NR治疗中发挥重要作用。

PPI网络分析表明, TMYX改善NR的核心靶点是: NOS3、ALB、CXCL8、IL10、MMP9、IL6、CAT和TNF; 在分子对接验证中, 与NR密切相关的靶点(NOS3、TNF) 与主要活性成分表现出良好的亲和力。KEGG通路分析的结果表明, TMYX改善NR作用可能与HIF-1α、cGMP-PKG、NF-κB和TNF-α信号通路有关。前期研究表明, TMYX通过激活cGMP-PKG信号通路减轻NR^[6], 这也证实了整合药理学预测方法的准确性。

HIF-1α作为缺氧诱导因子家族中的关键一员, 在血管生成中起着关键作用^[38], 参与缺血性心脏的心肌重塑和梗死周围血管形成^[39]。HIF-1α活性已被证明受蛋白激酶Akt和ERK磷酸化调节^[40], 值得注意的是, Akt和ERK都被认为是心脏保护的介质^[41]。激活GPER在缺血再灌注模型中发挥保护作用, 并可在体外舒张血管。GPER诱导的猪冠状动脉舒张由cAMP/PKA信号介导^[42]。PKA增强HeLa细胞和大鼠心肌细胞中HIF-1α转录活性和靶基因表达^[43]。大量研究证明, HIF-1α可以通过激活eNOS, 产生NO^[44]。作为NO的主要受体sGC催化GTP转化为cGMP以调节PKG, PKG调节血管平滑肌细胞中的K⁺通道, 从而调节血管张力, 在心肌缺血/再灌注损伤和NR过程中发挥重要作用^{[45, 46]}。体内实验表明, TMYX促进HIF-1α蛋白的表达, 提示激活HIF-1α通路是TMYX改善NR的作用机制。体外实验表明, TMYX可以增强冠脉微血管舒张功能, 但这种作用被G-15、L-NAME和ODQ抑制, 提示TMYX可以通过活化GPER来调节HIF-1α/eNOS信号通路, 并最终达到舒张冠脉微血管和缓解NR的作用。

综上, 本研究通过整合药理学和实验验证, 揭示了TMYX改善NR的作用及机制。此外, 由于数据库信息不完整, 一些关键靶点和活性化合物可能会被忽略。本研究目前的实验和整合药理学结果证实, TMYX通过活化GPER激活HIF-1α/eNOS信号通路, 舒张冠状动脉微血管, 从而显著改善NR, 为TMYX的进一步临床应用提供科学依据。

作者贡献: 张伟提出整体研究思路, 负责论文撰写的指导与修改; 陈婷负责动物实验和体外实验及文章书写; 刘海瑞负责网络药理学分析; 张燕燕负责整理数据和文献调研。

利益冲突: 所有作者均声明没有利益冲突。

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湖南省自然科学基金-科药联合基金(2022JJ80112)
湖南省教育厅科学研究优秀青年项目(22B0367)

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2023年第58卷第11期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1419

接收时间：2022-12-26
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-11-12

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收稿日期：2022-12-26
修回日期：2023-06-18

基金

湖南省自然科学基金-科药联合基金(2022JJ80112)

湖南省教育厅科学研究优秀青年项目(22B0367)

作者信息

湖南中医药大学, 中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室, 湖南长沙 410208

通讯作者:

*张伟, Tel: 86-731-88458862, E-mail: zhangwei1979@hnucm.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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