药学学报

Gene	Primer	Sequence (5'-3')
U6	Forward	CGCTTCGGCAGCACATATAC
	Reverse	AAATATGGAACGCTTCACGA
miR-124	Forward	GCGCTAAGGCACGCGGTGA
	Reverse	ATTCGCACTGGATACGACGGCATTCA

Gene	Primer	Sequence (5'-3')
U6	Forward	CGCTTCGGCAGCACATATAC
	Reverse	AAATATGGAACGCTTCACGA
miR-124	Forward	GCGCTAAGGCACGCGGTGA
	Reverse	ATTCGCACTGGATACGACGGCATTCA

Gene	Primer sequence	Primer length/bp	Tm/℃	Location
TNF-α F	CAGGCGGTGCCTATGTCTC	19	62.2	81-99
TNF-α R	CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG	22	62.1	169-148
IL-10 F	CTTACTGACTGGCATGAGGATCA	23	61.4	33-55
IL-10 R	GCAGCTCTAGGAGCATGTGG	20	62.4	133-114
IBA-1 F	CTTGAAGCGAATGCTGGAGAA	21	60.6	207-227
IBA-1 R	GGCAGCTCGGAGATAGCTTT	20	61.7	440-421
Arg-1 F	CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG	22	60.0	6-27
Arg-1 R	GGAGCTGTCATTAGGGACATCA	22	61.2	189-168
GAPDH F	AGGTCGGTGTGAACGGATTTG	21	62.6	8-18
GAPDH R	GGGGTCGTTGATGGCAACA	19	62.6	102-84

Gene	Primer sequence	Primer length/bp	Tm/℃	Location
TNF-α F	CAGGCGGTGCCTATGTCTC	19	62.2	81-99
TNF-α R	CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG	22	62.1	169-148
IL-10 F	CTTACTGACTGGCATGAGGATCA	23	61.4	33-55
IL-10 R	GCAGCTCTAGGAGCATGTGG	20	62.4	133-114
IBA-1 F	CTTGAAGCGAATGCTGGAGAA	21	60.6	207-227
IBA-1 R	GGCAGCTCGGAGATAGCTTT	20	61.7	440-421
Arg-1 F	CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG	22	60.0	6-27
Arg-1 R	GGAGCTGTCATTAGGGACATCA	22	61.2	189-168
GAPDH F	AGGTCGGTGTGAACGGATTTG	21	62.6	8-18
GAPDH R	GGGGTCGTTGATGGCAACA	19	62.6	102-84

五味子基于miR-124调控TLR4通路介导小胶质细胞表型转化机制

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杨云方 , 张悦 , 彭景 , 吴博 , 贾英 , 颜廷旭 ^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(2): 377-385

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药学学报 | 研究论文 2023, 58(2): 377-385

五味子基于miR-124调控TLR4通路介导小胶质细胞表型转化机制

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杨云方, 张悦, 彭景, 吴博, 贾英, 颜廷旭^*

作者信息

沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院, 辽宁沈阳 110016

通讯作者:

*颜廷旭, Tel: 18842411904, E-mail: ytxsyphu@163.com

Mechanism of Schisandra Chinensis-mediated microglia phenotypic transformation by regulation of the TLR4 pathway based on miR-124

Yun-fang YANG, Yue ZHANG, Jing PENG, Bo WU, Ying JIA, Ting-xu YAN^*

Affiliations

College of Functional Food and Wine, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China

出版时间: 2023-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0392

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摘要

收起

探讨五味子基于microRNA-124 (miR-124) 调控Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4) 通路介导小胶质细胞表型转化的作用机制。利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 刺激BV2细胞建立模型, 不同剂量五味子提取物(Schisandra Chinensis extract, SCE) 处理细胞; miR-124抑制剂(miR-124 inhibitor) 和阴性对照序列(NC inhibitor) 转染至BV2细胞后用SCE处理细胞。MTT法检测细胞活性; NO试剂盒检测NO释放量; ELISA检测白细胞介素-10 (interleukin-10, IL-10)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 含量; 免疫荧光染色法检测小胶质细胞标志物离子钙结合接头分子-1 (ionized calcium binding adapter molecule-1, IBA-1)、精氨酸酶-1 (arginase-1, Arg-1) 及下游核转录因子κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB) 核移位的影响; Western blot检测NF-κB p65、IBA-1、Arg-1、TLR4、骨髓分化蛋白88 (myeloid differentiation primary factor 88, MyD88)、核因子抑制蛋白-α (nuclear factor inhibitor protein-α, IκB-α)、IκB激酶-α (inhibitor of nuclear factor-kappa B kinases-α, IKK-α)、IL-10、TNF-α等蛋白的表达。质量浓度为31.25~250 μg·mL^-1的SCE对于细胞活性无明显影响; SCE作用后, NO释放受到抑制(P < 0.001, P < 0.01), IL-10释放水平升高(P < 0.05), 而TNF-α释放水平降低(P < 0.001), 同时抑制TNF-α、IBA-1、TLR4、MyD88蛋白的表达(P < 0.01, P < 0.001), 升高IL-10、Arg-1、NF-κB p65、IKK-α蛋白表达(P < 0.001, P < 0.01, P < 0.05), SCE还能够促进miR-124的表达(P < 0.01); 转染miR-124 inhibitor后, TNF-α释放量升高(P < 0.001), IL-10释放量减少(P < 0.05), TNF-α、IBA-1的mRNA和蛋白表达升高(P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001), IL-10、Arg-1 mRNA和蛋白表达降低(P < 0.001, P < 0.01), 同时抑制TLR4、MyD88的激活作用减弱。SCE可能通过上调miR-124抑制TLR4信号通路的激活从而抑制小胶质细胞M1极化, 促进小胶质细胞M2极化。

关键词

五味子提取物 / miR-124 / 脂多糖 / BV2细胞 / TLR4通路 / 小胶质细胞表型转化

Abstract

收起

To investigate the mechanism by which Schisandra Chinensis mediates the phenotypic transformation of microglia via microRNA-124 (miR-124)-based regulation of the Toll-like receptor 4 (TLR4) pathway, a model was established using lipopolysaccharide (LPS) stimulation of BV2 cells. Cells were treated with different doses of Schisandra Chinensis extract (SCE). MiR-124 inhibitors and negative control sequences (NC inhibitor) were transfected into LPS-induced BV2 cells and treated with SCE. The MTT assay was used for cell activity detection; an NO kit was used to measure NO release; ELISA kits were used to measure the levels of interleukin-10 (IL-10) and tumor necrosis factor-α (TNF-α). Microglia markers, including ionized calcium binding adapter molecule-1 (IBA-1) and arginase-1 (Arg-1), and the nuclear translocation of nuclear factor-kappa B (NF-κB) were evaluated by immunofluorescent staining. NF-κB p65, IBA-1, Arg-1, TLR4, myeloid differentiation primary factor 88 (MyD88), inhibitor of nuclear factor-kappa B kinases-α (IKK-α), IL-10, TNF-α were detected by immunoblot. SCE at concentrations ranging from 31.25 to 250 μg·mL^-1 had no significant effect on cell activity. SCE treatment significantly inhibited NO release induced by LPS (P < 0.001, P < 0.01), increased the level of IL-10 (P < 0.05), and decreased the level of TNF-α (P < 0.001). In addition, SCE significantly reduced the expression of TNF-α, IBA-1, TLR4, and MyD88 (P < 0.01, P < 0.001) and elevated the expression of IL-10, Arg-1, NF-κB P65 and IKK-α (P < 0.001, P < 0.01, P < 0.05). SCE treatment could also promote the expression of miR-124 (P < 0.01). However, transfection with the miR-124 inhibitor increased TNF-α (P < 0.001), decreased the level of IL-10 (P < 0.05), increased the mRNA level and the protein expression of TNF-α and IBA-1 (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001), and decreased the mRNA level and protein expression of IL-10 and Arg-1 (P < 0.001, P < 0.01). In addition, the inhibition of TLR4 and MyD88 was attenuated. In conclusion, SCE appears to inhibit the activation of TLR4 signaling pathway by upregulating miR-124 so as to inhibit microglia M1 polarization and promote microglia M2 polarization.

Key words

Schisandra Chinensis extract / miR-124 / lipopolysaccharide / BV2 cell / Toll-like receptor 4 pathway / microglia phenotype conversion

引用本文

杨云方, 张悦, 彭景, 吴博, 贾英, 颜廷旭. 五味子基于miR-124调控TLR4通路介导小胶质细胞表型转化机制. 药学学报, 2023 , 58 (2) : 377 -385 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0392

Yun-fang YANG, Yue ZHANG, Jing PENG, Bo WU, Ying JIA, Ting-xu YAN. Mechanism of Schisandra Chinensis-mediated microglia phenotypic transformation by regulation of the TLR4 pathway based on miR-124[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (2) : 377 -385 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0392

正文

收起

小胶质细胞是神经系统的重要组成部分, 是参与神经系统炎症反应的主要细胞。小胶质细胞存在两种功能不同的激活状态, M1促炎型和M2抗炎型^[1]。M1型小胶质细胞具有较强的吞噬能力, 能产生多种促炎因子, 包括白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6) 和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)^[2]。M2型小胶质细胞具有神经保护作用, 通过促进抗炎因子的释放而产生抗炎作用^[3]。根据研究, 神经炎症中的小胶质细胞激活状态可能需要通过同时降低M1表型和促进M2表型反应来进行特异性治疗^[4]。所以, 抑制小胶质细胞M1表型极化, 促进小胶质细胞向M2表型的极化对于抑制神经炎症有着重要的意义。

MicroRNA-124 (miR-124) 是一种在小胶质细胞中高度表达的脑特异性miRNA, 在神经退行性病变过程中具有公认的功能。已证明miR-124的下调使小胶质细胞极化向M1表型进行^[5], 而miR-124的上调使小胶质细胞极化为M2表型进行^{[6, 7]}。Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4) 在小胶质细胞上表达, 并介导神经炎症疾病, 骨髓分化蛋白88 (myeloid differentiation primary factor 88, MyD88) 是一种TLR4的关键衔接蛋白, 导致下游核转录因子κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB) 的激活, 并随后产生与神经毒性相关的促炎细胞因子^[8]。反过来, 升高的miR-124通过直接靶向Toll样受体信号级联的多种成分^[9]。因此miR-124与TLR4信号的关系在小胶质细胞表型极化中有重要的作用。

五味子为木兰科植物Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.的干燥成熟果实, 味酸、甘, 性温, 具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效^[10]。现代药理研究表明, 其具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等作用^[11]。五味子抑制神经炎症的作用成为了近几年的研究热点并被广泛研究。

材料与方法

收起

药材与试剂 五味子购于辽宁省本溪五味子药材基地, 经沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院贾英教授鉴定为木兰科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.的干燥成熟果实; 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、DMEM培养基(含双抗)、trypisin-EDTA、0.25%超敏ECL发光剂、DAPI抗荧光衰减剂、PMSF、蛋白定量(BCA) 试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(大连美仑生物技术有限公司); TNF-α抗体、白细胞介素-10 (interleukin-10, IL-10)抗体、NF-κB抗体、IκB激酶-α (inhibitor of nuclear factor-kappa B kinases-α, IKK-α) 抗体、核因子抑制蛋白-α (nuclear factor inhibitor protein-α, IκB-α) 抗体、TLR4抗体、MyD88抗体、FITC标记山羊抗兔二抗、标志物离子钙结合接头分子-1 (ionized calcium binding adapter molecule-1, IBA-1) 抗体、精氨酸酶-1 (arginase-1, Arg-1) 抗体、β-actin抗体(Cell Signaling Technology公司); ELISA (IL-10) 试剂盒、ELISA (TNF-α) 试剂盒(上海酶联生物科技有限公司); NO检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司); Ribonuclease inhibitor、dNTP、Taq Plus DNA polymerase、DL2000 DNA marker、random primer (N6) (天根生化科技有限公司); HiScript reverse transcriptase (RNase H)、5×HiScript buffer、SYBR Green Master Mix (VAZYME公司); 引物合成(北京擎科生物科技有限公司)。

五味子提取物(Schisandra Chinensis extract, SCE) 样品制备 取五味子粗粉加入75%乙醇加热回流3次, 每次2 h, 料液比1∶10, 8层纱布过滤, 合并滤液, 减压回收至干燥, 得SCE干燥浸膏。配制成1 g·mL^-1的储备液存于-20 ℃供实验使用。

BV2细胞培养 以高糖DMEM为基础培养基中加入1%青霉素和链霉素, 10%的胎牛血清配制成完全培养基, 于37 ℃、5% CO₂培养箱中进行细胞培养, 待小胶质细胞贴壁生长至90%, 传至第3代进行后续实验。

MTT活力测定 将对数生长期的BV2细胞按照每孔1×10⁴个接种于96孔板内, 于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h后取出弃去培养基, 加入含有不同药物浓度的新鲜培养基作用3 h后, 除空白孔外, 每孔加入1 μg·mL^-1 LPS作用24 h, 每孔加入20 μL MTT溶液, 3 h后加入100 μL三联液, 放入CO₂培养箱中孵育过夜, 于波长570 nm下测定每孔的吸光度(A) 值。每组设置3个复孔。

NO含量测定 将对数生长期的BV2细胞每孔2×10⁴个接种于96孔板内, 于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h后弃去培养基, 加入含有不同药物浓度的新鲜培养基, 药物作用3 h后, 除3个空白孔外, 每孔加入1 μg·mL^-1 LPS, 作用24 h后收集上清液。具体操作见试剂盒说明书, 根据标准曲线计算出各个组NO释放的含量。

转染 100 μL无血清opti-MEM稀释10 μL NC inhibitor (20 μmol·L^-1) 和miR-124 inhibitor (20 μmol·L^-1), 室温静置5 min, 再用无血清opti-MEM稀释5 μL Lipo, 室温静置5 min, 将含有Lipo和NC inhibitor和miR-124 inhibitor的稀释液混匀室温静置20 min, 在6孔板每孔加入200 μL的混合液, 放入培养箱内培养6 h后更换正常培养基培养24 h。

ELISA检测 采用ELISA测定SCE作用后和下调miR-124后BV2小胶质细胞释放的IL-10、TNF-α两种炎症因子的含量。将对数生长期的BV2细胞每孔5×10⁵个接种于6孔板内, 于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h后弃去培养基, 加入含有不同药物浓度的新鲜培养基, 药物作用3 h后, 除空白孔外, 每孔加入1 μg·mL^-1 LPS, 作用24 h后收集上清液。具体操作见试剂盒说明书, 根据标准曲线计算出各个组TNF-α、IL-10释放的含量。

免疫荧光法 采用免疫荧光染色的方法考察SCE作用以及miR-124下调后对BV2小胶质细胞IBA-1、Arg-1及NF-κB p65核移位的影响。将对数生长期的BV2细胞接种于6孔板内, 加入细胞爬片, 于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h后取出弃去培养基, 加入含有不同药物浓度的新鲜培养基, 药物作用3 h, 待药物作用结束后, 除空白孔外, 每孔加入LPS使其质量浓度为1 μg·mL^-1, 作用24 h后从培养箱中取出6孔板。抗体稀释比例: IBA-1 (1∶300)、Arg-1 (1∶400)、NF-κB p65 (1∶400)。

免疫印迹法 采用免疫印迹的方法考察BV2小胶质细胞中及miR-124下调后的NF-κB p65 (1∶1 000)、IBA-1 (1∶750)、Arg-1 (1∶1 000)、TLR4 (1∶1 000)、MyD88 (1∶1 000)、IκB-α (1∶1 000)、IKK-α (1∶1 000)、IL-10 (1∶750)、TNF-α (1∶1 000) 等蛋白的表达, β-actin为参比蛋白。

qRT-PCR检测miR-124表达水平 利用Trizol法提取RNA, 按照试剂盒操作, 进行qRT-PCR分析。逆转录反应体系: RNA 3.56 μg, Oligo(dT)18/miRNA loop (10 μmol) 2 μL, dNTP (2.5 mmol) 4 μL, 5×Hiscript buffer 4 μL, Hiscript reverse transcriptase 1 μL, ribonuclease inhibitor 0.5 μL, RNase-free ddH₂O补充至20 μL。反应条件25 ℃、5 min, 50 ℃、15 min, 85 ℃、5 min, 4 ℃、10 min。RT逆转录成cDNA, cDNA 4 μL进行qRT-PCR实验, 配制反应体系: forward primer (10 μmol) 0.4 μL, reverse primer (10 μmol) 0.4 μL, SYBR Green Master Mix 10 μL, 50× ROX reference dye 0.4 μL, H₂O 4.8 μL。反应条件: ① 95 ℃预变性10 min; ② 95 ℃变性15 s; ③ 60 ℃退火延伸60 s, 95 ℃退火延伸15 s, ②~③共40个循环; ④溶解曲线采集60 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s。以GAPDH和U6为内参基因, 进行实时荧光PCR检测。基因检测引物序列见表 1、2。

统计学分析 用GraphPad Prism 8.3.0软件分析, 结果用平均值±标准差($\bar{x}$ ± s) 表示, 组间均数用one-way ANOVA方法进行方差齐性分析。P < 0.05表示具有显著性差异。

结果

收起

1 SCE对LPS激活的BV2细胞存活率的影响

结果如图 1所示, 与空白组细胞活力相比, 500、1 000 μg·mL^-1 SCE与LPS共同作用后BV2细胞活力显著下降(P < 0.05、P < 0.001), 因此选择31.25~250 μg·mL^-1的SCE进行后续研究。

2 SCE对NO释放的影响

与空白组相比, 模型组NO含量明显升高(P < 0.001), SCE作用后, NO释放水平得到明显抑制(P < 0.001, P < 0.01), 结果见图 2。

3 SCE对BV2细胞TNF-α、IL-10、IBA-1、Arg-1的释放及蛋白表达的影响

结果如图 3所示, 模型组较空白组TNF-α释放显著增多(P < 0.001), IL-10释放显著降低(P < 0.001), TNF-α、IBA-1表达水平显著升高(P < 0.001), 而IL-10、Arg-1表达显著降低(P < 0.001)。SCE作用后, TNF-α的释放受到抑制(P < 0.001), 而IL-10释放增多(P < 0.05), 相应的TNF-α、IBA-1表达显著降低(P < 0.001, P < 0.01), IL-10、Arg-1表达水平显著升高(P < 0.05, P < 0.001)。

4 SCE对BV2细胞TLR4-MyD88通路及相关蛋白表达的影响

结果如图 4所示, 模型组较空白组TLR4和MyD88的蛋白表达水平显著升高(P < 0.001), SCE能显著抑制TLR4和MyD88蛋白的表达(P < 0.001, P < 0.01)。

5 SCE对BV2细胞NF-κB核移位及信号通路的调节作用

结果如图 5所示, 未经LPS激活的小胶质细胞中NF-κB p65主要位于胞浆内, 核内绿色荧光较弱。BV2细胞经LPS激活后, NF-κB p65会进入到细胞核内, 核内会呈现较强的绿色荧光。免疫荧光结果显示, 空白组中胞浆内绿色荧光强, 核内荧光弱, 模型组核内呈现强大的绿色荧光, SCE作用后, 核内绿色荧光逐渐减弱。经过Weatern blot考察, 模型组中NF-κB p65、IKK-α蛋白表达水平均升高(P < 0.01, P < 0.001), IκB-α蛋白表达水平降低(P < 0.05), 而SCE作用后, 可以阻止IκB-α的降解和NF-κB p65蛋白表达的升高(P < 0.01, P < 0.05), IKK-α的蛋白表达水平显著降低(P < 0.05, P < 0.001)。这些结果表明, SCE可以通过抑制TLR4进一步抑制NF-κB信号通路的激活。

6 SCE提高miR-124的表达

结果如图 6A所示, 模型组较空白组miR-124表达显著降低(P < 0.01), 而SCE促进了miR-124的表达(P < 0.05)。转染miR-124 inhibitor下调了miR-124的表达, 结果如图 6B所示, NC inhibitor与空白组相比, miR-124的表达无显著性差异。而miR-124 inhibitor组与NC inhibitor组相比, 则显著下调miR-124的表达(P < 0.01)。结果表明, miR-124 inhibitor在BV2小胶质细胞中表达, 并可以显著下调miR-124的表达。

7 下调miR-124对TNF-α、IL-10、IBA-1、Arg-1的影响

结果如图 7A, 空白组与模型组结果与前面一致, miR-124 inhibitor组与NC inhibitor组相比, TNF-α释放量显著升高(P < 0.001), IL-10释放量显著降低(P < 0.05)。

结果如图 7B~D, 空白组与模型组结果与前面一致, miR-124 inhibitor组与NC inhibitor组相比, TNF-α、IBA-1蛋白表达水平升高(P < 0.05, P < 0.01), IL-10、Arg-1蛋白表达水平降低(P < 0.01, P < 0.001)。

结果如图 7E、F, 模型组较空白组TNF-α、IBA-1的mRNA表达水平显著升高(P < 0.001), IL-10、Arg-1的mRNA表达水平显著降低(P < 0.001)。SCE作用后则逆转了这种趋势。miR-124 inhibitor组与NC inhibitor组相比, TNF-α、IBA-1 mRNA表达水平显著升高(P < 0.001), IL-10、Arg-1 mRNA表达水平显著降低(P < 0.01, P < 0.001)。

8 下调miR-124对BV2细胞TLR4、MyD88与NF-κB信号通路蛋白的影响

Western blot结果如图 8所示, 模型组与空白组的结果与前面一致。miR-124 inhibitor组与NC inhibitor组相比, SCE抑制TLR4、MyD88的激活作用减弱(P < 0.01, P < 0.001)。以上结果说明, SCE通过上调miR-124抑制TLR4、MyD88, 进一步阻止NF-κB信号通路的激活。

讨论

收起

LPS不仅使小胶质细胞极化为M1促炎表型, 而且还诱导炎症反应并降低了M2抗炎标志物的表达^[12]。因此, 本研究利用LPS刺激的BV2小胶质细胞, 通过探讨SCE对BV2小胶质细胞极化的调控作用, 深入研究SCE发挥抗炎作用的机制。

研究表明, 过量的NO会导致神经元损伤, 降低NO水平可以控制神经系统疾病^[13]。且M1型小胶质细胞可能会产生细胞毒性因子NO, 因此, 本研究检测了存在LPS的情况下BV2小胶质细胞中NO的释放, IBA-1是小胶质细胞激活的M1标志物, 结果显示SCE可以抑制IBA-1的表达, 综上, SCE可以减少LPS刺激的小胶质细胞产生NO, 从而抑制M1型表型。同时, 结果显示给予SCE治疗后M2标志物Arg-1的表达增加, 表明SCE可以促进小胶质细胞向M2表型转化。

LPS可以激活TLR4, TLR4与细胞表面的骨髓分化因子2 (MD2) 形成TLR4/MD2复合物, 当LPS激活TLR4后, LPS促进TLR4/MD-2复合物的“M”形二聚体的形成^[14-17]。受体复合物的二聚化诱导TLR4的TIR结构域通过特异的接头蛋白MAL与MyD88桥接, 这样TLR4就招募到更多的MyD88蛋白。一方面, TLR4和MyD88信号转导通路可激活下游IKK复合物, 并激活NF-κB通路, 从而表达多种天然免疫和炎症因子, 而NF-κB几乎在所有细胞中都有表达, 并在M1小胶质细胞表型的激活中发挥重要作用^[18]; 另一方面, TLR4在小胶质细胞中表达, 与小胶质细胞活动密切相关, TLR4过度表达会增加TNF-α等促炎因子的生成。使用特异性抑制剂处理TLR4后发现M2标志蛋白有所增加, 这可能与MyD88/NF-κB信号通路相关^{[19, 20]}。静止时, IκB-α与NF-κB的p50和p65亚单位结合。一旦小胶质细胞被激活, IκB-α被降解, NF-κB的p50和p65异二聚体从细胞质转移到细胞核内, 导致炎症因子的转录和表达^{[21, 22]}。在本研究结果中给予SCE后M1标志物TNF-α、IBA-1的表达降低, M2标志物IL-10、Arg-1表达增加, TLR4及下游NF-κB等蛋白表达量也降低, 所以SCE抑制LPS诱导小胶质细胞向M1表型极化产生的炎症反应, 促进小胶质细胞向M2表型极化, 而这一过程可能与TLR4相关。

miR-124是中枢神经系统中表达最丰富的microRNA, 同时在中枢神经系统中高表达, 在生理和病理条件下均能调节小胶质细胞的功能, 也有研究表明miR-124可维持小胶质细胞的静止, 并促进小胶质细胞向M2 (抗炎) 型极化^[23], 所以选择miR-124作靶点。本研究考察了下调miR-124后SCE对LPS激活的小胶质细胞的影响。结果表明, SCE抑制M1型小胶质细胞的作用减弱, 同时, SCE促进Arg-1和IL-10表达的作用减弱。说明SCE通过上调miR-124抑制BV2小胶质细胞的M1表型并促进其向M2表型转化。

TLR4信号通路在小胶质细胞的极化过程中起着关键作用, miR-124通过调节TLR4促进小胶质细胞的M1/M2极化。已有研究表明miR-124通过与MyD88等多个分子的3′-UTR区域结合进而负调节TLR4信号传导^[24]。结合本研究结果发现, SCE通过上调miR-124, 抑制LPS诱导小胶质细胞M1表型极化产生的炎症反应, 促进小胶质细胞向M2型极化, 所以推测TLR4通路可能参与了这一过程。本研究接着通过Western blot检测了转染miR-124 inhibitor的BV2细胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65、IKK-α、IκB-α蛋白水平的表达, 结果表明TLR4及其下游分子MyD88、NF-κB p65、IKK-α蛋白表达均升高, IκB-α蛋白表达显著降低, 说明miR-124下调后TLR4信号通路又重新被激活, 进一步引起NF-κB信号通路的激活。这些结果均说明SCE通过上调miR-124, 促进TLR4下游蛋白MyD88等的表达, 抑制TLR4信号通路, 阻止NF-κB入核, 减少炎症因子的表达。

综上所述, 本研究探讨SCE通过上调miR-124对M1/M2极化的影响, 并进一步探讨了TLR4介导的下游通路NF-κB在这一过程中的作用。结果表明, SCE通过上调miR-124抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞M1极化, 促进小胶质细胞M2极化, 进一步改善神经炎症, 其可能是通过抑制TLR4信号通路, 阻止NF-κB入核。总之, 本研究提供了SCE通过上调miR-124来调节小胶质细胞表型转化而减轻LPS诱导的BV2细胞神经炎症的证据。

作者贡献: 颜廷旭实验设计、论文修改; 杨云方完成论文初稿的写作、修改; 张悦、彭景帮助论文初稿的完成; 吴博、贾英提供了方法理论支持和建议。

利益冲突: 本文作者声明没有利益冲突。

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2023年第58卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0392

接收时间：2022-04-04
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-02-12

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收稿日期：2022-04-04
修回日期：2022-05-07

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沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院, 辽宁沈阳 110016

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*颜廷旭, Tel: 18842411904, E-mail: ytxsyphu@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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