药学学报

建立大麻素1型受体激动剂的细胞筛选模型

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王晓彤 , 张程璐 , 薄茹雪 , 周诗绮 , 陈乃宏 , 苑玉和 ^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(6): 1603-1610

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药学学报 |研究论文 2023 , 58 (6) : 1603 -1610

建立大麻素1型受体激动剂的细胞筛选模型

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王晓彤, 张程璐, 薄茹雪, 周诗绮, 陈乃宏, 苑玉和^*

作者信息

中国医学科学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

*苑玉和, Tel: 86-10-50927212, E-mail: yuanyuhe@imm.ac.cn

Establishment of a screening cell model for cannabinoid type 1 receptor agonists

Xiao-tong WANG, Cheng-lu ZHANG, Ru-xue BO, Shi-qi ZHOU, Nai-hong CHEN, Yu-he YUAN^*

Affiliations

State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2023-06-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1006

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摘要

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大麻素受体是中枢神经系统表达丰富的G蛋白偶联受体, 也是治疗炎症、疼痛及药物滥用潜在的药物靶点。大麻素受体主要包括大麻素1型受体(cannabinoid type 1 receptor, CB1R)、大麻素2型受体(cannabinoid type 2 receptor, CB2R) 及其他受体。CB1R在调节中枢记忆、认知和运动等方面发挥关键作用, 因此筛选具有激动CB1R活性的化合物具有治疗神经系统疾病的潜在价值。本研究使用的载体质粒将CB1R胞内第三环(intracellular loop 3, ICL3) 基因序列置换为环状绿色荧光蛋白(circular-permutated enhanced green fluorescent protein, cpEGFP)。慢病毒包装后感染HEK 293T细胞, 经嘌呤霉素筛选获得高表达CB1R-cpEGFP的稳定细胞株。当激动剂与CB1R结合后, 膜受体构象发生改变, 膜受体内cpEGFP的发色团去质子化产生绿色荧光, 通过检测荧光强度评价激动CB1R的活性物质。本研究利用CB1R激动剂花生四烯酸-2′-氯乙酰胺(arachidonyl-2′-chloroethylamide, ACEA) 作为阳性对照评价模型的可靠性。研究发现, ACEA可激活细胞模型受体, 表现为荧光强度增加, 这种效应能够被CB1R特异性拮抗剂利莫那班(rimonabant) 阻断, 导致荧光消失。本研究利用荧光探针成功构建CB1R激动剂细胞筛选模型。

关键词

大麻素1型受体 / 细胞模型 / 大麻素1型受体激动剂 / 药物筛选 / 环状绿色荧光蛋白

Abstract

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Cannabinoid receptors are one of the most expressed G protein-coupled receptors in the central nervous system, which are potential drug targets for inflammation, pain and drug abuse. Cannabinoid receptors are composed of type 1 receptor (CB1R), type 2 receptor (CB2R) and other receptors, of which CB1R plays a vital role in regulating central memory, cognition, and motor function. Therefore, screening CB1R agonists has potential value in treating nervous system diseases. In this study, the intracellular loop 3 (ICL3) domain of CB1R was replaced with a circular-permutated enhanced green fluorescent protein (cpEGFP). After infecting HEK 293T cells with lentivirus particles, we obtained a stable cell line that was overexpressed human CB1R-cpEGFP after puromycin selection. The interaction between receptor agonists and CB1R led to the change of receptor conformation, resulting in de-protonation of the EGFP, and enhancing the fluorescence intensity. Therefore, active CB1R compounds could be verified by measuring the fluorescence intensity. Using CB1R agonist arachidonyl-2′-chloroethylamide (ACEA) as a positive control to evaluate the reliability of this model, studies have shown that ACEA could induce receptor activation and increase fluorescence intensity, while antagonist rimonabant inhibited receptor activation with unchanged fluorescence intensity. In conclusion, this study successfully constructed a fluorescent probe screening model for CB1R agonists.

Key words

cannabinoid type 1 receptor / cell model / cannabinoid 1 receptor agonist / drug screening / circular-permutated enhanced green fluorescent protein

引用本文

王晓彤, 张程璐, 薄茹雪, 周诗绮, 陈乃宏, 苑玉和. 建立大麻素1型受体激动剂的细胞筛选模型. 药学学报, 2023 , 58 (6) : 1603 -1610 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1006

Xiao-tong WANG, Cheng-lu ZHANG, Ru-xue BO, Shi-qi ZHOU, Nai-hong CHEN, Yu-he YUAN. Establishment of a screening cell model for cannabinoid type 1 receptor agonists[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (6) : 1603 -1610 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1006

正文

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大麻素受体(cannabinoid receptors, CBRs) 属于7次跨膜的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)。哺乳动物CBRs主要由CB1R和CB2R组成。CB1R主要分布于中枢神经系统, 嗅球、海马、基底神经节和小脑等脑区CB1R蛋白表达水平较高^[1]。研究显示, CB1R通过多种途径调节神经系统功能^[2]: 该受体主要位于神经元突触前^[3]和突触后部位^[4], 传导内源性大麻素的逆行信号和介导特定神经元的自我抑制; 它也以较低的水平表达于胶质细胞, 间接调控突触的可塑性^[5]; 此外, CB1R还在周围神经系统神经元表达, 与病理性疼痛密切相关^{[6, 7]}。鉴于CB1R在机体内发挥广泛的神经精神类效应, 因此获取能激动CB1R功能的活性物质对改善生理机能或缓解病理发展有重要意义。

研究表明, CB1R激动剂通过激活CB1R与G蛋白偶联, 招募下游β-arrestin^{[8, 9]}, 进而影响认知、情绪、睡眠和疼痛等多种生理过程^[10-12]。目前CB1R经典的选择性激动剂主要包括AM-1235、ACEA、CP 50556-1、CP-55940、HU-210、JWH-007、JWH-018、JWH-200 (WIN55225)、O-1812、UR-144和WIN 55212-2。由于GPCRs家族在体内广泛表达, 以GPCRs为靶点的新药研发是制药公司开发的重点。目前, 药物发现的主要方式是利用化合物或多肽进行临床相关GPCRs计算和高通量筛选(high-throughput screening, HTS)^[13]。哺乳动物细胞GPCRs的内源性表达通常很低, 为了提高筛选实验中功能性GPCRs的蛋白含量, 通常在工具细胞中过表达异源GPCRs。在细胞水平检测第二信使浓度的变化能够反映配体与GPCRs的相互作用, 发现可以调节GPCRs活性的化合物, 但这一方法存在诸多局限性。首先, 人源GPCRs在其内源性组织以外的表达有时需要添加表达标签来报告其定位和蛋白含量, 这种占位性标签可能会影响配体受体的结合。第二, 考虑到所有的GPCRs均通过相同的4个Gα蛋白家族偶联, 仅少数几种二级信使的浓度发生变化, 因此极大可能发生信号通路之间的串扰。第三, 与其他细胞水平的分析方法类似, 在GPCRs的细胞筛选方法中, 化合物可能本身就会导致报告基因输出变化, 导致假阴性和假阳性。如化合物在报告基因检测条件的相同波长处发射荧光, 产生假阳性结果^[14]。

本研究通过感染和筛选, 成功构建稳定表达人源CB1R的HEK 293T细胞系^[15]。研究表明, ICL3连接受体跨膜螺旋5和6, 当激动剂与受体结合时, ICL3包括置换后的cpEGFP均会发生较大的构象变化^[16]。检测原理如图 1所示: 受体激动剂与细胞膜上的CB1R发生相互作用后, 受体被激活, CB1R构象发生改变, 驱使cpEGFP发色团去质子化, 绿色荧光强度随之增加(图 1)。在本研究中, 荧光强度的不同可反映受体活性的改变, 使用CB1R特异性拮抗剂利莫那班(rimonabant) 预孵育可以阻断CB1R激动剂激活CB1R-cpEGFP, 以进一步验证模型的可靠性。结果显示, 荧光强度即受体活性, 随着细胞密度、激动剂浓度、激动剂种类的不同而发生变化; CB1R拮抗剂rimonabant预孵育可阻断CB1R激动剂激活CB1R-cpEGFP, 荧光消失。本研究已成功建立CB1R激动剂的药物筛选细胞模型, 可用于评价具有CB1R激动作用的活性物质。

材料与方法

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细胞株 人胚肾细胞系HEK 293T细胞为本实验室保存。常规培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基, 置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱。

试剂花生四烯酸-2′-氯乙酰胺(arachidonyl-2′- chloroethylamide, ACEA)、多聚赖氨酸(poly-L-lysine, PLL)、葡萄糖购自美国Sigma公司; WIN 55212-2、Bay 59-3074购自上海陶素公司; rimonabant、嘌呤霉素购自美国Selleck公司; 牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 购自美国Roche公司; HEPES购自美国Amresco公司; 高糖DMEM、胎牛血清购自Gibco公司; 氯化钠、氯化镁购自天津福晨化学试剂公司; 氯化钾购自北京通广精细化工公司; 氯化钙购自国药化学试剂有限公司; pdisplay-eCB2.0-IRES-mCherry-CAAX载体由北京大学李毓龙实验室惠赠^[15]; 慢病毒载体(66334-1, CON254) 由吉凯基因公司包装。

仪器 EnSpire多功能读板仪购自PerkinElmer公司; 二氧化碳培养箱购自Thermo公司。

载体的构建与包装 本研究以载体pdisplay-eCB2.0-IRES-mCherry-CAAX为模板, 通过PCR扩增CB1R-cpEGFP基因片段, 克隆于载体GV208, 测序正确后, 由吉凯基因公司包装为过表达CB1R-cpEGFP的慢病毒载体(GV348), 用于稳定株的构建。

嘌呤霉素浓度的确定 按照每毫升1×10⁵个细胞数将HEK 293T细胞接种于24孔板, 随后在37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h。待细胞生长至95%左右, 使用无血清培养基将嘌呤霉素稀释到不同浓度, 分别为4、6、8、10、12、14 μg·mL^-1。在37 ℃、5% CO₂条件下继续培养细胞, 并根据细胞状态进行适时换液, 连续观察7天, 选择能在7天内完全杀死细胞的最低浓度作为嘌呤霉素的工作浓度。

稳定转染细胞株的建立 构建和筛选稳定表达CB1R-cpEGFP的HEK 293T细胞, 在细胞处于对数生长期时开展实验。将HEK 293T细胞接种于12孔板中(细胞密度为每毫升1×10⁵个), 37 ℃、5% CO₂培养箱培养24 h。制备病毒稀释液, 以感染复数(multiplicity of infection, MOI) 值为30感染细胞。根据细胞生长状况进行换液, 加入10 μg·mL^-1嘌呤霉素进行筛选, 共筛选4天。随后, 以嘌呤霉素(5 μg·mL^-1) 作为维持浓度继续扩大培养。

荧光检测方法 提前使用PLL包被不透光黑底96孔板, 按照不同的细胞密度种板, 37 ℃、5% CO₂培养箱培养24 h, 待细胞完全贴壁后, 每孔加入100 μL Hank's平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution, HBSS) 清洗细胞, 随后加入90 μL含0.1% BSA的HBSS孵育20 min。基线荧光值至少连续监测5 min, 正式检测前, 每孔加入10 μL 10倍对应浓度的化合物或同等浓度的溶剂对照稀释液, 连续检测30 min, 每分钟一次。为了探究CB1R特异性拮抗剂rimonabant对特定化合物激活的CB1R-cpEGFP是否有阻断作用, 使用10 mmol·L^-1 rimonabant或溶剂对照提前孵育30 min, 随后加入激动剂进行检测。所有的实验使用不透光黑色96孔板(购自Corning公司), 使用488 ± 10 nm范围内的激发光和561 ± 10 nm处的发射光检测荧光强度。

细胞延时成像拍摄 提前使用PLL包被35 mm玻璃底共聚焦培养皿, 按照一定细胞密度种板, 37 ℃、5% CO₂培养箱培养24 h, 待细胞完全贴壁后, 首先每孔加入1 mL HBSS清洗细胞, 随后每孔加入900 μL含0.1% BSA的HBSS孵育20 min。平衡后将培养皿放置到载物台, 转动细准焦螺旋进行调焦, 直至视野清晰, 开始拍摄。在第5 min加入100 μL 10倍对应浓度的ACEA或者DMSO稀释液。拍摄条件: ×40水镜/以30 s间隔拍摄15 min。激发光波长: 488 ± 10 nm, 发射光波长: 561 ± 10 nm。图像采集采用荧光激光扫描共聚焦显微镜(徕卡TCS SP2, 德国), 并通过徕卡共聚焦软件输出。

统计学分析 在配体添加之前和之后至少同时检测3个单独的荧光读数(分别为signal_basal和signal_stim)。为了量化这一变化, 计算激动剂作用后第5 min每个孔的ΔFluorescence作为基础百分比([(signal_stim-signal_basal)/signal_basal] × 100%)。随后减去空白对照的平均ΔFluorescence得ΔF。使用GraphPad Prism 7.0软件进行分析。数据分析采用one-way ANOVA单因素方差分析。本研究中实验均至少重复3次, 数据以平均值±标准误表示, P < 0.05被认为有统计学差异。

为了量化CB1R特异性拮抗剂rimonabant对特定化合物激活的CB1R-cpEGFP的阻断作用, 记录激动剂加入前5 min基线荧光值并取均值作为signal_basal, 记录激动剂加5 min后荧光值signal_stim-5min, 根据计算公式: ΔFluorescence=([(signal_stim-signal_basal)/signal_basal]×100%), 得到第10 min ΔFluorescence。随后减去空白对照的平均ΔFluorescence得到ΔF。

结果

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1 细胞密度对CB1R活性的影响

为了探究细胞密度对CB1R活性的影响, 以确定最佳细胞密度进行后续筛选, 实验设置5个密度梯度, 每毫升细胞数分别为: 8×10⁴、1×10⁵、3×10⁵、5×10⁵和7×10⁵个。ACEA是一种强效特异性CB1R激动剂。使用相同浓度的ACEA刺激不同密度的细胞, 即可检测受体活性的不同变化。在本研究中, 荧光强度的变化直接反映受体的激活情况, 而荧光值的大小则代表荧光强度的高低, 因此应用荧光值代表受体活性的高低。结果显示, 10 μmol·L^-1 ACEA刺激稳定表达CB1R-cpEGFP的HEK 293T细胞后, CB1R被激活, 荧光值随着细胞密度的增加而增加。在设定的5个细胞密度梯度下, 10 μmol·L^-1 ACEA均明显诱导荧光强度的增加(P < 0.001)。当细胞密度为每毫升7×10⁵个时, 荧光值达到最大(图 2A), 第10 min ΔF值为172.76% ± 23.05% (图 2B)。因此, 本方法采用每毫升7×10⁵个的细胞数进行后续检测。

为进一步验证筛选模型的特异性, 在加入10 μmol·L^-1 ACEA刺激细胞前, 应用10 μmol·L^-1的CB1R特异性拮抗剂rimonabant孵育细胞30 min, 根据材料中计算方法得到ΔF。结果显示, 在5个细胞密度梯度下, 经10 μmol·L^-1 rimonabant预处理, ACEA均无法激动细胞膜受体, ACEA作用的第5 min ΔF值与对照组相比, 无显著性差异; 与未经拮抗剂处理组(每毫升细胞数为8×10⁴、1×10⁵、3×10⁵、5×10⁵和7×10⁵个) 相比, 拮抗剂处理组第5 min ΔF值均显著性降低(图 2B)。因此, 在不同细胞密度条件下, 10 μmol·L^-1 ACEA引起的CB1R-cpEGFP的激活均能被10 μmol·L^-1 rimonabant所阻断, 进一步验证本筛选模型的可行性。

2 激动剂ACEA的浓度对CB1R活性的影响

为了探究激动剂的浓度对CB1R活性的影响, 本研究给予不同浓度的ACEA (0.01、0.05、0.1、1、5和10 μmol·L^-1) 刺激细胞来检测受体的激活情况, 同时设立溶剂对照组(不加ACEA)。结果显示, 在每毫升7×10⁵个细胞密度条件下, 不同浓度ACEA激动CB1R后, 产生的荧光强度不同, 其中5 μmol·L^-1 ACEA可以诱导产生最高的荧光值(图 3A)。ACEA (0.1、1、5和10 μmol·L^-1) 刺激CB1R过表达细胞后, 第5 min ΔF值与溶剂对照组相比, 均显著增加(P < 0.001)。ACEA (0.05 μmol·L^-1) 也能够产生明显的荧光变化(P < 0.05)。在本实验条件下, 最适ACEA浓度为5 μmol·L^-1, 其第5 min ΔF值为181.34% ± 56.85% (图 3B)。为了更加形象地展示细胞荧光的动态变化, 本研究应用5 μmol·L^-1 ACEA刺激细胞进行荧光时间序列成像拍摄, 与溶剂对照组(图 3C) 相比, 5 μmol·L^-1 ACEA加入培养皿后, 细胞膜能够观察到明亮的绿色荧光, 且在15 min内基本保持不变(图 3D)。

为进一步验证筛选模型的特异性, 在加入不同浓度ACEA刺激细胞前, 应用10 μmol·L^-1 CB1R特异性拮抗剂rimonabant孵育细胞30 min, 根据材料中计算方法得到ΔF。结果显示, 10 μmol·L^-1 rimonabant预处理后, 不同浓度的ACEA均无法激动细胞膜受体, 第10 min ΔF值与对照组相比, 无显著性差异; 与未经拮抗剂处理组(ACEA: 0.05、0.1、1、5和10 μmol·L^-1) 相比, 拮抗剂处理后细胞第5 min ΔF值均显著性降低(图 3B)。为了更加形象地展示细胞荧光的动态变化, 应用10 μmol·L^-1 rimonabant或溶剂对照预孵育细胞30 min后, 加入5 μmol·L^-1 ACEA刺激细胞进行荧光时间序列成像拍摄。与溶剂对照组(图 3E) 相比, 10 μmol·L^-1 rimonabant预孵育后, 细胞膜没有明显的绿色荧光(图 3F)。上述结果均表明, CB1R特异性拮抗剂rimonabant能够阻断不同浓度ACEA引起的CB1R-cpEGFP的激活, 表现为膜受体不能产生强烈的荧光。

3 激动剂的种类对CB1R活性的影响

不同种类的激动剂与CB1R结合口袋的结合位点并不完全一致, 致使受体被激活情况存在差异。本研究应用3种CB1R激动剂ACEA、WIN 55212-2和Bay 59-3074 (0.1、1和10 μmol·L^-1) 刺激细胞以检测受体的激活情况, 同时设立溶剂对照组。结果显示, 在每毫升7×10⁵个的细胞密度条件下, 不同种类的CB1R激动剂刺激细胞后, 产生的荧光值不同(图 4A~C)。在相同浓度下, 3种激动剂诱导产生的荧光度值比较如下: ACEA > WIN 55212-2 > Bay 59-3074, 提示3种激动剂与受体的亲和力并不相同, 与文献^{[17, 18]}报道的研究结果一致, 由此表明相同浓度的激动剂, 受体荧光强度的改变可反映受体的亲和性。其中, ACEA (0.1、1和10 μmol·L^-1) 和WIN 55212-2 (0.1、1和10 μmol·L^-1) 在第5 min ΔF值与对照组相比, 荧光强度显著增加(P < 0.001), 表明受体已被激活(图 4D~F)。

为进一步验证筛选模型的特异性, 在加入不同CB1R激动剂刺激细胞前, 应用10 μmol·L^-1的CB1R特异性拮抗剂rimonabant孵育细胞30 min, 记录并计算得到激动剂作用第5 min ΔF。结果显示, 10 μmol·L^-1 rimonabant预处理后, ACEA、WIN 55212-2和Bay 59-3074 (0.1、1和10 μmol·L^-1) 均无法激动细胞膜受体, 第5 min ΔF值与对照组相比, 无显著性差异(图 4D~F); 另外, 与未经拮抗剂处理组(ACEA: 0.1、1和10 μmol·L^-1; WIN 55212-2: 0.1、1和10 μmol·L^-1) 相比, 拮抗剂处理后细胞第5 min ΔF值均显著性降低(图 4D~F)。以上结果证明, CB1R激动剂引起的CB1R-cpEGFP的激活均能被10 μmol·L^-1 rimonabant所阻断。

4 Rimonabant抑制ACEA对CB1R的激动作用

本实验建立的细胞模型依赖于配体受体相互作用, 受体构象发生变化后促使cpEGFP发色团去质子化, 随之受体分子产生明显荧光。因此, 配体受体相互作用被抑制剂或拮抗剂阻碍时, 受体不能被激活或者构象不发生改变, 表现为荧光度值不会显著增加。Rimonabant是CB1的特异性抑制剂, 提前加入10 μmol·L^-1 rimonabant或溶剂对照与细胞孵育30 min后, 再加入10 μmol·L^-1激动剂ACEA (A⁺) 或溶剂对照(A^-) 刺激细胞, 通过记录荧光度值的变化来反映受体的活性改变。结果显示, rimonabant预处理后(R⁺), ACEA无法激动细胞膜受体, 无法诱导荧光度值显著增加(R⁺A⁺), 而应用溶剂对照预先孵育细胞(R^-), ACEA能够成功激动CB1R, 荧光度值显著增强(R^-A⁺) (图 5A), R^-A⁺组第5 min ΔF值与R^-A^-组相比, 荧光值显著升高(P < 0.001, 图 5B)。为了进一步探究rimonabant剂量与受体抑制效应的关系, 应用不同浓度rimonabant (0.01、0.05、0.1、1、5和10 μmol·L^-1) 预处理后, 加入激动剂10 μmol·L^-1 ACEA刺激细胞。结果显示, 随着rimonabant浓度的降低, CB1R抑制作用减弱(图 5C、D)。

讨论

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CB1R是7次跨膜受体, 胞内含有一个与Gi/Go蛋白异质三聚体相互作用的结构域。一旦被激动剂激活后, CB1R结构改变, Gi/Go被激活, 从而抑制cAMP的合成, 促进Ca²⁺通道的开放, 激活有丝分裂活化蛋白激酶^[19]。目前研究认为CB1R可以活化多个通路, 不同CB1R激动剂具有不同的分子结构, 不同激动剂基于不同分子结构可以偏向激动受体, 引起信号通路差异激活^{[20, 21]}。这也导致不同CB1R激动剂与CB1R结合的亲和力和效应存在差异。

多项研究表明, CB1R参与中枢神经系统疾病的多种病理生理过程, 如癫痫、疼痛、多发性硬化、恶心呕吐、食欲不振、帕金森氏症和精神分裂症等^{[22, 23]}。除了中枢系统疾病, CB1R也能够调节外周组织器官的生理病理状态, 是疼痛、能量代谢、炎症、青光眼和癌症等多种疾病潜在药理学靶点^[6]。但到目前为止, 许多典型的CBR配体(特别是CB1激动剂) 因导致呼吸系统紊乱、肾功能障碍和心血管功能障碍等诸多不良反应而被限制使用。因此, 开发能够选择性激活CB1R且无不良反应发生的新型药物迫在眉睫。

GPCRs是体内含量最多的受体超家族, 当它与配体结合后, 受体被激活, 受体的构象发生改变, 进而触发一系列信号通路, 将复杂的细胞外信号转化为关键的生理效应。研究显示, cpEGFP的某些位置可以允许插入蛋白质, 且插入蛋白质构象的变化会改变化学环境, 促使cpEGFP生色基团去质子化而发射荧光^[24]。研究者利用此原理将cpEGFP置换受体胞内第三环部分的结构。经过结构改造, 受体未被激活时, cpEGFP基本不产生荧光; 当受体被激活后, 细胞膜上的受体构象发生改变, 导致定位于细胞膜的受体内部cpEGFP去质子化并发射出绿色荧光^{[15, 25]}。基于以上原理, 本实验构建能够反映CB1R活性变化的载体, 并得到稳定过表达CB1R-cpEGFP的HEK 293T细胞, 稳定转染细胞株对经典的CB1R激动剂和抑制剂均能产生响应: 激动剂可激活受体, 表现为细胞膜荧光强度增加, 一定范围内荧光强度随激动剂的增加而增强, 并且不同激动剂诱导受体产生的荧光强度与文献^{[17, 18]}报道的受体亲和性是一致的; 而拮抗剂则阻止激动剂对受体的激活, 表现为细胞膜荧光无明显改变, 并与抑制剂的浓度呈剂量依赖的关系。由此表明, 本研究成功建立CB1R激动剂的药物筛选细胞模型。与现有常用的筛选方法比较, 本研究构建的荧光探针检测方法简便快速、灵敏特异, 可实现高通量检测。本筛选模型的报告标签cpEGFP与CB1R ICL3融合, 几乎不会影响胞外的配体受体相互作用, 极大降低标签对结果产生干扰的可能性。同时, 本细胞模型只对配体受体的结合敏感, 并不偶联GPCR下游的信号通路^[15], 筛选结果真实可信。但由于筛选结果依赖荧光标签EGFP的报告, 某些化合物可能在报告基因检测条件的相同波长处产生自发荧光, 则可产生假阳性结果, 这种情况可通过设定相应的阴性对照排除。

综上所述, 本研究成功构建了CB1R激动剂的药物筛选细胞模型, 为发现激动CB1R活性化合物提供快速便捷的工具。该荧光探针筛选方法具有广阔的实用性和应用前景: 不仅实现了对CB1R激动剂的高通量筛选, 同时也为其他GPCRs激动剂的筛选方法提供新思路。利用该模型筛选得到的活性化合物通过何种信号通路影响胞内的信号传导, 仍需要后续实验进一步研究。

致谢: 本项目中所用的载体pdisplay-eCB2.0-IRES-mCherry-CAAX由北京大学李毓龙实验室惠赠。

作者贡献: 王晓彤负责实验操作及论文初稿的撰写; 张程璐、薄茹雪负责提供实验材料; 周诗绮协助完成实验; 陈乃宏和苑玉和负责课题指导及终稿审查。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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北京市自然科学基金资助项目(7212156)
中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-026)
国家卫生健康委员会毒品依赖和戒治重点实验室开放课题(2020DAMOP-008)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2023年第58卷第6期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1006

接收时间：2022-08-22
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-06-12

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出版历史

收稿日期：2022-08-22
修回日期：2023-03-24

基金

北京市自然科学基金资助项目(7212156)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-026)

国家卫生健康委员会毒品依赖和戒治重点实验室开放课题(2020DAMOP-008)

作者信息

中国医学科学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

*苑玉和, Tel: 86-10-50927212, E-mail: yuanyuhe@imm.ac.cn

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2022-1006

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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