药学学报

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热毒宁注射液抗流感病毒作用及机制研究

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颜海燕 ^# , 王萌 ^# , 王辉强 , 李玉环 ^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(6): 1596-1602

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药学学报 |研究论文 2023 , 58 (6) : 1596 -1602

热毒宁注射液抗流感病毒作用及机制研究

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颜海燕^#, 王萌^#, 王辉强, 李玉环^*

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 中国医学科学院抗病毒药物研究重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

*李玉环, Tel: 86-10-63010984, E-mail: yuhuanlibj@126.com

Effect and mechanism of Reduning injection on influenza A virus

Hai-yan YAN, Meng WANG, Hui-qiang WANG, Yu-huan LI^*

Affiliations

CAMS Key Laboratory of Antiviral Drug Research, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2023-06-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1092

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摘要

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为了探究热毒宁注射液(Reduning injection, RI) 抗甲型流感病毒的作用及其机制, 本研究在A549和MDCK细胞上采用CCK-8 (cell counting kit-8) 法检测药物细胞毒性; 采用Western blot和CPE (cytopathic effect) 方法检测RI对病毒蛋白、细胞病变和病毒毒力的影响评价其药效; Western blot法检测血红素加氧酶1 (heme oxygenase 1, HO-1) 的蛋白水平、转录因子NF-E2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2) 核转运、P38 MAPK (mitogen-activated protein kinases) 和ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2) 磷酸化; 实时荧光定量PCR检测IFN-α/β (interferon-α/β) mRNA含量; 双荧光素酶报告基因检测Nrf2的转录活性。结果显示, RI剂量依赖性地抑制流感病毒诱导的MDCK细胞病变, 降低流感病毒M2蛋白水平和病毒毒力, 具有明确的抗流感病毒作用; 促进P38 MAPK和ERK1/2的磷酸化并激活Nrf2核转录因子活性, 促进细胞核内Nrf2蛋白表达, 从而上调HO-1蛋白表达, 最终增加IFN-α/β mRNA水平。综上, 本研究表明, RI通过激活MAPK/Nrf2/HO-1信号通路发挥抗流感病毒作用, 揭示了RI抗流感病毒新的作用机制, 为其临床治疗流感病毒提供了理论依据。

关键词

热毒宁注射液 / 流感病毒 / 血红素加氧酶1 / 干扰素 / 抗流感药物

Abstract

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The purpose of this study is to investigate the effect of Reduning injection (RI) on influenza A virus (IAV) and its mechanism. We evaluated the cytotoxicity of RI in A549 and MDCK cells by cell counting kit-8 (CCK-8) assay. Western blot and cytopathic effect (CPE) assays were applied to test the effects of RI on viral protein, CPE and virus virulence to evaluate its inhibitory effect. The proteins level of heme oxygenase 1 (HO-1), nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), phosphorylation of P38 mitogen-activated protein kinases (MAPK) and extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2) were detected by Western blot. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect the RNA expression of interferon-α/β (IFN-α/β). The relative luciferase reporter assay was used to analyze the promoter activity and transcriptional regulation of Nrf2. The results indicated that RI inhibited IAV-induced MDCK cytopathies in a dose-dependent manner, decreased M2 protein of influenza virus and viral titer, indicating that it has definite effect on inhibiting IAV. RI promotes the phosphorylation of P38 MAPK and ERK1/2, activates the activity of Nrf2 nuclear transcription factor, increases the expression of Nrf2 protein in the nucleus, thus up-regulates the expression of HO-1 protein, and ultimately increases the IFN-α/β mRNA level. In summary, our results demonstrated that RI inhibits the replication of IAV by activating MAPK/Nrf2/HO-1 signaling pathway, revealing a new mechanism of RI against influenza virus, and providing theoretical basis for clinical treatment of influenza virus.

Key words

Reduning injection / influenza virus / heme oxygenase 1 / interferon / anti-influenza virus agent

引用本文

颜海燕, 王萌, 王辉强, 李玉环. 热毒宁注射液抗流感病毒作用及机制研究. 药学学报, 2023 , 58 (6) : 1596 -1602 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1092

Hai-yan YAN, Meng WANG, Hui-qiang WANG, Yu-huan LI. Effect and mechanism of Reduning injection on influenza A virus[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (6) : 1596 -1602 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1092

正文

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流感是由流感病毒引起的一类急性呼吸道疾病。流感病毒传染性强、传播速度快、呈现全球性流行。根据世界卫生组织报告, 流感每年可致5%~10%的成人和20%~30%的儿童发病, 全球每年流感流行可致29万~65万例死亡^[1]。此外, 有证据表明, 甲型流感病毒(influenza A virus, IAV) 可加重冠状病毒SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 的感染^[2]。因此, 针对流感病毒的防治具有重要意义。目前疫苗和药物是防治流感病毒的有效方法, 但由于流感病毒变异速度快, 且无法准确预测下一年的流感病毒毒株, 因此使用疫苗预防具有局限性。常用的抗流感病毒药物主要分为以下几类: ① M2离子通道抑制剂[金刚烷胺(amantadine, AH)、金刚乙胺等], 由于其耐药性严重, 目前已不建议使用; ②神经氨酸酶(neuraminidase, NA) 抑制剂(奥司他韦、扎那米韦等), 其只在感染后48 h内使用有效, 在2008~2009年流感季节传播的大约90%的流感毒株被发现对NA抑制剂具有耐药性^[3]; ③法匹拉韦(favipiravir, T705) 是一种广谱抗病毒药物, 可抑制流感病毒依赖RNA的RNA聚合酶; ④酸性聚合酶(PA) 核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦于2018年10月获美国食品和药物管理局(FDA) 批准上市。以上抗病毒药物均是针对病毒靶点, 随着抗流感病毒药物的广泛使用, 导致大量耐药株的产生, 因此需开发新的抗流感病毒药物。

中药是药物开发的重要资源库, 中草药由于其成分多样、作用靶点多, 可通过多种途径和机制发挥抗流感病毒作用, 因此研究中药抗流感病毒作用具有重要意义。由青蒿、金银花、栀子组成的热毒宁注射液(Reduning injection, RI) 中药复方制剂具有清热、疏风、解毒功能, 临床主要用于外感风热所致感冒、咳嗽、症见高热、微恶风寒、上呼吸道感染、急性支气管炎等证候者^[4]。有文献^[5]报道热毒宁注射液在小鼠体内具有抗甲型H1N1流感病毒的作用, 可提高小鼠存活率、显著降低病毒感染小鼠肺组织病毒载量, 但有关该药的抗流感病毒作用机制尚不完全明确。因此, 本研究探索RI抗流感病毒作用机制, 为该复方中药的临床应用提供更多理论依据。

材料与方法

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细胞与病毒

马达犬肾细胞[MDCK, 美国典型培养物保藏中心(ATCC)]; 人肺癌细胞(A549)、人单核巨噬细胞(THP-1) (中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心); 人肾上皮细胞(HEK293T/17, 中科院上海细胞库); 流感病毒毒株A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1, H1N1, ATCC)。

MDCK细胞使用MEM培养基(含1% MEM非必需氨基酸溶液), A549细胞使用F-12K培养基, THP-1细胞使用RPMI1640培养基, HEK293T/17细胞使用DMEM培养基, 均加入10%胎牛血清(FBS) 和1%双抗, 置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。全部实验均采用对数生长期的细胞进行。以上所有培养试剂均购自Invitrogen公司。

药品与试剂

RI (每支10 mL, 批号190534, 江苏康缘药业股份有限公司); 金刚烷胺(amantadine, AH, 美国MCE公司); 法匹拉韦(上海陶术公司); 原卟啉氯化钴[cobalt(III) protoporphyrin IX chloride, CoPP]、IAV M2抗体(美国Santa Cruz公司); MEK (mitogen-activated protein kinase kinase) 抑制剂(PD98059) 和P38抑制剂(SB239063) (上海Selleck公司)。CCK-8 (cell counting kit-8) 细胞增殖及毒性检测试剂盒、实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 一步法试剂盒(北京全式金公司); Lipofectamine^TM 3000 (美国Invitrogen公司); 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(上海碧云天公司); 双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国Promega公司); RNeasy Mini Kit (QIAGEN公司); TransScript II Green One-Step qRT-PCR SuperMix (北京全式金公司)。抗体β-actin、P38、p-P38 (phospho-P38)、ERK (extracellular signal-regulated kinases)、p-ERK、tubulin、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(美国Cell Signaling Technology公司); 血红素加氧酶1 (heme oxygenase 1, HO-1) 抗体(英国Abcam公司); Histone H3、转录因子NF-E2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2) (美国Proteintech公司)。

仪器

二氧化碳孵箱(美国Thermo公司); 实时荧光定量PCR仪(ABI 7500 Fast, Applied Biosystems公司); 倒置显微镜和荧光显微镜(奥林巴斯公司); 凝胶成像系统(ChemiDoc^TM XRS+) (美国伯乐公司); EnSpire荧光检测仪(美国PerkinElmer公司)。

细胞毒性检测(CCK-8法)

取对数生长期的MDCK (每孔1.5×10⁴个)、A549 (每孔2.5×10⁴个) 和THP-1 (每孔4.5×10⁴个) 细胞, 接种入96孔板中培养24 h后, 弃掉完全培养基, 加入维持液稀释的RI [起始浓度为RI原液的10% (体积比), 2倍稀释, 共8个浓度梯度。继续培养48 h后, 每孔加入10 μL CCK-8, 37 ℃培养2 h, 酶标仪检测各孔吸光值(A₄₅₀)。

病毒滴度检测

MDCK (每毫升3.5×10⁵个) 和A549 (每毫升2.5×10⁵个) 细胞接种于12孔板中培养过夜, 37 ℃感染流感病毒[MOI (multiplicity of infection): 0.002、0.2], 同时给予RI (2.5%、1.25%、0.63%) 处理, 2 h后, 未吸附的病毒被移除, 加入同剂量含RI的病毒维持液。24 h后, 将培养板放入-80 ℃冰箱三冻三融, 4 ℃、5 000 ×g离心2 min收集上清。用病毒维持液将上清进行10倍梯度稀释, 将梯度稀释的病毒液加入MDCK细胞中, 设置细胞对照, 放置于细胞培养箱中培养。48 h后使用倒置显微镜读取CPE (cytopathic effect) 结果, 并根据Reed & Muench法计算病毒半数组织细胞感染量(50% tissue culture infective dose, TCID₅₀), 结果以-lgTCID₅₀表示流感病毒的载量。

Western blot检测

MDCK (每毫升3.5×10⁵个) 和A549 (每毫升2.5×10⁵个) 细胞接种于12孔板培养过夜, 流感病毒(MOI: 0.002、0.2) 感染细胞, 感染同时加入RI (2.5%、1.25%、0.63%) 和阳性对照药AH, 于5% CO₂、37 ℃培养2 h后, 未吸附的病毒被移除, 加入同剂量含RI的病毒维持液。24 h后, 提取细胞总蛋白, 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上, 5%牛血清白蛋白(BSA) 室温封闭1 h, 孵育一抗(IAV M2、HO-1、Nrf2、P38、p-P38、ERK、p-ERK、β-actin、tubulin、histone H3) 于4 ℃过夜, 二抗(1∶5 000) 室温孵育1 h, 增强型化学发光(enhanced chemiluminescent, ECL) 显影液显影, 于凝胶成像仪曝光。

qRT-PCR检测

取对数生长期THP-1细胞, 感染流感病毒(MOI: 0.2), 同时给予RI (1.25%、0.63%) 处理, 37 ℃感染2 h后, 未吸附的病毒被移除, 加入同剂量含RI的病毒维持液。感染后36 h使用QIAGEN RNeasy Mini Kit于提取细胞内的总RNA。使用TransScript II Green One-Step qRT-PCR SuperMix进行RNA水平的定量PCR检测。以GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 作为内参, 对Ct值进行归一化处理, 采用2^-ΔΔCt法相对定量方法计算目的基因IFN-α、IFN-β和流感病毒M2的表达差异。qRT-PCR引物见表 1。

双荧光素酶报告基因检测

HEK293T/17 (每毫升4.5×10⁵个) 细胞接种于6孔板中, 培养24 h。细胞共转染表达萤火虫荧光素酶的pGL4.37 [luc2P/ARE/Hygro]/pAP-1-Luc/pNF-κB-Luc和表达海肾荧光素酶的pRL-SV40质粒, 比例为10∶1。转染24 h后, 感染流感病毒(MOI: 0.02) 并加入RI, 继续处理24 h。提取细胞总蛋白, 收集上清, 使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测萤火虫荧光和海肾荧光强度, 二者比值即为荧光素酶报告基因的活性。

统计学分析

采用GraphPad Prism 7.0软件作图, 并对数据进行统计分析, 所有数据以x ± s表示, 多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA) 并用Holm-Sidak法进行组间的多重比较。P < 0.05表示具有显著性差异。

结果

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1 细胞毒性检测

采用CCK-8法检测RI在不同细胞中的毒性(图 1), 在MDCK和A549细胞中, RI无毒浓度为RI原液的2.5%, THP-1细胞上无毒浓度为1.25%。因此, 在后续MDCK和A549细胞实验中, RI所使用的最大浓度为2.5%, THP-1中使用的药物最大浓度为1.25%。

2 RI的抗流感病毒作用

通过CPE方法检测RI在MDCK细胞上的病变效应, 结果显示, RI剂量依赖性地抑制流感病毒诱导的MDCK细胞病变(图 2A), IC₅₀为1.38%。通过检测病毒滴度, 发现RI可剂量依赖性抑制MDCK和A549细胞感染流感病毒后的病毒毒力, 与病毒对照组相比具有统计学差异(图 2B、C)。进一步验证RI在MDCK和A549细胞中对流感病毒蛋白表达的影响, 结果表明, RI在两种细胞中均可剂量依赖性降低流感病毒M2的蛋白水平, 且2.5% RI对IAV蛋白的抑制效果与阳性药AH相当(图 2D、E)。上述结果表明, RI具有明显的抗流感病毒作用。

3 RI通过上调HO-1的表达抑制流感病毒复制

检测RI对未感染及感染流感病毒后A549细胞中HO-1蛋白表达的影响, 结果显示, 2.5% RI显著增加细胞中HO-1蛋白的表达(图 3A、B); 此外, 使用了HO-1的激动剂CoPP和RI共同处理细胞, 如图 3C所示, RI和CoPP均能上调HO-1的表达, 且RI和CoPP联合可协同上调HO-1的表达, 降低流感病毒M2的蛋白水平。综上, RI可显著增加HO-1的蛋白表达。

4 RI通过上调HO-1激活干扰素

如图 4所示, 在流感病毒感染THP-1细胞36 h后, RI降低流感病毒M2水平的同时, 可显著增加IFN-α和IFN-β的mRNA水平, 与病毒对照组相比具有统计学差异, 说明RI可通过上调HO-1激活干扰素发挥抗流感病毒作用。

5 RI激活核转录因子Nrf2并促进Nrf2核转运

为检测RI诱导HO-1表达的上游信号通路, 使用双荧光素酶基因报告系统对Nrf2调节的抗氧化反应元件ARE、核因子κB (NF-κB) 和转录因子活化蛋白-1 (AP-1) 所启动的报告基因活性进行了分析, 结果显示, RI显著提高Nrf2转录因子活性; 但对AP-1和NF-κB所启动的报告基因活性无影响(图 5A~C)。因此, RI通过激活核转录因子Nrf2上调HO-1的表达。

由于Nrf2蛋白主要在细胞核中发挥作用, 因此通过细胞核质分离检测RI对Nrf2蛋白的影响。RI处理细胞6 h后, RI促进细胞质中的Nrf2发生了核转位(图 5D、E)。因此, RI可通过促进Nrf2入核, 诱导Nrf2/ARE下游的HO-1表达。

6 RI激活P38 MAPK、ERK1/2途径诱导Nrf2/HO-1的表达

为阐明RI如何通过激活Nrf2发挥作用, 在A549细胞中检测了RI对Nrf2上游MAPK家族成员的蛋白磷酸化的影响。结果显示, 细胞在感染流感病毒并同时给予RI处理5和15 min, 可显著促进ERK1/2和P38的磷酸化水平(图 6A)。为证实这一作用, 利用Ras/Raf/MEK/ERK级联途径中MEK的特异性抑制剂PD98059和P38 MAPK的特异性抑制剂SB239063处理细胞, 检测其对Nrf2转录活性的影响。结果显示加入这两种抑制剂后, Nrf2的结合活性下降, 并且两种抑制剂同时处理时对Nrf2的抑制效果更为明显(图 6B)。综合以上结果提示, RI通过激活ERK1/2和P38 MAPK磷酸化促进Nrf2的核转位。

讨论

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传统中药在中国医药史上发挥极为重要的作用, 至今中药在流感治疗中仍占有重要地位。RI具有清热、解毒、疏风之功效, 用于治疗外感风热引起的感冒、咳嗽、上呼吸道感染所致的高热、微恶风寒等症。本研究采用两种细胞、在分子和细胞水平研究RI抗流感病毒活性。结果显示, RI可剂量依赖性地抑制流感病毒的复制。此外, RI对A/H1N1/BJ/09、A/California/07/2009流感病毒和H5N1亚型禽流感病毒也具有较好的抑制作用^[5-7], 说明RI具有广谱抗流感病毒作用。

RI中含有环烯醚萜类、黄酮类和有机酚酸类等多种抗病毒成分, 包括绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、隐绿原酸、咖啡酸、金丝桃苷、阿魏酸、栀子苷和京尼平等。其中绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、隐绿原酸能抑制流感病毒NA活性^[8], 另外, 阿魏酸也可通过降低流感病毒NA活性抑制流感病毒复制^[9]。本课题组发现, 2.5% RI可抑制约22%的流感病毒NA活性(结果未提供), 但在此浓度下, Western blot检测出其抗IAV药效可达90%。因此, RI作为中药复方制剂, 具有多成分、多靶点、多途径的作用机制, 除直接靶向流感病毒NA外, 可能对宿主蛋白也有调节作用。

HO-1是生物体降解血红素生成胆绿素、一氧化碳和铁离子的一种限速酶, 副产物胆绿素及其还原型胆红素具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用^[10]。RI作为一种广泛使用的中药复方制剂, 所含化学成分明确, 文献^{[11, 12]}报道其具有抗炎抗氧化活性。有证据表明, 上调HO-1对包括IAV、人类免疫缺陷病毒(HIV)、肠道病毒71 (EV71)、埃博拉病毒(EBOV) 在内的多种病毒均有抑制作用^[13-17]。本研究也证实RI可通过诱导HO-1的表达发挥抗流感病毒作用。此外, HO-1在免疫调节反应中占有重要作用。流感病毒感染后, HO-1通过与IRF3相互作用促进IRF3磷酸化及入核, 从而激活干扰素系统进而抑制流感病毒的复制^[18]。有研究^[16]表明, 过表达HO-1显著上调IFN-α/β水平及干扰素刺激基因(ISG) 的表达并抑制IAV复制。本研究结果显示, RI可通过上调HO-1的蛋白表达, 促进干扰素IFN-α/β的mRNA表达, 发挥抗病毒作用。Wang等^[5]在研究RI体内抗流感病毒作用机制中发现, RI可促进小鼠肺组织γ干扰素的分泌, 降低白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α水平。综合以上结果说明, RI在体内外均可通过增强干扰素系统而减轻病毒对机体的损伤, 但其体内抗流感病毒作用是否通过上调HO-1还需进一步研究。

RI可通过激活P38 MAPK、ERK1/2途径诱导Nrf2/HO-1表达, 从而激活干扰素系统发挥抗流感病毒作用。RI具有靶向流感病毒NA的直接抗病毒作用和通过上调HO-1激活干扰素系统的靶向宿主的抗病毒作用, 提示其可能成为新型针对病毒-宿主双机制模式的抗病毒中药。本研究揭示了RI的部分抗流感病毒作用机制, 为临床治疗流感病毒提供了理论依据。

作者贡献: 颜海燕负责药效学和初步作用机制研究实验、实验结果分析和文章初稿撰写; 王萌负责部分药效学实验和作用机制研究实验; 王辉强指导文章撰写; 李玉环负责实验设计和论文审阅。

利益冲突: 所有作者均声明没有利益冲突。

基金

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国家自然科学基金青年科学基金资助项目(8220131872)
中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-048)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2023年第58卷第6期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1092

接收时间：2022-10-04
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-06-12

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作者

出版历史

收稿日期：2022-10-04
修回日期：2022-10-28

基金

国家自然科学基金青年科学基金资助项目(8220131872)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-048)

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 中国医学科学院抗病毒药物研究重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

*李玉环, Tel: 86-10-63010984, E-mail: yuhuanlibj@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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