药学学报

Xanthine / μmol·L^-1	[XO measured activity / theoretical activity ratio] / %
25	106.2 ± 1.5	95.9 ± 1.5	94.4 ± 4.9	58.0 ± 3.7
50	109.3 ± 1.5	101.5 ± 0.2	99.8 ± 0.5	83.2 ± 1.6
75	108.8 ± 0.7	105.3 ± 0.7	101.5 ± 0.6	87.5 ± 0.6
100	118.6 ± 4.4	105.7 ± 0.2	103.6 ± 0.9	88.3 ± 2.4

Xanthine / μmol·L^-1	[XO measured activity / theoretical activity ratio] / %
25	106.2 ± 1.5	95.9 ± 1.5	94.4 ± 4.9	58.0 ± 3.7
50	109.3 ± 1.5	101.5 ± 0.2	99.8 ± 0.5	83.2 ± 1.6
75	108.8 ± 0.7	105.3 ± 0.7	101.5 ± 0.6	87.5 ± 0.6
100	118.6 ± 4.4	105.7 ± 0.2	103.6 ± 0.9	88.3 ± 2.4

Enzyme activity / U·gprot^-1	NAD⁺ / μmol·L^-1
XDH	0.43 ± 0.12	0.84 ± 0.18^*	0.89 ± 0.11^*	0.92 ± 0.02^*
XOR	0.80 ± 0.14	1.19 ± 0.08^*	1.15 ± 0.09^*	1.15 ± 0.13^*

Enzyme activity / U·gprot^-1	NAD⁺ / μmol·L^-1
XDH	0.43 ± 0.12	0.84 ± 0.18^*	0.89 ± 0.11^*	0.92 ± 0.02^*
XOR	0.80 ± 0.14	1.19 ± 0.08^*	1.15 ± 0.09^*	1.15 ± 0.13^*

黄嘌呤氧化还原酶不同亚型活性测定方法的建立与应用

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陈冬婷 ¹^,² , 田金英 ¹^,² , 李雪晨 ¹^,² , 李江 ¹^,² , 叶菲 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(10): 3016-3023

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药学学报 |研究论文 2023 , 58 (10) : 3016 -3023

黄嘌呤氧化还原酶不同亚型活性测定方法的建立与应用

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陈冬婷¹^,², 田金英¹^,², 李雪晨¹^,², 李江¹^,², 叶菲¹^,²^,^*

作者信息

1.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京新药机制与药理评价研究重点实验室, 北京 100050

2.中国医学科学院糖尿病研究中心, 北京 100050

通讯作者:

*叶菲, Tel: 86-10-83150495, E-mail: yefei@imm.ac.cn

Establishment and application of activity determining methods for different subtypes of xanthine oxidoreductase

Dong-ting CHEN¹^,², Jin-ying TIAN¹^,², Xue-chen LI¹^,², Jiang LI¹^,², Fei YE¹^,²^,^*

Affiliations

1. Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

2. Diabetes Research Center of Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2023-10-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0389

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摘要

收起

黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase, XOR) 是体内催化嘌呤生成尿酸的关键酶, 以两种可以相互转化的亚型存在, 分别是黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase, XDH) 和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)。本研究首先通过两亚型酶在催化过程中使用电子受体不同的原理, 在牛奶来源纯酶中建立了XOR及亚型XO、XDH的活性测定方法, 明确了测定体系中最适底物xanthine浓度为50 μmol·L^-1, 最适电子受体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺) 浓度为50 μmol·L^-1, 最适pH值为7.80, XOR、XO、XDH的可测定范围分别为0.97~17.5 U·L^-1、1~9 U·L^-1、66~1 191 mU·L^-1。随后在纯酶体系测定方法的基础上, 建立了小鼠肝组织XOR及亚型XO、XDH的活性测定方法, 明确了组织制样方法、测定体系中最适xanthine浓度为100 μmol·L^-1、最适NAD⁺浓度为100 μmol·L^-1, XOR、XO、XDH的可测定范围分别为0.67~3.98、0.19~1.08、0.52~3.55 U·gprot^-1。应用已建立的方法, 测定了经典的XOR抑制剂别嘌呤醇(allopurinal, Allo) 对牛奶及小鼠肝组织来源XOR、XO及XDH活性的抑制作用。所有动物实验经过中国医学科学院药物研究所实验动物管理与动物福利委员会审核并批准(00003346), 符合实验动物伦理相关规范。本研究分别建立了牛奶来源纯酶体系中及小鼠肝脏中XOR及其亚型XO、XDH的活性测定方法, 该方法准确、便捷, 对探究XOR在机体中不同的病理生理作用、研发新型XOR抑制剂等奠定了实验基础。

关键词

黄嘌呤氧化还原酶 / 黄嘌呤脱氢酶 / 黄嘌呤氧化酶 / 酶活性测定 / 酶动力学 / 抑制剂

Abstract

收起

Xanthine oxidoreductase (XOR), the key enzyme catalyzing purine to produce uric acid, including two subtypes, xanthine dehydrogenase (XDH) and xanthine oxidase (XO), respectively, in vivo. Usually, XDH and XO can transform to each other. In this study, based on the principle that the subtype XO or XDH uses different electron acceptors, the methods for the measuring the activities of bovine milk XOR (pure enzyme) and its subtypes were established. The optimal concentrations of substrate xanthine (50 μmol·L^-1) and electron acceptor NAD⁺ (50 μmol·L^-1), pH value (7.80) were investigated. The ranges of the XOR, XO, XDH activity which could be determined were 0.97-17.5 U·L^-1, 1-9 U·L^-1, and 66-1 191 mU·L^-1, respectively. Furthermore, the methods for determining the activities of XOR and its subtypes in mouse liver were established. The preparation of liver samples, the optimal concentrations of xanthine (100 μmol·L^-1) and NAD⁺ (100 μmol·L^-1) were researched. And the activity ranges of XOR, XO and XDH in mouse liver which could be determined were 0.67-3.98, 0.19-1.08, and 0.52-3.55 U·gprot^-1, respectively. With the methods above, the effects of classic XOR inhibitor allopurinal (Allo) on XOR, XO and XDH from both milk and mouse liver were determined. All animal experiments have been approved by the Animal Experimental Center, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College (00003346). This study established new methods for the determination of XOR and its subtypes activity in pure enzyme system and in mouse liver, respectively, which were accurate and convenient. It laid the experimental foundation for exploring the different pathophysiological effects of XOR in the body and developing new XOR inhibitors.

Key words

xanthine oxidoreductase / xanthine dehydrogenase / xanthine oxidase / enzyme activity determination / enzyme kinetics / inhibitor

引用本文

陈冬婷, 田金英, 李雪晨, 李江, 叶菲. 黄嘌呤氧化还原酶不同亚型活性测定方法的建立与应用. 药学学报, 2023 , 58 (10) : 3016 -3023 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0389

Dong-ting CHEN, Jin-ying TIAN, Xue-chen LI, Jiang LI, Fei YE. Establishment and application of activity determining methods for different subtypes of xanthine oxidoreductase[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (10) : 3016 -3023 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0389

正文

收起

黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase, XOR) 是人体内生成尿酸的限速酶, 在人类高尿酸血症及痛风的发病中发挥重要作用, 也是目前一线降尿酸药物的作用靶点^[1]。XOR属于黄素蛋白钼辅基脱氢酶家族成员, 在人体中最主要的生物学功能是参与嘌呤分解代谢的最后两步, 即次黄嘌呤(hypoxanthine) 被氧化为黄嘌呤(xanthine) 并进一步氧化为终产物尿酸(uric acid, UA)^{[2, 3]}, 这一过程主要在肝脏中进行, 肝脏也是人体中XOR活性最高的组织。

在哺乳动物中, XOR以两种可以相互转换的亚型存在^{[2, 4]}, 即黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase, XDH) (EC编号1.17.1.4) 和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO) (EC编号1.17.3.2)。除正常生理状态下的转换, 不同病理状态也会加剧XDH向XO的转换, 如化学制剂、内源性有毒物质、缺血或缺氧导致的组织损伤或细胞坏死^{[5, 6]}。两种亚型均可催化嘌呤生成尿酸, 不同在于XDH以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺) 作为电子受体, 催化后生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH), XO以O₂作为电子受体, 催化后生成两种活性氧(reactive oxygen species, ROS): 超氧阴离子(O₂^·-) 和过氧化氢(H₂O₂)。嘌呤代谢紊乱时, XO在催化过程中会产生过量ROS并造成细胞氧化应激损伤^{[7, 8]}, 这也被认为是高血尿酸水平会增加心血管疾病及代谢综合征患病风险的原因之一^{[7, 9, 10]}。分别测定XOR亚型XO、XDH的活性, 对于机体某些病理状态确定、高尿酸血症与其他疾病间关联机制的探索、XOR抑制剂对于亚型的选择性研究等都有重要的意义。

目前, 市售的活性检测试剂盒只能测定样品中XO活性, 不能做到对XDH亚型活性的测定, 且测定的精确度较低。已有文献^{[6, 11, 12]}报道的测定组织XOR的方法须将样品经过复杂的前处理后利用高效液相色谱仪法、同位素法等进行测定, 限制了其方法的使用。本研究则旨在建立一种高效、快捷、准确的XOR及其XO、XDH亚型的活性测定方法, 为探究XOR在机体中不同的病理生理作用、研发新型XOR抑制剂等奠定实验基础。

材料与方法

收起

试剂牛奶来源XOR (色谱纯化型, 批号: SLBQ1517V)、xanthine (批号: 090M0209V) 购自德国默克Sigma-Aldrich公司; UA (批号: A29S11L126459) 购自上海源叶生物科技有限公司; NAD⁺ (批号: B179321337769) 购自美国APExBIO公司; NADH (批号: 092722230214) 购自上海碧云天生物技术有限公司; 别嘌呤醇(allopurinal, 批号: 10160120) 购自阿法埃沙(天津) 化学有限公司。BCA蛋白定量试剂盒(批号: X1357468) 购自美国Thermo Fisher公司; 10 kDa纯化离心管(批号: UFC801024D) 购自美国Millipore公司。所用化学试剂均为分析纯。

动物雄性ICR小鼠, 体重18~22 g, 购自北京维通利华生物科技股份有限公司[合格证号: SCXK (京) 2016-0006], 脱颈处死, 剖开腹腔取出肝脏组织, 冰生理盐水清洗去除血液及结缔组织备用。动物饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物管理中心, 饲养温度为22~25 ℃, 湿度为40%~60%, 光照/黑暗时间各12 h交替, 并给予小鼠自由进食及饮水。所有动物实验按标准操作规程操作, 经过中国医学科学院药物研究所实验动物管理与动物福利委员会审核并批准(批准号: 00003346)。

吸收光谱绘制 取PBS缓冲液(含50 mmol·L^-1磷酸钾缓冲液, 0.1 mmol·L^-1 EDTA, pH 7.80), xanthine、UA、NAD⁺、NADH溶液(均溶于pH 7.80 PBS缓冲液中) 于96孔板分别上样250 μL, 应用多功能酶标仪, 在波长230~400 nm范围内连续读取吸光度(A) 值, 分别绘制吸收光谱。

UA标准曲线绘制 取不同浓度UA溶液于96孔板分别上样250 μL, 在293 nm处读取A值, 拟合A_{293 nm}-C_UA曲线, 得到UA标准曲线方程(公式1)。其中, A_{293 nm}为波长293 nm处的A值, C_UA为UA浓度, a为标准曲线斜率, b为标准曲线截距。

(1)$ A_{293\;{\rm{nm}}}=a·C_{{\rm{UA}}} + b$

NADH标准曲线绘制 取不同浓度NADH溶液于96孔板分别上样250 μL, 在340 nm处读取A值, 拟合A_{340 nm}-C_NADH曲线, 得到NADH标准曲线方程(公式2)。其中, A_{340 nm}为波长340 nm处的A值; C_NADH为NADH浓度; c为标准曲线斜率; d为标准曲线截距

(2)$ A_{340\;{\rm{nm}}}=c·C_{{\rm{NADH}}} + d$

牛奶来源XOR活性测定 体系总体积250 μL, 加入PBS缓冲液(pH 7.80) 220 μL、XOR溶液10 μL、NAD⁺溶液10 μL, 随后加入xanthine溶液10 μL, 加入xanthine后立即在酶标仪中37 ℃反应15 min, 每1 min读取一次293 nm处A值, 绘制A_{293 nm}-t曲线, 选取酶促反应曲线线性反应期内一段拟合直线方程(R² > 0.99), 得到直线斜率即XOR催化生成UA的反应速率V_XOR (ΔA·min^-1)^[13], 通过公式3求得XOR活性。a为公式1中标准曲线斜率。

(3)$ {\rm{XOR活性}} / {\rm{U}}·{\rm{L}}^{-1} = V_{{\rm{XOR}}} /a$

牛奶来源XOR中XO亚型活性测定 根据XO催化反应原理, 体系中加入PBS缓冲液(pH 7.80) 230 μL、XOR溶液10 μL, 随后加入xanthine溶液10 μL开始反应, 反应后绘制A_{293 nm}-t曲线, 拟合得到V_XO, 通过公式4求得XO活性。考察测定体系最适酶及底物浓度、最适pH值。a为公式1中标准曲线斜率。

(4)$ {\rm{XO活性}} / {\rm{U}}·{\rm{L}}^{-1} = V_{{\rm{XO}}} /a$

牛奶来源XOR中XDH亚型活性测定 根据XDH催化反应原理, 加入PBS缓冲液(pH 7.80) 220 μL、XOR溶液10 μL、NAD⁺溶液10 μL, 随后加入xanthine溶液10 μL开始反应, 每1 min读取一次340 nm处A值, 绘制A_{340 nm}-t曲线, 拟合得到XDH催化生成NADH的反应速率V_XDH (等同于XDH催化生成UA的反应速率), 通过公式5求得XDH活性。考察测定体系最适NAD⁺浓度、最适pH值。c为公式2中标准曲线斜率。

(5)$ {\rm{XDH活性}} / {\rm{U}}·{\rm{L}}^{-1} = V_{{\rm{XDH}}} /c$

XOR、XO、XDH活性单位(U) 均定义为每分钟转化1 μmol xanthine为UA所需的酶量。

肝组织XOR及其亚型活性测定 参考牛奶来源XOR及其亚型活性测定方法。按BCA蛋白定量试剂盒说明书测定肝组织样本蛋白浓度, 用以校正酶活性, 以U·gprot^-1作为比活性单位。

统计学分析 实验数据采用平均值±标准差($ \stackrel{-}{x} $±s) 表示, Excel软件t test方法用于组间差异分析, 若P < 0.05则表示组间有显著性差异。GraphPad Prism 8软件log(inhibitor) vs normalized response-variable slop方法用于拟合酶活性半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果

收起

1 牛奶来源XOR及其亚型活性测定方法的建立

体内XOR存在XDH和XO两种亚型, 其中, XDH以NAD⁺作为辅酶, 催化xanthine生成UA和NADH; XO以O₂作为电子受体, 催化xanthine生成UA和ROS。因此, 在生成UA的同时, XDH、XO发挥着不同的生理和病理作用。

1.1 黄嘌呤氧化还原酶XOR活性测定

参照文献^{[6, 14]}方法, 体系内加入XO 3 U·L^-1 (按XO的标示活性计算的理论活性)、xanthine 50 μmol·L^-1、NAD⁺ 50 μmol·L^-1进行反应, 测定XOR活性。同时扫描体系内各物质光谱, 以确定UA的特征吸收峰(最大吸收波长) 及各物质光谱相互间的干扰情况。绘制UA标准曲线, 拟合曲线方程。

吸收光谱结果显示(图 1A), UA的特征吸收峰在波长293 nm处, NAD⁺不干扰293 nm处对UA生成的检测, xanthine对UA检测有一定影响, 但随着反应进行xanthine逐渐消耗, UA生成量逐渐增加, 这一干扰也会减弱。在0~125 μmol·L^-1内UA标准曲线(图 1B) 方程为A_{293 nm} = 0.009 7·C_UA + 0.000 2。

牛奶来源XOR活性测定结果显示, XOR催化xanthine生成UA的反应曲线在0~8 min内处于线性反应区(图 1C), 可用于拟合V_XOR, 测得XOR活性为3.33 ± 0.15 U·L^-1。

1.2 黄嘌呤氧化酶XO活性测定

XO以O₂作为电子受体催化xanthine生成UA, 根据催化反应原理, 体系内加入酶与底物进行反应, 可在波长293 nm处测定XO活性。为确定适合XO活性测定的底物浓度及可测酶活性范围, 选择体系温度37 ℃, pH 7.80, 反应时间0~15 min, 当XO分别为1、3、9、27 U·L^-1时(按XO的标示活性计算的理论活性), 分别测定xanthine为25、50、75、100 μmol·L^-1时XO的活性。

系列酶促反应曲线中, 当XO理论活性为3 U·L^-1, 催化各浓度xanthine反应时, 起始时均具有1~2 min延滞期, 随后有不同长度的线性反应区, 可用于拟合线性反应速率, xanthine 50 μmol·L^-1时XO测定活性与理论活性最接近(表 1)。当xanthine浓度为50 μmol·L^-1, XO理论活性为1、3、9 U·L^-1时, 线性反应区分别为2~15、2~9、0~4 min (图 2A~C), XO测定活性与理论活性接近(表 1); XO理论活性为27 U·L^-1时, 反应曲线线性区域过短, 测得XO活性较理论值误差大(图 2D、表 1)。所以, 当体系温度37 ℃, pH 7.80, XO活性测定底物xanthine最适浓度为50 μmol·L^-1, 拟合2~4 min段反应速率计算XO活性, 可测酶活性范围为1~9 U·L^-1。

为确定XO催化反应最适pH值, 选择体系温度37 ℃, XO 3 U·L^-1, xanthine 50 μmol·L^-1, 反应时间0~15 min, 在pH为6.50、7.00、7.80、8.50时分别测定XO活性。结果显示, 在pH为6.50、7.00、7.80、8.50时, 线性反应区分别为1~15、1~12、1~10、1~10 min (图 2E), 均拟合2~4 min段反应速率计算XO活性, 当pH值为7.80时测得XO活性最接近理论值, 为3.02 ± 0.04 U·L^-1 (图 2F), 所以XO活性测定的最适pH值为7.80。

综上, XO活性测定的最适条件是: 反应体系总体积250 μL, 含PBS缓冲液(pH 7.80), 底物xanthine 50 μmol·L^-1 (终浓度), 37 ℃反应, 连续测定波长293 nm处A值, 拟合2~4 min段反应速率计算XO活性, 可测活性范围为1~9 U·L^-1。

1.3 黄嘌呤脱氢酶XDH活性测定

XDH以NAD⁺作为电子受体催化生成UA的同时生成NADH。其中, UA在波长293 nm处有特征吸收峰; NADH在波长340 nm处有特征吸收峰(图 3A)。因此, 体系内加入酶、底物、NAD⁺进行反应, 可分别在波长293和340 nm处测定XOR及XDH活性。

体系内NAD⁺大于100 μmol·L^-1时会对293 nm处UA检测造成干扰, NADH为100 μmol·L^-1时对293 nm处UA检测影响较大; 体系内物质基本不干扰340 nm处NADH的检测。在0~100 μmol·L^-1内NADH标准曲线(图 3B) 方程为

$A_{{\rm{340\;nm}}} = 0.004\;7·C_{{\rm{NADH}}} - 0.000\;7。$

为确定XDH与XOR活性测定的最适NAD⁺浓度, 选择体系温度37 ℃, pH 7.80, XO 3 U·L^-1, xanthine 50 μmol·L^-1, 反应时间0~15 min, 分别测定NAD⁺为5、10、50、100、200 μmol·L^-1时XDH及XOR活性。

在测定XDH活性时, 当NAD⁺为5、10 μmol·L^-1时, 测定时间范围内A_{340 nm}-t曲线线性不佳, 当NAD⁺为50、100、200 μmol·L^-1时, A_{340 nm}-t曲线线性反应区分别为1~10、1~12、1~15 min (图 4A), 均拟合2~4 min段反应速率, 计算得XDH活性接近。在测定XOR活性时, 当NAD⁺为5、10、50 μmol·L^-1时, A_{293 nm}-t曲线线性反应区均为1~10 min (图 4B), 均拟合2~4 min段反应速率, 计算得XOR活性接近, 且明显高于NAD⁺为100、200 μmol·L^-1时测得的XOR活性(图 4C), 可能与高浓度NAD⁺在293 nm的干扰有关(图 3A)。所以, XDH及XOR活性测定的最适NAD⁺浓度为50 μmol·L^-1。

为确定XDH及XOR催化反应的最适pH值, 选择体系温度37 ℃, XO 3 U·L^-1, xanthine 50 μmol·L^-1, NAD⁺ 50 μmol·L^-1, 反应时间0~15 min, 在pH为6.50、7.00、7.80、8.50时分别测定XDH及XOR活性。

在测定XDH活性时, 当pH为6.50时, 测定时间范围内A_{340 nm}-t曲线线性不佳, 其余3个pH时的A_{340 nm}-t曲线线性反应区均为1~9 min (图 4D), 拟合2~4 min段反应速率, 计算得pH 7.80时XDH活性最大。在测定XOR活性时, 当pH为6.50时, A_{293 nm}-t曲线线性反应区为1~15 min, 其余3个pH时的A_{293 nm}-t曲线线性反应区均为1~10 min (图 4E), 拟合2~4 min段反应速率, 计算得pH为7.00、7.80、8.50时XOR活性接近, 且明显高于pH为6.50时的XOR活性(图 4F)。所以, XDH及XOR活性测定的最适pH值为7.80。

为确定XDH及XOR活性可测范围, 以体系温度37 ℃, pH 7.80, XO 3 U·L^-1, xanthine 50 μmol·L^-1, NAD⁺ 50 μmol·L^-1时测得XDH及XOR活性为基准, 考察XDH及XOR理论活性与其催化反应速率的线性关系, 结果如图 5所示。XOR活性可测范围为0.97~17.5 U·L^-1, XDH活性可测范围为66~1 191 mU·L^-1。

综上, XDH及XOR活性测定的最适条件是: 反应体系总体积250 μL, 含PBS缓冲液(pH 7.80), 底物xanthine 50 μmol·L^-1 (终浓度), NAD⁺ 50 μmol·L^-1 (终浓度), 37 ℃反应, 连续测定波长340 nm处A值, 拟合2~4 min段反应速率计算XDH活性, 可测定活性范围为66~1 191 mU·L^-1; 连续测定波长293 nm处A值, 拟合2~4 min段反应速率计算XOR活性, 可测定活性范围为0.97~17.5 U·L^-1。

1.4 别嘌呤醇对牛奶来源XOR及其亚型活性抑制

应用已建立的牛奶来源XOR及其亚型XO、XDH酶活性测定方法, 观察XOR抑制剂别嘌呤醇的抑制作用。结果如图 6所示, 别嘌呤醇对牛奶来源XOR、XO、XDH活性均具有明显抑制作用, 其抑制XOR、XO、XDH活性IC₅₀值分别为4.95×10^-6 (图 6A)、3.18×10^-6 (图 6B)、4.57×10^-6 mol·L^-1 (图 6C)。

2 小鼠肝组织XOR及其亚型活性测定方法的建立

2.1 肝组织样品制备

用预冷PBS缓冲液(pH 7.80) 制备4%肝匀浆, 离心(4 ℃, 50 000 ×g, 30 min) 去掉大分子物质; 取4 mL上清液转入10 kDa纯化离心管, 离心(4 ℃, 4 800 ×g, 20 min), 得到 > 10 kDa截留液(LS1) 及 < 10 kDa滤过液(LS2)。参考牛奶来源XOR活性测定条件, 体系温度37 ℃, pH 7.80, xanthine浓度50 μmol·L^-1, NAD⁺浓度50 μmol·L^-1, 上样10 μL, 反应时间0~15 min, 分别测定LS1及LS2中的XOR活性。结果显示(图 7), LS2不能催化产生UA; LS1可得到与牛奶来源XOR催化反应类似的反应曲线, 拟合2~4 min段反应速率, 计算得XOR活性为1.67 ± 0.09 U·gprot^-1。说明小鼠肝组织XOR酶存在于LS1中。

2.2 肝组织XO活性测定

为确定XO活性测定最适xanthine浓度, 选择体系温度37 ℃, pH 7.80, LS1上样10 μL (含蛋白0.86 g·L^-1), 分别测定xanthine为25、50、75、100 μmol·L^-1时XO活性(拟合2~4 min反应速率后计算所得)。当xanthine为75、100 μmol·L^-1时测得XO活性基本一致, 分别为0.45 ± 0.05、0.44 ± 0.07 U·gprot^-1, 明显高于xanthine为25、50 μmol·L^-1时的测定值, 分别为0.28 ± 0.19、0.30 ± 0.19 U·gprot^-1, 且反应更稳定。以上结果说明, xanthine为75~100 μmol·L^-1时均适宜测定, 为保证活性可测范围较大, 选择xanthine 100 μmol·L^-1 (终浓度) 为XO活性测定最适浓度。

2.3 肝组织XDH活性测定

为确定XDH及XOR活性测定最适NAD⁺浓度, 选择体系温度37 ℃, pH 7.80, LS1上样10 μL, xanthine 100 μmol·L^-1, 分别测定NAD⁺为25、50、75、100 μmol·L^-1时XDH及XOR活性(拟合2~4 min反应速率后计算所得), 结果如表 2所示。NAD⁺为50、75、100 μmol·L^-1时测得XDH及XOR活性均显著高于25 μmol·L^-1时, 前三者之间测得值无显著性差异。结果说明, NAD⁺为50~100 μmol·L^-1时均适宜测定, 为保证活性可测范围较大, 选择NAD⁺ 100 μmol·L^-1为XDH及XOR活性测定最适浓度。

2.4 小鼠肝组织XOR及其亚型活性测定

小鼠肝组织XO活性测定的最适条件是: 反应体系总体积250 μL, 含PBS缓冲液(pH 7.80), 应用LS1, 底物xanthine 100 μmol·L^-1 (终浓度), 37 ℃反应, 连续测定波长293 nm处A值, 拟合2~4 min段反应速率计算XO活性, 蛋白浓度在0.43~3.44 g·L^-1范围内测得XO活性线性关系良好(图 8), 可测活性范围为0.19~1.08 U·gprot^-1。应用此方法测得正常ICR小鼠肝组织XO活性为0.33 ± 0.13 U·gprot^-1 (n = 7)。

小鼠肝组织XDH及XOR活性测定的最适条件是: 反应体系总体积250 μL, 含PBS缓冲液(pH 7.80), 应用LS1, 底物xanthine 50 μmol·L^-1 (终浓度), NAD⁺ 100 μmol·L^-1 (终浓度), 37 ℃反应, 连续测定波长340 nm处A值, 拟合2~4 min段反应速率计算XDH活性, 可测定活性范围为0.52~3.55 U·gprot^-1 (图 8); 连续测定波长293 nm处A值, 拟合2~4 min段反应速率计算XOR活性, 可测定活性范围为0.67~3.98 U·gprot^-1 (图 8)。应用此方法测得小鼠肝组织XDH及XOR平均活性为0.91 ± 0.33、1.28 ± 0.32 U·gprot^-1 (n = 7)。

2.5 别嘌呤醇对小鼠肝组织XOR及其亚型活性抑制

应用已建立的小鼠肝组织XOR及其亚型XO、XDH酶活性测定方法, 观察XOR抑制剂别嘌呤醇的抑制作用。结果如图 9所示, 别嘌呤醇对小鼠肝脏XOR、XO、XDH活性均具有明显抑制作用, 其抑制XOR、XO、XDH活性IC₅₀值分别为4.31×10^-7 (图 9A)、3.03×10^-7 (图 9B)、2.18×10^-7 mol·L^-1 (图 9C)。

讨论

收起

酶活性测定方法主要为终点法及动力学法两种。终点法是指通过酶催化反应进行至平台期时生成产物的总量来衡量酶的活性, 这一方法的优势是流程步骤少, 操作及数据处理简单, 但缺点在于该方法耗时长, 易受逆反应的影响, 误差较大, 且通常需要特殊物质来终止反应。动力学法是指连续监测酶催化反应中产物或底物的变化, 以产物的生成速率或底物的消耗速率来衡量酶的活性, 此方法的优势是耗时短, 容易观察到整个反应过程的特征, 不需终止酶反应, 测定灵敏度高、结果准确, 但缺点在于该方法操作及数据处理较复杂, 对操作者熟练程度要求高。本研究应用动力学法分别建立了测定牛奶来源(纯酶体系) 和小鼠肝组织XOR及其亚型XO、XDH活性的方法, 并应用上述方法, 分别观察了经典的XOR抑制剂别嘌呤醇对牛奶来源和小鼠肝脏来源XOR及其亚型XO、XDH的抑制活性。

根据XO、XDH亚型催化反应原理, 若体系中只有酶及底物, 不含辅酶NAD⁺, 则只有XO亚型可进行催化反应, 通过在293 nm处检测UA生成, 就可测定XO亚型活性。在酶、底物、NAD⁺同时存在体系中, XDH亚型也可参与反应, 通过在340 nm处检测NADH生成量, 可测定XDH亚型活性; 或在293 nm处检测UA生成量, 可测定XOR总活性。这样就实现了对XDH、XO两种亚型活性以及XOR总活性的检测。

牛奶来源XOR为纯化酶, 应用该酶确定XOR及其亚型活性测定方法的最适底物xanthine浓度、电子受体NAD⁺浓度、pH值、反应时间及可测范围。测定结果显示, 牛奶来源XOR中XO活性占大多数, 约为90%, XDH活性占少数, 约为10%, 这一结果与文献^[15]报道中XOR的生理情况一致, XOR在哺乳动物的乳汁中基本以XO形式存在, 其在催化过程中产生的ROS可起到免疫、杀菌的作用。

小鼠肝脏XOR及其亚型活性测定会受组织中含量及其他物质的干扰, 所以制样流程较为关键。XOR蛋白分子是一个分子量约为300 kDa的同型二聚体, 首先应用超高速离心将大分子物质去除, 随后利用10 kDa超滤离心管去除内源性底物、杂蛋白等影响酶活性的小分子物质, 同时可对样品进行浓缩, 在LS1中成功检测到较高的XOR活性。该方法在保证测定结果准确的前提下, 充分简化了组织XOR活性测定中复杂的制样流程^[11]。最后, 本研究确定了小鼠肝脏XOR及其亚型活性测定方法的最适底物xanthine浓度、电子受体NAD⁺浓度以及各种酶的可测定范围。应用所建方法测得正常ICR小鼠肝脏XOR活性与文献^[12]报道接近, XO与XDH活性比例约为1∶3, XDH占较大比例, 这一情况与文献^[6]报道一致。

应用本方法测得的别嘌呤醇抑制牛奶来源XOR的IC₅₀值为4.95×10^-6 mol·L^-1, 抑制小鼠肝脏来源XOR的IC₅₀值为4.31×10^-7 mol·L^-1, 两者相差一个数量级, 与文献^[16]报道一致。这可能是不同种属XOR的蛋白结构差异导致的^[17], 也可能是牛奶来源XOR与小鼠肝脏XOR测定体系中酶活性存在差异导致的。此外, 别嘌呤醇对XO、XDH两亚型的抑制活性无选择性, 所得结论与文献^[18]报道一致。

综上所述, 本研究分别建立了牛奶来源(纯酶) 及小鼠肝组织XOR及其亚型XDH、XO活性的测定方法, 该方法方便快捷、灵敏度高、数据准确可靠, 对探究XOR在机体中不同的病理生理作用、探索高尿酸血症与其他疾病间关联的机制以及研发新型XOR抑制剂, 奠定了实验基础。以本研究为基础, 后续将进一步探讨这一测定方法在血清XOR及其亚型活性检测中的应用, 以拓展该方法的应用范围, 丰富其应用前景。

作者贡献: 陈冬婷设计并完成实验、分析数据、撰写论文; 田金英、李雪晨、李江提供学术指导; 叶菲设计实验并审核论文。

利益冲突: 无利益冲突。

基金

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中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2021-I2M-1-029)
中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2022-I2M-1-020)
中国药学会-以岭生物医药创新基金(CPA-B04-ZC-2021-005)
国家自然科学基金青年科学基金项目(22107121)

参考文献

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文献

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2023年第58卷第10期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0389

接收时间：2023-03-30
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-10-12

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收稿日期：2023-03-30
修回日期：2023-05-05

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中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2022-I2M-1-020)

中国药学会-以岭生物医药创新基金(CPA-B04-ZC-2021-005)

国家自然科学基金青年科学基金项目(22107121)

作者信息

1.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京新药机制与药理评价研究重点实验室, 北京 100050

2.中国医学科学院糖尿病研究中心, 北京 100050

通讯作者:

*叶菲, Tel: 86-10-83150495, E-mail: yefei@imm.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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