药学学报

SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂的研究进展

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杨娩玲 ^# , 程玉森 ^# , 宋乐天 , 叶冰 , 高升华 ^* , 刘新泳 ^* , 展鹏 ^*

药学学报 | 综述 2023,58(9): 2581-2600

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药学学报 |综述 2023 , 58 (9) : 2581 -2600

SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂的研究进展

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杨娩玲^#, 程玉森^#, 宋乐天, 叶冰, 高升华^*, 刘新泳^*, 展鹏^*

作者信息

山东大学药学院药物化学研究所, 化学生物学教育部重点实验室, 山东济南 250012

通讯作者:

*高升华, E-mail: shh_gao@163.com;

刘新泳, E-mail: xinyongl@sdu.edu.cn;

展鹏, E-mail: zhanpeng1982@sdu.edu.cn

Research progress of SARS-CoV-2 main protease inhibitors

Mian-ling YANG, Yu-sen CHENG, Le-tian SONG, Bing YE, Sheng-hua GAO^*, Xin-yong LIU^*, Peng ZHAN^*

Affiliations

Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China

出版时间: 2023-09-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1364

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摘要

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主蛋白酶(main protease, M^pro) 作为冠状病毒种间相似性极高的共有蛋白酶, 且高度保守, 是病毒复制过程中不可或缺的蛋白水解酶, 因此是抗SARS-CoV-2药物设计的重要靶标。本文针对新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂进行全面综述, 涵盖化学结构、抗病毒活性与成药性、结合模式与构效关系等。

关键词

新冠感染 / 新型冠状病毒 / 主蛋白酶 / 主蛋白酶抑制剂 / 药物设计

Abstract

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As a common protease with high similarity among coronavirus species, the main protease (M^pro) of SARS-CoV-2 is responsible for the catalytic hydrolysis of viral precursor proteins into functional proteins, which is essential for coronavirus replication and is one of the ideal targets for the development of broad-spectrum antiviral drugs. This paper reviews the main protease inhibitors of SARS-CoV-2, including their molecular structures, potencies and drug-like profiles, binding modes and structure-activity relationships, etc.

Key words

COVID-19 / SARS-CoV-2 / main protease / main protease inhibitor / drug design

引用本文

杨娩玲, 程玉森, 宋乐天, 叶冰, 高升华, 刘新泳, 展鹏. SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂的研究进展. 药学学报, 2023 , 58 (9) : 2581 -2600 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1364

Mian-ling YANG, Yu-sen CHENG, Le-tian SONG, Bing YE, Sheng-hua GAO, Xin-yong LIU, Peng ZHAN. Research progress of SARS-CoV-2 main protease inhibitors[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (9) : 2581 -2600 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1364

正文

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冠状病毒(coronavirus, CoVs) 是一类广泛存在、可感染人畜并引起严重急慢性呼吸道系统疾病的病原体^[1]。冠状病毒科分为α、β、γ、δ四个属, 目前已知有7种冠状病毒可引起人类疾病, 分别为HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。其中SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2具有高致病性, 对人类生命健康有较大的威胁^[2]。新型冠状病毒感染(coronavirus disease 2019, COVID-19) 是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 引起的急性呼吸道传染病^{[3, 4]}, 截至2023年3月中旬, 全球范围内报告确诊病例总数近7.6亿例, 死亡总人数超过687万^[5], 新型冠状病毒感染对全球的公共卫生体系和经济生产造成了重大影响。SARS-CoV-2主要通过受感染者呼吸或咳嗽时排出的飞沫传播, 感染者可能无症状或出现常见的新冠感染症状, 包括发热、咳嗽、疲劳、呼吸短促和嗅觉丧失^[6]。重症病例可能的并发症包括肺炎、急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭和死亡^[7]。随着中国《新型冠状病毒肺炎防控方案(第九版)》的发布, 疫情防控措施逐渐调整。直接靶向新冠病毒的有效药物是老年人、重症患者及受基础病困扰的人群的迫切需求。

SARS-CoV-2是一种单股正链RNA病毒, 其复制周期分为侵入、转录、复制、组装和分泌等几个阶段^[8] (图 1)。首先, 病毒颗粒与细胞附着因子结合, 并与细胞受体(血管紧张素转化酶2, ACE2) 和宿主因子(细胞表面丝氨酸蛋白酶, TMPRSS2) 发生特异性相互作用, 促进病毒在细胞膜或内体膜上的摄取和融合; 进入宿主细胞后释放出病毒遗传物质RNA, 并附着在宿主核糖体上; 宿主核糖体将开放阅读框ORF1a/b翻译成两个多聚蛋白pp1a和pp1ab, 随后经木瓜样蛋白酶(papain-like protease, PL^pro) 和主蛋白酶(main protease, M^pro) 切割后产生多种非结构蛋白并形成病毒复制酶-转录酶复合物。病毒基因组的正链RNA转录形成反义负链RNA, 并以负链RNA为模板经转录复制形成新的正链RNA。在该过程中病毒的亚基因组mRNA翻译合成其他病毒结构蛋白。经过与病毒基因组的RNA组装形成成熟病毒颗粒, 最后以胞吐的方式释放到细胞外。

理论上, 阻断病毒生命周期重的任一环节, 均可抑制病毒复制^[9]。相较于其他靶标, M^pro具有无可比拟的优点: 在冠状病毒种间相似性极高, 高度保守不易变异, 现有的突变株在M^pro上基本没有突变位点, 主要突变在S蛋白上(故中和抗体类药物的劣势在此); M^pro对病毒至关重要, 如果M^pro缺失, 病毒的复制将无法完成; 与人类蛋白酶的同源性较低, 因此安全性更好。这些优点使M^pro成为业界普遍认可的最理想抗新冠病毒口服特效药靶标。

主蛋白酶也被称为3C样蛋白酶(3C-like proteinase, 3CL^pro), 是一种半胱氨酸蛋白酶, 由两个相互垂直的单体组成的同源二聚体。其中每个单体包括3个结构域, 结构域Ⅰ和Ⅱ由反平行β-桶结构组成, 其之间缝隙中心的Cys145和His41构成了催化二联体, 能特异性识别和切割非结构蛋白nsp4~nsp16的11个裂解位点, nsp4~nsp16主要负责病毒基因组复制和转录, 在病毒生命周期其他过程中也发挥重要作用, 如蛋白质翻译、切割、修饰和核酸合成^[10]。M^pro的活性口袋位于结构域Ⅰ和Ⅱ之间的裂隙中, 由4个口袋(S1、S1′、S2、S4) 组成。早在2003年, Yang等^[11]就成功解析了SARS-CoV-1 M^pro的晶体结构。新冠疫情暴发后, 该团队于2020年1月成功解析了SARS-CoV-2 M^pro的高分辨率三维结构^[12] (图 2)。基因序列比对显示, SARS-CoV-1与SARS-CoV-2的M^pro有96%的同源性^[13], 且高度保守。因此, M^pro是广谱抗新冠药物研发的理想靶标。

根据新冠主蛋白酶抑制剂的结构类型, 可以分为拟肽类、非拟肽类和天然产物类M^pro抑制剂。本文对抑制剂的结构、活性、设计思路及优缺点进行了综述, 概述了自2020年以来最具潜力的M^pro抑制剂的研究现状, 为抗新冠感染药物的研发提供参考。

1 拟肽类抑制剂

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根据抑制剂与M^pro的作用模式, 拟肽类抑制剂可分为非共价和共价拟肽类抑制剂。拟肽类非共价抑制剂是通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用等与配体结合, 非共价抑制剂通常选择性更强, 毒性较低。拟肽类共价抑制剂的作用机制通常包括两个步骤, 首先是模拟天然肽底物的拟肽体与M^pro结合并形成非共价复合物, 共价弹头在空间上非常接近M^pro活性位点的催化残基, Cys145的巯基通过亲核进攻弹头以形成共价键。即先通过非键相互作用结合到蛋白表面, 随后再发生化学反应形成共价键。这些弹头主要有Michael受体、醛酮、氰基和α-酮酰胺等^[14]。下文根据弹头的种类对拟肽类M^pro抑制剂分类描述。

1.1 以醛基为弹头的拟肽类M^pro抑制剂

化合物1是一种用于治疗猫感染性腹膜炎的二肽蛋白酶抑制剂。2020年, Ma等^[15]将建立的基于荧光共振能量转移(FRET) 的酶促分析方法应用于SARS-CoV-2 M^pro抑制剂的筛选中, 发现化合物1展现出优异的抗SARS-CoV-2 M^pro活性(IC₅₀ = 0.030 μmol·L^-1), 同时在Vero E6细胞中也具有显著的抗病毒效果(EC₅₀ = 3.37 μmol·L^-1), 且细胞毒性较低(CC₅₀ > 100 μmol·L^-1)。1的作用机制如图 3A所示, 其首先转化为肽醛化合物2, 后者与Cys145的巯基形成C-S共价键来抑制M^pro。SARS-CoV-2 M^pro与1的复合物共晶结构表明(图 3B、C), 化合物1占据了主蛋白酶底物结合口袋的4个空腔, 以半硫缩醛形式共价结合到SARS-CoV-2 M^pro的Cys145上, 氨基甲酸酯键与Glu166的主链和Gln189的侧链形成氢键。P1位的谷氨酰胺替代物与His164和Glu166的侧链形成氢键, 而内酰胺环的N原子与Glu166侧链及Phe140的主链形成氢键。

2020年, 上海药物研究所柳红团队^[16]在多年抗EV71病毒药物研究经验的基础上, 发现了两个高活性拟肽类共价SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂化合物3和4 (图 4A), 它们在体外均展现出对主蛋白酶极佳的抑制活性, IC₅₀值分别达到0.053和0.040 μmol·L^-1, 同时在Vero E6细胞中也具有显著的抗SARS-CoV-2效果(EC₅₀分别为0.53和0.72 μmol·L^-1), 且细胞毒性较低(CC₅₀ > 100 μmol·L^-1)。为了探究其与M^pro的作用机制, 该团队解析了SARS-CoV-2 M^pro与化合物3的复合物晶体结构(1.5 Å, 图 4B)。结果显示3的醛基弹头和Cys145的硫原子形成1.8 Å的C-S共价键。在S1位点, 内酰胺的氧原子与His163的咪唑环形成氢键, NH基团与Phe140的主链形成氢键。P2处的环己基与Met49、Tyr54、Met165、Asp187和Arg188存在多个疏水作用, 并与占据S2口袋的His41的咪唑环具有π-π堆积作用。P3处的吲哚基团暴露于溶剂中, 与Glu166形成关键氢键, 并与Pro168和Gln189形成疏水作用。进一步研究表明化合物3在小鼠体内具有良好的体内药代动力学性质, t_1/2为4.27 h (腹腔注射), 生物利用度为87.8%, 代谢稳定性良好(CL = 17.4 mL·min^-1·kg^-1), 优于化合物4。随后, 在SD大鼠和比格犬中对化合物3进行了急性毒性研究, 未见明显毒性, 表明其是具有临床价值的候选化合物。

由于化合物3对主要流行的SARS-CoV-2变异病毒株阿尔法、贝塔、德尔塔、奥密克戎均具有高效广谱抑制活性, 且无需联合药代动力学增强剂(如ritonavir等), 可以减少因使用药代动力学增强剂出现的潜在药物相互作用风险。2021年3月, bofutrelvir, 即化合物3, 在美国启动Ⅰ期临床研究, 目前已获批开展国际多中心Ⅱ/Ⅲ期临床试验。2022年11月23日前沿生物披露, 雾化吸入用bofutrelvir, 拟用于治疗轻型、普通型新冠肺炎患者的Ⅱ/Ⅲ期临床试验方案^{[17, 18]}。

2020年, Ma等^[15]基于FRET从Selleckchem化合物库中筛选出钙蛋白酶抑制剂Ⅱ (5, 图 5A) 在体外能有效抑制SARS-CoV-2主蛋白酶活性, 其IC₅₀为0.97 μmol·L^-1, 同时在Vero E6细胞中展现出较好的抗病毒效果(EC₅₀ = 2.07 μmol·L^-1, CC₅₀ > 100 μmol·L^-1)。Sacco等^[19]通过解析M^pro与化合物5的共晶结构发现亲电弹头醛基与Cys145以共价键形式结合。与其他以醛基为弹头的肽类抑制剂类似, 5的半硫缩醛占据了由Gly143、Ser144和Cys145的主链酰胺基团形成的氧阴离子孔; P1蛋氨酸侧链占据S1位点且硫原子与His163形成氢键; P2亮氨酸侧链在S2位点中形成疏水作用, 而P3亮氨酸朝向溶剂界面附近的S3位点。钙蛋白酶抑制剂Ⅱ的主链也与M^pro中的His164、Met165的主链之间形成多个氢键(图 5B)。此外, 5还能够有效抑制人组织蛋白酶L的活性, 抑制常数K_i为50 nmol·L^-1, 表明可以针对性设计SARS-CoV-2 M^pro和人类组织蛋白酶L的双靶点抑制剂。

2021年, Qiao等^[20]基于M^pro晶体结构, 利用合理药物设计策略, 以上市药物特拉匹韦(telaprevir) 和波普瑞韦(boceprevir) 的双环脯氨酸片段为骨架, 在S4腔引入多种亲脂基团, 设计并合成了两系列32个包含双环脯氨酸片段的全新结构M^pro小分子抑制剂。活性结果表明大部分化合物在体外均可有效抑制M^pro活性, IC₅₀值在7.6~748.5 nmol·L^-1之间。其中化合物6 (图 6A) 抑制效果最佳, IC₅₀为7.6 nmol·L^-1。通过解析其与M^pro复合物的晶体结构, 发现其醛基与Cys145形成共价键的同时, 醛基的氧原子与Cys145和Gly143的主链酰胺形成两个氢键。P1处的内酰胺环伸向S1腔中, 内酰胺的氧原子和氮原子分别与His163的侧链和Phe140的主链成两个氢键。由于脯氨酸结构中固有的构象限制, 刚性双环脯氨酸采用反式外构象, 伸向S2疏水口袋。在对SD大鼠的PK (药代动力学) 实验中, 化合物7和8则表现出相对良好的PK特性, 口服生物利用度分别为11.2%和14.6%, 具有开发成口服药物的潜力^[21]。化合物7腹腔注射时的t_1/2为4.53 h, 生物利用度为78.0%, 化合物8的t_1/2为3.8 h (腹腔注射), 生物利用度为76.2%, 二者均具有良好的代谢稳定性(CL分别为22.67和17.10 mL·min^-1·kg^-1), 可作为候选药物进一步开发。

1.2 以氰基为弹头的拟肽类抑制剂

辉瑞公司的口服新冠病毒药物paxlovid在临床试验中显示出了巨大的前景, 与安慰剂相比, 在出现症状的5天内给药, 可将因COVID-19住院或死亡的风险降低88%。基于该结果, 美国FDA于2021年12月底批准了paxlovid的紧急使用许可, 用于轻中度新冠肺炎患者的临床治疗^[22]。paxlovid是M^pro抑制剂nirmatrelvir与细胞色素P450酶抑制剂ritonavir的复方制剂, 对Omicron、Delta等变异毒株同样有较好的抑制效果。遗憾的是, 在2022年4月29日, 辉瑞公司对外公布了paxlovid用于暴露后预防的Ⅱ/Ⅲ期临床(EPIC-PEP) 研究情况, 结果显示该药用于成人暴露后预防效果不佳^[23]。

早在2003年SARS暴发时, 辉瑞公司就报道了化合物9 (图 7) 具有抑制SARS-CoV-1 M^pro的活性。由于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2 M^pro在底物结合位点上的序列同源性为100%^[24], 因此9也能有效抑制SARS-CoV-2 M^pro (K_i = 0.271 nmol·L^-1), 同时在Vero E6细胞中也具有显著的抗SARS-CoV-2活性(EC₅₀ = 231 nmol·L^-1)。

针对9的透膜性和口服生物利用度较差这一问题, 研究人员尝试减少P1′位的氢键供体, 并引入氰基和苯并噻唑-2-基酮两种共价弹头^[25]。引入氰基的化合物10在大鼠体内口服吸收显著提高, 代谢稳定性较好, 但对主蛋白酶的抑制作用及体外抗病毒活性均有所降低。在P1′位引入苯并噻唑-2-基酮、P2位引入环状亮氨酸拟肽类似物后得到的11可显著提高透膜性, 但对主蛋白酶抑制作用降低, 主要是由于缺少了与Gln189之间的氢键。为此, 进一步引入甲磺酰胺基团得到的化合物12伸向Gln189下方, 增强与P3口袋残基的结合, 提高与Glu166的氢键作用。与11相比, 化合物12对主蛋白酶的体外抑制活性、抗病毒活性及口服生物利用度均有所提高。通过对P3位端头进行优化, 得到S4口袋为三氟乙酰胺基团的化合物13, 其不但保持了对主蛋白酶的高效抑制作用, 还提高了抗病毒活性、透膜性、代谢稳定性和口服生物利用度。随后, 弹头替换为氰基后得到化合物14, 即nirmatrelvir, 其通过抑制SARS-CoV-2 M^pro的活性而阻断病毒复制。化合物14对M^pro的体外抑制活性得到进一步提高, 同时还增强了抗SARS-CoV-2的活性(EC₅₀值从85.3 nmol·L^-1提升至74.5 nmol·L^-1)、代谢稳定性和口服生物利用度F (大鼠体内的PK实验中, F从33%提升至50%)。通过将14与主蛋白酶共孵育实验证明了14是SARS-CoV-2主蛋白酶的可逆性共价抑制剂。研究者将化合物14确定为临床候选药物, 是由于其易于大规模合成, 且溶解度有所提高, 便于进一步的毒理学研究。此外, P1立体中心的外嵌化倾向有所降低。14与SARS-CoV-2主蛋白酶复合物的晶体结构显示14充分占据S1、S2和S4亚位点, 并与催化残基Cys145共价结合(图 8)^[26]。

1.3 以酮酰胺为弹头的拟肽类抑制剂

2020年3月, 吕贝克大学Rolf团队^[27]解析了SARS-CoV-2 M^pro的晶体结构(分辨率1.75 Å)。此外, 该研究还探讨了一种α-酮酰胺抑制剂的作用。在前期工作中, 研究人员鉴定了拟肽类α-酮酰胺可作为α和β冠状病毒M^pro广谱抑制剂。其中, 化合物15 (图 9A) 在Huh7细胞中抗MERS-CoV效果最佳。在此基础上, 为了延长化合物半衰期, 研究人员对15进行了修饰, 将P3-P2酰胺键隐藏在吡啶酮环中。此外, 为增加化合物在血浆中的溶解度并减少其与血浆蛋白的结合, 再用疏水性较低的Boc基团代替了疏水的肉桂酰基, 得到化合物16。为了增强抗SARS-CoV-2活性, 用较小的环丙基替代了P2环己基, 得到化合物17, 但广谱性欠佳。化合物17和SARS-CoV-2 M^pro复合物晶体结构表明, 由于Cys145的巯基对17酮羰基的亲核进攻, 形成了硫代半缩酮。硫代半缩酮通过与残基His41形成氢键而稳定在氧阴离子空穴中, 酰胺氧作为氢受体基团与Gly143、Cys145和Ser144形成氢键。S1位点通过与Phe140和Glu166羧酸的氢键结合容纳内酰胺环, 羰基氧与His163的咪唑环形成氢键, 而吡啶酮环的羰基氧与Glu166主链的酰胺形成氢键(图 9B)。

化合物16和17的药代动力学研究表明, 17的ADME参数与16类似, 与人血浆蛋白的结合率为90%。同时, 其在血浆中的平均保留时间延长至2.7 h, 半衰期约为1.8 h。与16相比, 17在血浆中的清除速度较慢。此外, 研究人员监测了17的肺组织水平, 4 h后, 发现其在小鼠肺组织中浓度仍达到13 ng·g^-1。鉴于COVID-19对肺部有较大影响, 故16和17体现出的这种肺向性是有益的。除皮下给药外, 研究者还使用吸入装置以3 mg·kg^-1对小鼠进行了雾化给药。24 h后, 小鼠肺组织中存在17的浓度为33 ng·g^-1。实验结果表明吸入耐受良好, 小鼠未显示任何不良反应, 这表明了化合物17用于肺部给药的可行性。

Ma等^[15]通过基于FRET的酶分析, 对已上市和在研的蛋白酶抑制剂进行筛选, 发现抗丙肝药物boceprevir (18) 和calpain inhibitors Ⅻ (19, 图 10) 具有较好的主蛋白酶抑制活性。利用酶动力学研究、热位移结合试验和生物质谱进一步表征了两种化合物与SARS-CoV-2 M^pro的结合。研究显示, 18和19抑制SARS-CoV-2 M^pro的IC₅₀值分别为4.13和0.45 μmol·L^-1, 细胞水平抗病毒活性的EC₅₀分为1.31和0.49 μmol·L^-1。前期研究表明钙蛋白酶抑制剂Ⅱ和Ⅻ也对人类组织蛋白酶L (一种对病毒入侵非常重要的宿主蛋白酶) 有活性^[17]。因此, calpain Ⅻ抑制剂对M^pro和组织蛋白酶具有双重抑制作用。由于boceprevir是已上市药物, 在剂量、不良反应和药动学方面均存在大量已知数据, 故可加速其用于SARS-CoV-2治疗的研发进程。

1.4 以苯并噻唑基酮为弹头的拟肽类抑制剂

2013年, Thanigaimalai等^[28]针对SARS-CoV-1 M^pro设计合成了一系列以苯并噻唑基酮为弹头的拟肽化合物, 并且通过对P3位置的刚性取代基变换, 得到了化合物20~23 (图 11A、B)。该系列化合物对SARS-CoV-1 M^pro显示出较好的活性, 其中化合物23的K_i值为6.3 nmol·L^-1。鉴于SARS-CoV-2与SARS-CoV-1的M^pro有96%的基因同源性, 故当新冠疫情暴发后, 研究者发现23可以有效阻断SARS-CoV-2的复制^[29], 其K_i值为34.7 nmol·L^-1。为了探究23与M^pro的结合模式, 研究者解析了其与SARS-CoV-2 M^pro的复合物的共晶结构(分辨率1.65 Å, 图 11B), 晶体结构分析表明, 23以非共价结合形式充分占据底物结合口袋, Cys145在P1′位与羰基碳形成四面体半硫酮键, 同时与主链氨基酸形成多个氢键作用, P1位置的吡咯烷的羰基和NH分别与His163和Glu166的侧链形成氢键, 苯并噻唑的氮原子和硫原子分别与活性位点周围的水分子和His41形成氢键网络; Gln189的侧链羰基在P2位置与主链的酰胺基形成氢键。随后研究者采用CPE法测定了23对SARS-CoV-2的抑制作用, 研究显示在10 μmol·L^-1浓度下23也能完全阻断病毒的增殖, 且细胞毒性较低(CC₅₀ > 100 μmol·L^-1)。此外23的ADME特征、体内药代动力学及代谢分析等结果表明23是非常值得开发的抗SARS-CoV-2药物的先导化合物。

1.5 以取代甲基酮为弹头的拟肽类抑制剂

2020年, Hoffman等^[30]通过研究甲基酮弹头处的各种取代基对SARS-CoV-2抑制活性的影响, 最终发现化合物24 (图 12A) 强烈抑制主蛋白酶的活性, 其K_i值为0.27 nmol·L^-1。研究者解析了其与SARS-CoV-2M^pro的复合物晶体结构(图 12B), 羟甲基酮弹头部分的羰基碳与M^pro活性位点Cys145形成共价键, 生成四面体甲醇配合物(键长1.8 Å C-S)。该甲醇羟基通过水桥与Cys145的主链NH和Gly143的酰胺NH形成氢键。在S1口袋中, 24的内酰胺羰基与His163的侧链形成氢键, Glu166的主链羰基和NH与24的吲哚片段的NH和C2羰基形成“β-折叠型”氢键, 结构中亲酯性亮氨酸片段结合在由Asp187、Arg188、Gln189、Met49和His41残基形成的疏水S2口袋中并与Gln189侧链形成氢键。抑制剂P1位的NH与His164的主链羰基形成氢键。临床前实验显示24的药代动力学性质良好, 但是其渗透性和口服利用度较低, 难以口服给药。因此Boras等^[31]设计了24的磷酸酯前药化合物25, 实验表明其溶解性更佳。因此, 目前24在临床上是以其前药形式即25对COVID-19住院患者进行静脉治疗。

文献^[32]报道含有α-乙酰氧甲基酮结构的拟肽类共价抑制26和27抑制SARS-CoV-2主蛋白酶的IC₅₀分别为1.5和19.5 nmol·L^-1, 细胞水平抗SARS-CoV-2活性的EC₅₀值分别为21.5和10.1 μmol·L^-1。为进一步提高其抗病毒活性, 对26和27构效关系分析并优化得到28 (图 13), 其IC₅₀值为19.0 nmol·L^-1, EC₅₀值为0.3 μmol·L^-1。此外, 结构生物学研究表明, 28与Cys145共价结合。优化得到的化合物28具有较好的抗SARS-CoV-2活性, 表明其具有成为候选药物的较大潜力。

1.6 以Michael受体为弹头的拟肽类抑制剂

Jin等^[33]基于从头设计的研究策略发现含Michael受体的化合物29 (图 14) 是主蛋白酶的强效抑制剂(k_obs/[I] = 11 300 ± 880 mol·L^-1·s^-1), 并率先解析了SARS-CoV-2 M^pro与29复合物的晶体结构, 结果表明乙烯基的碳原子和Cys145的硫原子之间发生Michael加成, 形成长为1.8 Å的C-S共价键, 证实了化合物29的共价结合模式。

2 非肽类抑制剂

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2.1 共价非肽类M^pro抑制剂

5-氟尿嘧啶(5-FU) 的衍生物carmofur (卡莫氟, 30, 图 15A) 是一种有效的抗肿瘤药物, 用于治疗胃癌、乳腺癌等^{[34, 35]}。2020年, Jin等^[36]通过筛选10 000多个化合物, 发现carmofur体外抑制SARS-CoV-2 M^pro的IC₅₀值为1.82 μmol·L^-1, 在Vero E6细胞内抑制病毒复制的EC₅₀为24.3 μmol·L^-1。30与M^pro的复合物晶体结构表明其结构中脂肪酸的羰基“弹头”与催化位点Cys145形成C-S共价键。此外, 30还通过与氨基酸残基形成大量氢键和疏水作用使化合物稳定结合在主蛋白酶的活性中心。羰基氧占据氧阴离子孔, 与Gly143和Cys145的主链酰胺形成氢键。以延伸构象出现的脂肪酸尾部则占据疏水的S2腔中, 与His41、Asp187和Met165的侧链形成疏水相互作用(图 15B)。该研究也为基于carmofur基本结构而合理设计COVID-19药物提供了相关依据。

维生素K3是维生素K的人工合成形式之一, 又称甲萘醌, 可作为凝血药物和维生素补充剂使用。Wang等^[37]通过FRET法从FDA批准的药物库中筛选发现维生素K3 (31, 图 16) 对SARS-CoV-2 M^pro具有显著抑制活性, IC₅₀为4.78 μmol·L^-1。维生素K3通过醌结构的Michael加成与半胱氨酸的硫醇进行共价结合。此外还发现, 维生素K3的抑酶活性具有时间依赖性, 在3和33 min时, 其IC₅₀值分别为20.96和4.78 μmol·L^-1, K_i和K_inact值分别为112.2 μmol·L^-1和0.305 min^-1, 这一实验结果证实了化合物31可以与M^pro以共价键形式结合。

基于上述结果, 研究者进一步评估了一系列维生素K3类似物对SARS-CoV-2 M^pro的抑制活性, 发现其类似物5, 8-二羟基-1, 4-萘醌(32) 的抑制活性是31的9.8倍, IC₅₀为0.49 μmol·L^-1。此外, 研究者还测定了31和32对SARS-CoV-1 M^pro的抑制活性, 显示对SARS-CoV-1 M^pro呈现出剂量依赖性抑制, IC₅₀分别为10.21和1.75 μmol·L^-1。因此, 31和32具有成为广谱抗冠状病毒药物的潜力。

2020年, 饶子和团队^[33]通过基于结构的药物设计、计算机虚拟筛选和高通量筛选策略, 同时结合其团队前期解析的高分辨M^pro三维结构, 对10 000多个老药、临床药物以及天然活性产物进行筛选, 发现eblesen (依布硒, 33, 图 17) 对主蛋白酶有显著抑制作用。依布硒此前已用于治疗听力障碍等多种疾病的Ⅱ期临床试验(NCT01452607), 并表现出良好的安全性。研究显示其对M^pro的IC₅₀值为0.67 μmol·L^-1, 当浓度为10 μmol·L^-1时, 该化合物在Vero细胞中显示出较强的抗SARS-CoV-2效果(EC₅₀ = 4.67 μmol·L^-1)。结构生物学研究表明, eblesen的硒原子可和M^pro的S1′腔的Cys145形成共价键。目前eblesen作为SARS-CoV-2 M^pro候选药物, 在美国已获批进入Ⅱ期临床试验(NCT04483973、NCT04484025)。同时, Huff等^[38]以eblesen为先导化合物, 运用合理药物设计策略得到一系列苯并硒唑酮类化合物, 其中化合物34在Vero E6细胞中的抗病毒活性较eblesen有较大提升(EC₅₀ = 0.8 μmol·L^-1)。类似的, Amporndanai等^[39]通过对eblesen进行结构修饰, 得到抗病毒活性更优的化合物35, 其对SARS-CoV-2 M^pro的IC₅₀值为0.82 μmol·L^-1, 在Vero E6细胞中的抗病毒活性为1.78 μmol·L^-1。优化得到的化合物34和35抗SARS-CoV-2活性均有所提升, 因此以化合物33为先导, 值得进一步的结构修饰。

2020年, Ma等^[40]利用Ugi四组分反应合成了一系列新型非肽类共价主蛋白抑制剂, 涉及到一些尚未在半胱氨酸蛋白酶抑制剂中被应用的新弹头。其中化合物36和37 (图 18) 活性较好, 抑制SARS-CoV-2 M^pro的IC₅₀值分别为0.43和0.08 μmol·L^-1, 在Vero E6和Caco2-hACE2细胞中显著抑制SARS-CoV-2复制, EC₅₀值在微摩尔至亚微摩尔范围。M^pro与36的共晶结构表明结构中的吡啶环与M^pro的S1口袋中的His163形成氢键, 联苯基团伸向疏水性S2口袋, 并与催化碱His41形成π-π堆积作用; 另外, 吡啶环和α-甲基苯的酰胺片段分别与Glu166的主链形成氢键。这个α-甲基苯基向下翻转到底物通道的核心, 并与联苯基团形成额外的π-π堆积作用, 二氯乙酰胺弹头与Cys145形成共价键。研究人员发现的新型半胱氨酸反应弹头和高靶标特异性的共价M^pro抑制剂, 证明了二卤代和三卤代乙酰胺作为新型半胱氨酸反应弹头的可行性, 有利于进一步开发抗SARS-CoV-2药物。

2.2 非共价非肽类M^pro抑制剂

为了提高发现非共价SARS-CoV-2 M^pro抑制剂的效率, 盐野义公司^[41]综合运用计算机辅助药物筛选, 分析多个主蛋白酶晶体, 构建合适的药效团模型, 采用质谱法对得分前300的化合物进行体外活性筛选, 得到一批苗头化合物(IC₅₀ < 10 μmol·L^-1)。其中, 化合物38 (图 19) 不但对M^pro具有较好的抑酶活性(IC₅₀ = 8.6 μmol·L^-1), 且具有良好的PK特征。接着研究者以化合物38为先导, 首先对其P1′片段进行优化且保持与Thr26的氢键作用, 使其能够更好的契合S1′口袋, 获得了化合物39。39保持了良好的PK特征, 且抑酶活性提高了90倍。接着, 研究者对39的P1酰胺部分用杂环进行取代, 最终得到临床候选药物化合物40, 其抑酶活性的IC₅₀值为13 nmol·L^-1, 细胞水平抑制病毒复制的EC₅₀为0.37 μmol·L^-1。化合物40与M^pro的晶体复合物结构显示, N-甲基三唑环与His163的侧链NH形成氢键, 2, 4, 5-三氟苯环与翻转后的His41形成π-π堆叠作用, 6-氯-2-甲基-吲哚与Thr26主链的NH形成氢键。此外, 40还具有较好的PK特征, 如高代谢稳定性(人和大鼠肝微粒体分别为96%和88%)、高口服生物利用度(F = 97%) 和大鼠体内低清除率(CL = 1.70 mL·min^-1·kg^-1), 在猴和犬体内的t_1/2较长, 分别为10和30 h。化合物40较好的体内代谢性质, 表明其不需要与ritonavir联合用药, 且较高的口服生物利用度, 表明其可以开发为口服药物。此外, 体外实验显示40对SARS-CoV-2的各种变异毒株、SARS-CoV-1、MERS等冠状病毒均有较强抑制活性, 具有广谱抗病毒特性; 且对组织蛋白酶B、L等宿主细胞蛋白酶的抑制活性微弱(IC₅₀ > 100 μmol·L^-1), 表明其对M^pro具有高选择性。综上, 化合物40, 也即ensitrelvir, 是首个非肽类、非共价、可口服的抗SARS-CoV-2临床候选药物。2022年2月, 盐野义宣布已完成ensitrelvir的IIb期临床试验。6月, 日本厚生劳动省理事会以“未表现临床症状改善”等为由, 延缓了其上市批准。次月, 日本政府再次延缓了其上市申请, 专家组认为需要更多的数据支持, 最终于2022年11月22日获得厚生劳动省的紧急监管批准。

Jacobs等^[42]利用针对SARS-CoV-1 M^pro的NIH分子库(约含293 000个化合物), 对其进行高通量筛选, 得到具有较好的抑制活性(IC₅₀ = 2.2 μmol·L^-1) 的二肽化合物41 (图 20A), 在此基础上, 通过Ugi四组分反应快速高效地发现了具有较高活性的化合物42 (IC₅₀ = 4.5 μmol·L^-1, EC₅₀ = 12.9 μmol·L^-1)。基于靶标相似性, 研究人员发现化合物42对SARS-CoV-2 M^pro也具有较好的抑制活性(IC₅₀ = 2.5 μmol·L^-1)^[43]。2021年, Kitamura等^[44]运用基于结构的药物设计策略和Ugi四组分反应, 快速高效地发现了化合物43 (图 20B), 其抑制SARS-CoV-2 M^pro的IC₅₀为0.31 μmol·L^-1, 在Vero E6细胞中抑制SARS-CoV-2复制的EC₅₀为1.27 μmol·L^-1。此外, 结构生物学表明, 43和SARS-CoV-2主蛋白酶为非共价结合, 对主蛋白酶具有较好的选择性。其呋喃环部分占据S1′腔, 甲酰胺羰基与氧阴离子孔的顶端残基Gly143形成氢键, 直接连接在呋喃酰胺部分的是P2联苯基团和P1吡啶环。P2联苯基团伸向S2口袋中, P1吡啶环占据S1口袋。

2021年, 研究人员基于“老药新用”的策略, 通过高通量筛选从1 900种已安全使用的药物中发现了masitinib (44, 图 21), 该药物是一种口服的酪氨酸激酶抑制剂, 能够竞争性抑制新冠病毒主蛋白酶的活性, 从而抑制新冠病毒的复制^[45]。其抑酶活性的IC₅₀值为2.5 μmol·L^-1, 细胞水平抗病毒活性为1.6 μmol·L^-1。为探究44的作用机制, 研究者解析了44和SARS-CoV-2主蛋白酶的复合物结构, 其中44吡啶环的氮原子与S1口袋底部的His163形成氢键, 氨基噻唑环的氨基与His164形成氢键, 疏水性甲基苯环占据S2口袋, 与His41形成了π-π堆积作用, 苯甲酰胺基团远离S4口袋。这表明44是一个非共价的抑制剂, 且能较好地契合主蛋白酶的活性位点, 值得进一步修饰。

Kneller等^[46]通过高通量虚拟筛选发现了哌嗪类SARS-CoV-2主蛋白酶非共价抑制剂化合物45 (图 22A), 其IC₅₀值为0.68 μmol·L^-1, 但未测定其细胞活性和毒性。M^pro与45的共晶结构显示45以非共价形式结合到M^pro的活性位点, 并占据S1和S2亚位点。该配体的尿嘧啶P1基团占据S1亚位点, 连接在P1尿嘧啶和中心哌嗪linker之间的羰基与Gly143形成直接的氢键作用, 芳香族二氯苯P2基团与His41产生π-π堆积作用。随后, 研究者利用计算机模拟契合到M^pro的结构中, 对化合物45的骨架进行修饰。通过改变苯环3、4和5位的取代基对P2基团进行了广泛的修饰, 发现46和47 (图 22B) 抑酶活性较好, 对M^pro的IC₅₀值均为0.29 μmol·L^-1。因此, 化合物45是一个良好的先导化合物, 值得进一步进行结构修饰。

本团队^[47]基于化合物45与主蛋白酶的复合物晶体结构, 运用多位点结合以及优势片段组装策略, 引入现有高活性M^pro抑制剂在各结合口袋的优势基团, 使其同时占据活性中心的多个亚位点, 提高配体与M^pro的亲和力。首先在哌嗪环上引入酰胺基团, 连接优势取代基以占据S4口袋, 筛选得到化合物48 (图 23), 对M^pro抑制活性较好, IC₅₀值为0.40 μmol·L^-1, 但由于该化合物透膜性差, 导致细胞活性较弱(EC₅₀ > 50 μmol·L^-1)。为了改善其透膜性, 将占据S1腔的乳清酸片段用结构多样的优势片段取代, 通过靶标及细胞活性测试、靶标特异性实验、结合模式确证以及初步的成药性评价, 最终发现化合物49有较强的抑酶活性(IC₅₀ = 0.40 μmol·L^-1), 细胞水平抑制SARS-CoV-2的EC₅₀值为1.1 μmol·L^-1, 是上市药物瑞德西韦的3倍左右, 且细胞毒性极低(CC₅₀ > 100 μmol·L^-1)。该化合物对SARS-CoV-2 M^pro具有良好的靶标选择性(对人组织蛋白酶B、F、K和L以及半胱天冬酶3的IC₅₀ > 50 μmol·L^-1)。49与M^pro共晶结构显示, 该分子以非共价形式稳定结合在M^pro催化位点。新引入的酰基噻吩甲胺侧链可额外占据主蛋白酶活性中心的S3、S4亚位点, 与关键氨基酸Glu166的主链形成氢键; S1的吡啶环保留了与His163的关键作用力, 同时有助于提高透膜性。初步成药性研究显示49在大鼠体内半衰期为1.73 h, 口服生物利用度F = 7.2%。以化合物49为代表的非共价非肽类M^pro抑制剂展现出了优异的抗SARS-CoV-2活性及高靶标选择性, 结构生物学信息为进一步的结构优化奠定基础。

Zhang等^[48]基于已建立的荧光共振能量转移实验分析发现了9, 10-二氢菲类非共价SARS-CoV-2 M^pro抑制剂, 尤其以化合物50和51的抑酶活性最强, IC₅₀值分别为1.55和1.81 μmol·L^-1 (图 24)。进一步的酶动力学分析表明, 它们通过混合动力学方式剂量依赖性地抑制M^pro。分子对接模拟揭示了50在二聚体界面和靶标的底物结合腔中的结合模式。此外, 50在胃肠道、人血浆和人肝微粒体中表现较好的代谢稳定性, 表明该化合物具有开发为口服药物的潜力。

2022年, 西湖大学基于DNA编码化合物库的筛选技术(DEL) 发现了一类强效特异性SARS-CoV-2 M^pro非共价抑制剂^[49]。其中化合物52 (图 25) 在体外抑制SARS-CoV-2 M^pro的IC₅₀值为72 nmol·L^-1; 在A549-hACE2细胞中抑制SARS-CoV-2的EC₅₀值为12 nmol·L^-1, 且细胞毒性低(CC₅₀ > 20 μmol·L^-1)。52对SARS-CoV-2突变株也显示出良好活性, 在Caco-2和A549-TMPRSS2-ACE2细胞系统中, 化合物52抑制Delta变异株的EC₅₀分别为21和10 nmol·L^-1, 在Caco-2细胞抗Omicron变异株的EC₅₀为24 nmol·L^-1, 略优于nirmatrelvir。

由于SARS-CoV-1、MERS-CoV与SARS-CoV-2的M^pro之间分别具有96%和50%的序列相似性, 因此对52进行了SARS-CoV和MERS-CoV的M^pro抑制活性测试, IC₅₀分别为55 nmol·L^-1和1 μmol·L^-1。在Calu-3细胞水平上抑制SARS-CoV和MERS-CoV活性的EC₅₀分别为19和53 nmol·L^-1。此外, 52与3种冠状病毒的晶体复合物非常相似, 表明化合物52是一个广谱冠状病毒M^pro抑制剂。52与SARS-CoV-2 M^pro的共晶结果显示, 其异喹啉占据S1空腔, 氮原子和羰基分别与His163和Asn142的侧链形成氢键; 苯环上的硝基和溴分别占据S2和S4空腔, 羰基氧与Glu166的主链酰胺形成氢键; 苯环和Gln189侧链的氨基-π相互作用有助于提高52的结合力, 硝基的强吸电子能力使芳香环带正电荷, 从而增强了氨基-π相互作用, 也增加了溴和Thr190羰基之间的卤键强度。研究者以小鼠模型评价了化合物52体内抗SARS-CoV-2的活性, 结果显示, 在K18-hACE2转基因小鼠实验中, 其活性与nirmatrelvir相当。但药代动力学研究表明, 52需要与CYP3A4抑制剂利托那韦联合使用。目前, 化合物52已完成临床前研究, 2022年9月6日获国家药品审评中心批准正式进入临床试验。

3 天然产物类抑制剂

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中药在治疗新冠感染当中起着至关重要的作用。由于中药的安全性和在预防中的独特作用, 在此次疫情中对患者采用中西医结合的方式, 能够缩短患者的病程和减少重症的发生率^[50-52]。然而, 人们对于中药活性成分是如何抑制新冠病毒的分子机制并不了解。紫草素属于萘醌类化合物, 是中药紫草根的主要活性成分, 具有抗病毒、抗菌、抗炎和抗肿瘤的作用^{[53, 54]}。靶标活性测试表明紫草素抑制主蛋白酶的IC₅₀为15.75 μmol·L^-1 ^[33]。2020, SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体结构被报道^[55], 揭示了中药活性成分紫草素(53, 图 26) 抑制新冠病毒M^pro的分子机制, 发现紫草素以非共价形式结合在活性中心的S1、S2和S3口袋中, 其萘醌基团位于催化活性位点His41和Cys145之间, 与His41形成π-π相互作用, 紫草素尾部异己烯侧链的羟基和甲基分别与S3位的Arg188和Gln189形成氢键相互作用。

2020年, 许叶春课题组^[56]报道了黄芩苷和黄芩素作为SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂。该课题组首先利用FRET法测定了黄芩水提物对新冠病毒M^pro的抑制活性, 发现其中两个组分在10.0 μg·mL^-1时具有显著抑制作用, 而这两个组分中主要化合物分别为黄芩苷(54, 图 27) 和黄芩素(55)。进一步测定黄芩苷和黄芩素单体抑制SARS-CoV-2主蛋白酶的IC₅₀分别为6.41和0.94 μmol·L^-1, 同时ITC和HRMS确证了黄芩苷和黄芩素以非共价形式特异性地与M^pro结合。随后又解析了55与SARS-CoV-2 M^pro复合物的晶体结构, 揭示了其独特的作用模式。共晶结构中的3个酚羟基分别与Leu141、Gly143的主链和Ser144、His163的侧链形成了多重氢键, 与Gln189、Arg188、Met49、Cys44、His41等残基形成了疏水相互作用。55作用于主蛋白酶底物结合口袋中的核心位置, 并与两个催化残基、氧离子空穴、Glu166和S1、S2位点等相互作用, 而这些都是识别底物及类肽抑制剂的关键残基和位点。细胞水平抗病毒结果显示, 54和55对SARS-CoV-2的复制均呈剂量依赖性抑制, EC₅₀分别为10.27和1.69 μmol·L^-1。活性数据表明55具有更好的抗SARS-CoV-2活性, 是一个较有潜力的先导化合物。

受黄芩苷和黄芩素类新冠主蛋白酶抑制剂研究的启发^[56], 2021, 研究者^[57]对黄酮类天然产物进行筛选后发现了两个SARS-CoV-2主蛋白酶的强效小分子抑制剂——杨梅素(56, 图 28) 和二氢杨梅素(57), IC₅₀分别为0.63和1.14 μmol·L^-1。SARS-CoV-2 M^pro与杨梅素复合物的晶体结构表明(图 29), Cys145的巯基和邻苯三酚基团的C6原子形成C-S共价键, 羟基与Thr26的主链之间形成氢键, 色酮部分与Glu189和His164的侧链形成氢键。

尽管杨梅素和黄芩素均是SARS-CoV-2 M^pro抑制剂, 且它们都具有类黄酮骨架和邻苯三酚基团, 但它们与蛋白酶结合的相关作用模式和结构决定因素却迥异。具体来说, 黄芩素是非共价抑制剂, 而杨梅素与催化位点的Cys145建立C-S共价键。黄芩素的邻苯三酚基团与Leu141、Gly143的主链以及Ser144的侧链形成多个氢键, 固定了氧阴离子环的构象, 其用于稳定蛋白质水解反应的四面体过渡状态。而杨梅素的邻苯三酚基团作为亲电体与Cys145共价结合。基于杨梅素的结合模式, 研究者^[57]设计了一系列杨梅素衍生物58~61, 其中59具有较好的抗病毒活性, 且口服生物利用度达18.1%, 具有作为口服药物开发的潜力。

靛红, 又名2, 3-吲哚醌或二氢吲哚-2, 3-二酮, 是一种从菘蓝属植物中提取出的常见天然小分子化合物, 在抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗结核等方面具有重要药理活性^{[58, 59]}。2006年, Zhou等^[60]运用基于靶标的药物设计策略合成一系列靛红衍生物, 其中, 化合物5f (62, 图 30) 抑制SARS-CoV-1主蛋白酶的IC₅₀为0.37 μmol·L^-1, 且其对木瓜蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶均无抑制作用, 选择性较高。由于SARS-CoV-2与SARS-CoV-1的M^pro有96%序列同源性, 受此启发, Liu等^[61]发现62抑制SARS-CoV-2主蛋白酶的IC₅₀为0.045 μmol·L^-1。为进一步提高其抗病毒活性, 研究者又根据靶标结构设计合成了一系列新化合物, 其中化合物63和64活性较好, 其IC₅₀分别为0.053和0.047 μmol·L^-1。化合物62~64的抑酶活性均达到了纳摩尔级别, 但靛红类化合物均存在细胞毒性大等问题, 因此, 有待进一步进行改造以降低细胞毒性。

冬凌草甲素是冬凌草的主要成分, 具有抗肿瘤、抗炎、神经保护及抗菌等多种药理活性^{[62, 63]}, 临床应用广泛。2022年, Zhong等^[64]从中草药小分子库中发现冬凌草甲素(65, 图 31) 可直接抑制SARS-CoV-2 M^pro的活性, 其IC₅₀为2.16 μmol·L^-1。主蛋白酶与65复合物的晶体结构表明其与主蛋白酶的Cys145发生亲核加成反应, Cys145上的巯基作为亲核基团与冬凌草甲素上的α, β-不饱和烯烃发生化学反应, 形成C-S共价键, 以此导致主蛋白酶失活, 从而达到抑制病毒的目的。

4 总结与展望

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新冠疫情自暴发以来, 肆虐全球, 虽然已批准多种疫苗上市, 然而因为病毒变异及疫苗保护效力等原因, 疫情形势依然十分严峻, 因此, 迫切需要开发出抗新冠药物以应对目前及未来可能暴发的疫情^[65]。其中, 小分子口服药物具有无可比拟的优势, 被寄予厚望。

SARS-CoV-2的复制是一个复杂、连续多步的过程, 其中发挥重要作用的蛋白酶M^pro, 是治疗冠状病毒感染的关键药物靶标。迄今为止, 科学家们已解析了数百个小分子与SARS-CoV-2 M^pro的晶体结构, 为基于靶标的精准药物设计提供了丰富的信息。

与传统的非共价抑制剂相比, 共价抑制剂具有延长药效、提高活性以及降低给药剂量的显著优势。因此, 可以预见共价结合将成为SARS-CoV-2 M^pro的抑制剂的重要方向。当前, 向非共价M^pro抑制剂引入弹头的模式非常成功, 运用此策略实现的共价抑制剂大多是靶向催化位点的半胱氨酸等残基, 在此情况下不容忽视弹头的非键相互作用。此外, 由于已有非共价抑制剂为了与催化活性位点形成较强的相互作用, 在空间上一般已与活性位点形成良好的匹配, 留给额外引入的共价弹头的化学空间往往不够, 从而导致非共价抑制剂向共价抑制剂转变的结构改造程度和难度激增。因此, “弹头”优先的基于共价片段的结构进化策略^[66]以及靶向非催化位点残基的共价修饰、新“弹头”的开发将成为SARS-CoV-2 M^pro抑制剂设计的新热点。

另外, 不同类型M^pro非共价抑制剂中, 吡啶、稠环吡啶和含氮杂环等结构出现频次较高, 属于M^pro抑制剂的“优势结构”及“高效药效团元素”。因此, 基于这些优势片段结构, 构建基于模块化反应微量合成的化合物库^[67]或基于合成方法学的自建化合物库^[68] (synthetic methodology-based library) 等技术, 将极大地提高发现高活性M^pro抑制剂的效率。

高效抗耐药性将成为未来SARS-CoV-2 M^pro的抑制剂的重要指标。交叉融通与整合创新是解决药物发现中新科学问题的“金钥匙”^[69-72], 例如, 多靶标药物设计、“底物包膜”理念、蛋白降解(PROTAC) 等将成为设计抗耐药性M^pro抑制剂重要策略。

作者贡献: 杨娩玲和程玉森是文章框架的构思者并负责内容的撰写和文献整理; 高升华、刘新泳和展鹏指导论文写作; 宋乐天和叶冰对论文进行了检查和修改。

利益冲突: 所有作者声明不存在利益冲突。

基金

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山东省杰出青年基金(ZR2020JQ31)
山东省重大科技创新工程项目(2019JZZY021011)
中国博士后科学基金面上基金项目(2021M702003)
广东省基础与应用基础研究基金区域联合基金青年基金项目(2021A1515110740)

参考文献

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文献

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2023年第58卷第9期

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接收时间：2022-12-11
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-09-12

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作者

出版历史

收稿日期：2022-12-11
修回日期：2023-02-06

基金

山东省杰出青年基金(ZR2020JQ31)

山东省重大科技创新工程项目(2019JZZY021011)

中国博士后科学基金面上基金项目(2021M702003)

广东省基础与应用基础研究基金区域联合基金青年基金项目(2021A1515110740)

作者信息

山东大学药学院药物化学研究所, 化学生物学教育部重点实验室, 山东济南 250012

通讯作者:

*高升华, E-mail: shh_gao@163.com;

刘新泳, E-mail: xinyongl@sdu.edu.cn;

展鹏, E-mail: zhanpeng1982@sdu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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