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山竹醇靶向RPN6抑制蛋白酶体及抗肿瘤活性研究

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喻颖 , 柯细松 ^* , 张雪 ^*

药学学报 | 研究论文 2025,60(2): 408-416

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山竹醇靶向RPN6抑制蛋白酶体及抗肿瘤活性研究

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喻颖, 柯细松^*, 张雪^*

作者信息

上海中医药大学交叉科学研究院, 上海 201203

通讯作者:

^*柯细松, Tel: 86-21-51322419

张雪, E-mail: xuezhang@shutcm.edu.cn

Garcinol inhibits proteasome and suppresses tumor growth via targeting RPN6

Ying YU, Xi-song KE^*, Xue ZHANG^*

Affiliations

Institute of Interdisciplinary Integrative Medicine Research, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

出版时间: 2025-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-1024

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摘要

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山竹醇(garcinol) 是藤黄中提取的苯三酚类化合物, 具有抗肿瘤活性, 但其靶标和分子机制尚不明确。本研究旨在探究山竹醇抗肿瘤作用的靶标及其分子机制。应用药物亲和力反应靶标稳定性实验(DARTS) 鉴定山竹醇的结合蛋白; 采用酶活实验联合基因沉默技术考察山竹醇对蛋白酶体活性的影响及其对靶蛋白26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11 (26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 11, RPN6) 的依赖性; 运用免疫荧光和邻位连接技术观测山竹醇对RPN6和泛素蛋白的作用; 利用流式分析技术探究山竹醇对细胞凋亡的影响; 类器官模型研究山竹醇对肿瘤的抑制作用。结果发现: RPN6是山竹醇的直接结合蛋白; 山竹醇抑制蛋白酶体的水解酶活性并诱导泛素累积, 且其蛋白酶体抑制作用依赖于RPN6; 进一步研究发现山竹醇诱导RPN6发生寡聚并在核内形成颗粒; 最后确证山竹醇诱导肿瘤细胞凋亡, 且显著抑制APC杂合突变小鼠小肠腺瘤(Apc^min/+) 类器官的生长。以上结果表明, 山竹醇靶向蛋白酶体RPN6亚基而抑制蛋白酶体活性, 诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长。

关键词

山竹醇 / 蛋白酶体 / 19S / 26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11 / 肿瘤抑制

Abstract

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Garcinol, a benzenetriol compound extracted from Garcinia cambogia, has antitumor activity, however, its antitumor mechanism remains unclear. The aim of this study was to investigate the role and mechanism of garcinol as a novel potential proteasome inhibitor. We applied the drug affinity responsive target stability (DARTS) method coupled to mass spectrometry to determine the binding protein of garcinol; the proteasome activity assay was used to determine the effect of garcinol on its hydrolase activity; immunofluorescence and proximity ligation assay (PLA) were used to detect the effects of garcinol on ubiquitin and RPN6; and flow cytometry were used to determine the effects of garcinol on cell apoptosis; and the anti-cancer effect was studied in organoid models. The results showed that RPN6 was a direct binding protein of garcinol; garcinol inhibited the hydrolase activity of proteasome, and induced the accumulation and aggregation of ubiquitin protein, and its proteasomal inhibitory effect was dependent on RPN6; further studies showed that garcinol induced oligomerization of RPN6 and formation of granules in the nucleus; finally, it was verified that garcinol induced apoptosis of tumor cells, and inhibited the growth of organoids of Apc^min/+ small intestine mice. These results suggest that garcinol is a potential proteasome inhibitor, which inhibits proteasome activity by directly targeting RPN6 on proteasome 19S, which in turn induces cell apoptosis and inhibits tumor growth.

Key words

garcinol / proteasome / 19S / 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 11 / tumor inhibition

引用本文

喻颖, 柯细松, 张雪. 山竹醇靶向RPN6抑制蛋白酶体及抗肿瘤活性研究. 药学学报, 2025 , 60 (2) : 408 -416 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-1024

Ying YU, Xi-song KE, Xue ZHANG. Garcinol inhibits proteasome and suppresses tumor growth via targeting RPN6[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2025 , 60 (2) : 408 -416 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-1024

正文

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蛋白酶体是细胞内最为重要的降解机器, 参与机体内超过80%的蛋白质降解, 决定了蛋白质的命运^[1-3]。蛋白酶体由调控颗粒(regulate particle) 和核心的20S催化颗粒(core particle) 组装而成^[4], 其中调控亚基最为常见的是19S, 其特异性识别、去泛素化和展开蛋白质底物后^[5], 经20S裂解底物蛋白成肽段^[6]。目前, 研究已经证实蛋白酶体是癌症的治疗靶标, 肿瘤细胞对蛋白酶体的抑制更为敏感^[7], 靶向蛋白酶体20S亚基的抑制剂如硼替佐米、伊沙唑米和卡非佐米等已经用于临床骨髓瘤或地幔细胞淋巴瘤(mantle-cell lymphoma, MCL) 的治疗^{[8, 9]}。然而, 当前临床应用的蛋白酶体靶向药物均为20S抑制剂^{[8, 10]}, 但是靶向蛋白酶体核心的催化亚基20S往往使得此类药物选择性较低, 药物不良反应严重且易发生耐药性等诸多问题^[11], 因此, 发现具有选择性的蛋白酶体抑制剂是近年来靶向蛋白酶体研究抗肿瘤药物的研究趋势^[12]。

事实上, 19S被认为是蛋白酶体上具有相对特异性的疾病治疗靶标^[13-15]。19S是蛋白质降解的重要限速步骤, 是由盖子(lid) 和基底(base) 两个亚复合物共19个蛋白组装而成的复合物, 其由泛素受体特异性识别待降解底物, 经进一步剪切泛素链和去折叠蛋白空间结构后, 转运底物进入狭窄水解核心20S^[6]。针对19S去泛素酶的小分子已有报道, 其能克服肿瘤细胞对20S抑制剂的耐受, 有望应用于临床治疗^[14]。然而, 靶向19S其他亚基的小分子鲜见报道。

山竹醇是藤黄中提取的聚酮和异戊烯基特殊结构的具有药用和营养价值的天然产物, 能够抑制胆碱酯酶和乙酰胆碱酶^{[16, 17]}, 具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等广泛生物学活性^{[18, 19]}。山竹醇通过抑制转移、诱导凋亡等方式^[20], 在结直肠癌和肝癌等癌症中发挥抗肿瘤作用, 被视为下一代表观遗传药物的候选药物^[18], 但其靶标和药物作用机制尚不明确^[21]。26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11 (26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 11, RPN6) 被认为是连接19S和20S的形成完全活化的26S蛋白酶体所必需的分子钳^[22], 其通过表面区域与盖子、基底和20S的亚基结合, 维持基底-盖子和20S-19S的相互作用, 以保持蛋白酶体的结构完整性。除稳定26S外, 许多研究还证实了RPN6的其他重要生理功能。RPN6对果蝇的发育、细胞增殖和形态发生至关重要, 通过增加蛋白酶体的组装和活性显著延长秀丽隐杆线虫的寿命, 并促进酿酒酵母中其他盖子亚基正确发挥调节作用^[23-26]。RPN6功能缺失会导致疾病的发生发展^[27], 是蛋白酶体调控细胞稳态的关键蛋白。本研究揭示了山竹醇能够直接结合蛋白酶体19S上的RPN6, 依赖RPN6抑制蛋白酶体的水解酶活性, 并引起泛素蛋白积累, 进而发挥抗肿瘤作用。

材料与方法

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材料人结肠癌细胞HCT116、人多发性骨髓瘤细胞MM1S和人胚胎肾细胞HEK293、HEK293T均购自中国科学院细胞库; 山竹醇购自美国MedChemExpress生物科技公司; 蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购自上海罗氏制药有限公司; 二甲基亚砜、链霉蛋白酶、ubiquitin抗体、Duolink® PLA试剂盒购自西格玛奥德里奇(上海) 贸易有限公司(Sigma-Aldrich); RPMI 1640培养基、DMEM培养基及胎牛血清购自美国Gibco Life Technologies生物试剂有限公司; 青链霉-链霉素溶液(PS) 购自美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen); Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、快速银染试剂盒、Hoechst、4%多聚甲醛溶液、Triton X-100、BSA、TEV蛋白酶及其缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司; RPN6、GAPDH抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司(Proteintech Group, Inc); mouse-488荧光二抗及rabbit-568荧光二抗购自Cell Signaling Technology公司; HER-山羊抗鼠二抗及HER-山羊抗兔二抗购自Jackson ImmunoResearch公司; 荧光底物Suc-LLVY-AMC、RPN6纯化蛋白购自美国R & D Systems公司; siRNA和siRNA-mate购自苏州吉玛基因股份有限公司; CCK-8试剂购自美国APExBIO公司; APC杂合突变小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司; 高容量Neutravidin琼脂糖树脂购自赛默飞世尔科技公司。

细胞培养 所有细胞均在添加1% (v/v) 青霉素-链霉素和10% (v/v) 胎牛血清的培养基中生长。HCT116、HEK293和MM1S细胞均在含5% CO₂的37 ℃培养箱中培养。

Western blot实验 用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞, 置于冰上裂解30 min后, 放入提前预冷至4 ℃的离心机中, 14 000 r·min^-1离心15 min。取蛋白上清液进行BSA定量。根据蛋白浓度取适量蛋白加入5×SDS上样缓冲液, 放入100 ℃金属浴中变性10 min, 制备得到样品。每个样品以20 μg蛋白量用10% SDS凝胶进行电泳, 并转移到PVDF膜上, 5%脱脂奶粉封闭, 一抗和二抗依次孵育, 化学发光法检测条带, 或电泳后利用快速银染试剂盒染色检测条带。

药物亲和力反应靶标稳定性实验(DARTS) HCT116细胞用含有蛋白酶抑制剂的M-PER裂解液进行裂解, 14 000 ×g离心15 min, 定量后用PBS将蛋白浓度定量在4~6 mg·mL^-1。将蛋白液分装到EP管中, 在室温下与药物共同孵育1 h后, 再用浓度梯度pronase酶进行蛋白水解30 min, 最后加入蛋白酶抑制剂终止消化。酶切浓度为1∶100 (1 μg pronase/100 μg蛋白), 最后加入蛋白酶抑制剂终止消化。样品变性后用于Western blot实验。

蛋白酶体催化活性实验 使用6孔板, 每孔接种3×10⁵个细胞, 贴壁后, 加入待测药物培养16 h, 弃去培养基, PBS洗两遍, 用IP裂解液(加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂) 温和提取蛋白, 定量至同一浓度, 随后加入荧光底物Suc-LLVY-AMC (25 μmol·L^-1), 避光于酶标仪连续1 h读取荧光值(Ex: 320, Em: 460)。

蛋白酶体纯化 参考Huang等^[28]的实验方案, 通过生物素亲和层析方法纯化26S蛋白酶体。hRpn11 (POH1) 位于26S蛋白酶体调节颗粒上, 介导底物去泛素和去折叠, 是蛋白酶体重要组成部分, 通过hRpn11下拉整个复合物是蛋白酶体亲和纯化的重要手段^[29]。课题组前期构建了hRpn11-HTBH稳转的HEK293T细胞, 将稳转细胞培养至一定数量后, 使用裂解缓冲液裂解细胞, 将上清液与高容量neutravidin琼脂糖树脂孵育过夜, 通过生物素标签HTBH富集蛋白酶体。接着, 通过裂解缓冲液广泛洗去多余的非特异性结合蛋白后, 利用TEV蛋白酶切除标签, 用TEV蛋白酶缓冲液将蛋白酶体从树脂上洗脱下来。最后, 通过浓缩获得较高浓度的26S蛋白酶体。为了监控整个纯化过程, 所有步骤均留样进行考马斯亮蓝染色。

免疫荧光实验 将HEK293和HCT116细胞以1×10⁴个/450 μL的密度接种到共聚焦皿中, 细胞贴壁后给药。细胞用4%多聚甲醛固定, 0.1% Triton X-100通透, 5% BSA溶液封闭。再用一抗和二抗依次孵育, 用Hoechst染液染细胞核。使用共聚焦显微镜进行拍照。

邻位连接技术(PLA) 将HEK293细胞以1×10⁴个/450 μL的密度接种到共聚焦皿中, 细胞贴壁后给药。细胞用4%多聚甲醛固定, 0.1% Triton X-100通透, 接着用Duolink® PLA封闭缓冲液37 ℃封闭1 h。4 ℃孵育一抗过夜, 洗涤后按照Duolink® PLA荧光实验方案进行Duolink® PLA实验。所有孔加入Duolink®抗兔PLUS和抗兔MINUS探针孵育, 使用Duolink^®原位检测试剂生成PLA信号。用Hoechst染液染细胞核。使用共聚焦显微镜进行拍照。

siRNA敲低实验 将HEK293细胞接种至12孔板中, 次日待细胞密度为50%时, 将siRNA与siRNA-mate在基础培养基中共孵育后, 均匀滴加至细胞中, 转染60 h后提取蛋白进行后续检测。敲低RPN6的siRNA序列如下: 5'-UAGUAAGUUAUCAUACAACUUGGCC-3'。

CCK-8实验 将HCT116和MM1S细胞以5 000个/孔的密度接种于96孔板中, 待细胞贴壁后进行给药处理。给药72 h后, 每孔按培养基∶CCK-8 = 10∶1的比例加入CCK-8试剂, 37 ℃孵育约1 h, 用酶标仪在波长450 nm下测定吸光度(A) 值, 抑制率= A_Garcinol/A_DMSO值。

FITC-PI染色-流式细胞术 将HCT116、HEK293细胞以2.5×10⁵个/孔密度接种到12孔板上, 将MM1S细胞以4×10⁵个/孔密度接种到12孔板上, 贴壁后给药处理48 h, 然后用不含EDTA的胰蛋白酶对细胞进行消化, 收集孔中所有细胞, 用PBS洗2遍, 用碧云天Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色, 然后用CytoFLEX S流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况。

类器官实验 按bioGenousTM Mouse Intestinal Organoid Kit Plus (bioGenous, K2001P-MI) 试剂盒流程提取APC突变C57BL/6J鼠类器官。通过手术获取的Apc^min/+小鼠组织小肠样本, 用无菌剪刀切割成2 cm组织块, 肠隐窝分离溶液分离小鼠隐窝后, 隐窝回收液洗涤, 重悬, 离心去上清。随后, 组织沉淀与Organoid Culture ECM (bioGenousTM, M315066) 按大约1∶3的比例在冰上均匀混合, 并迅速地分布在24孔板上, 形成半球状滴珠。在37 ℃下孵化15 min以促使滴珠凝固后, 每个孔中加入适量的培养基(mouse intestinal organoid medium, bioGenous K2001P), 每3天更换1次培养基。

统计学分析 应用GraphPad Prism 10软件对数据进行统计分析, 多组间进行定量比较分析。P < 0.05为数据差异有统计学意义。

结果

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1 山竹醇靶向蛋白酶体19S亚基RPN6

首先通过DARTS联用质谱(DARTS-MS) 鉴定山竹醇的直接结合蛋白。DARTS基于药物与蛋白质结合后稳定目标蛋白质的结构, 使其对蛋白酶的敏感性发生变化^[30], 同时联用质谱精准检测差异蛋白, 从而确定药物的具体靶点, 是药物靶标鉴定的经典手段。结果发现, 山竹醇经链霉蛋白酶处理后, 与对照组相比, 能够显著下调RPN6的蛋白水平, 提示RPN6为其潜在靶点(图 1A)。RPN6是蛋白酶体19S上的一个关键亚基蛋白, 介导蛋白酶体构象变化, 促进19S和20S组装^{[3, 23]}, 对于蛋白酶体行使功能进而维持细胞稳态具有至关重要的作用。

本研究通过生物素亲和层析方法纯化得到26S蛋白酶体(图 1B), 进而将山竹醇与26S蛋白酶体进行孵育, DARTS实验结果表明山竹醇在链霉蛋白酶酶切条件下能够明显稳定26S各亚基蛋白(图 1C), 表明了山竹醇作用于蛋白酶体。本研究进一步利用RPN6纯化蛋白, 经链霉蛋白酶酶解后考察了山竹醇的作用; 结果显示在1∶100的酶切条件下山竹醇即能稳定RPN6的条带, 在1∶30和1∶10时该稳定作用非常显著(图 1D)。此外, 在HCT116细胞裂解液中同样观察到山竹醇能够明显改变RPN6对酶的耐受性(图 1E)。由此, 本研究证实了山竹醇与RPN6的直接结合。

2 山竹醇依赖RPN6抑制蛋白酶体活性

本研究在HEK293和MM1S细胞系中检测山竹醇对蛋白酶体水解酶活性的作用。HEK293是无致癌突变的人胚胎肾细胞, MM1S是浆细胞来源的血液系统恶性多发性骨髓瘤细胞。采用蛋白酶体催化活性实验, 在MM1S和HEK293细胞中经山竹醇处理后, 提取蛋白后定量至同一浓度, 加入蛋白酶体特异性荧光底物Suc-LLVY-AMC, 于酶标仪连续读取荧光值1 h。结果显示, 山竹醇在HEK293、MM1S细胞系中对蛋白酶体水解酶活性均具有抑制作用(图 2A)。给药2.5和5 μmol·L^-1时, 山竹醇对于HEK293并无明显酶活抑制作用, 给药10和20 μmol·L^-1时能观察到对β5的水解酶活性抑制(图 2A)。值得注意的是, 在MM1S细胞系中, 2.5 μmol·L^-1药物处理就能观测到蛋白酶体水解酶活性抑制作用, 20 μmol·L^-1能抑制蛋白水解酶活性超过50% (图 2A)。

由于山竹醇与RPN6直接结合, 因此, 本研究进一步探究RPN6是否为山竹醇发挥蛋白酶体抑制作用的功能靶标。在HEK293细胞中, 通过转染特异性siRNA敲低RPN6, 药物处理后测定蛋白酶体水解酶活性, 结果显示敲低RPN6显著缓解了山竹醇引起的水解酶活性抑制作用(图 2B), 表明山竹醇抑制蛋白酶体依赖于RPN6, RPN6是山竹醇不可或缺的功能靶点。

3 山竹醇诱导RPN6寡聚而形成颗粒并引起泛素蛋白积累

已经证实RPN6为山竹醇的功能靶标, 本研究进一步探究山竹醇对RPN6的调控机制。运用免疫荧光实验观测山竹醇对RPN6的影响, 发现药物处理12 h后RPN6的荧光强度增强, 并在核内形成点状颗粒(图 3A), 24 h颗粒直径变大(图 3A), 亮度增强。又通过PLA实验测定山竹醇对RPN6蛋白自身寡聚的作用。PLA技术使用了一对DNA邻位探针, 当蛋白质间存在相互作用时, 由于其邻近效应而产生点状信号^[31], 该技术可以用于观测单一蛋白的自身寡聚^[32]。结果显示, 与空白组的微弱信号相比, 山竹醇处理12 h使RPN6产生大量PLA信号(图 3B), 表明山竹醇诱导RPN6形成自身寡聚。

同时, 运用免疫荧光实验观测山竹醇对泛素蛋白的改变, 在HEK293细胞中经10 μmol·L^-1药物处理, 在24和48 h分别观测泛素蛋白在细胞内的变化, 发现药物处理24 h能够引起泛素蛋白的积累, 并在胞质内形成聚集, 48 h该聚集作用显著增强(图 3C)。

4 山竹醇促进肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤类器官生长

本研究运用CCK-8实验测定山竹醇对肿瘤细胞增殖的影响, 结果显示山竹醇在HCT116和MM1S细胞中2.5 μmol·L^-1即有肿瘤细胞抑制作用, 在10和20 μmol·L^-1时抑制效果明显增强(图 3D), 表明山竹醇对肿瘤细胞增殖的抑制作用。由此, 进一步运用流式实验检测山竹醇引起的细胞凋亡。分别在MM1S、HCT116和HEK293细胞中给药10和20 μmol·L^-1, 用Annexin V-FITC凋亡试剂盒在流式细胞仪上检测了山竹醇引起的细胞凋亡, 蛋白酶体抑制剂MG132作为阳性对照^{[33, 34]}。实验结果表明, 山竹醇引起MM1S细胞凋亡与药物浓度梯度成正比, 且10 μmol·L^-1时就具有显著作用(图 4A)。在HCT116细胞中, 细胞凋亡同样与药物浓度梯度成正比, 20 μmol·L^-1药物处理引起超过95%细胞凋亡(图 4A)。而在HEK293细胞系, 10 μmol·L^-1药物处理几乎不引起细胞凋亡, 20 μmol·L^-1时引起轻微凋亡作用(图 4A)。与正常细胞HEK293相比较, 结肠癌细胞系HCT116和多发性骨髓瘤细胞系MM1S细胞对山竹醇引起的细胞凋亡呈现出高敏感性, 提示了山竹醇对肿瘤细胞的选择性, 以及肿瘤细胞对山竹醇的高敏感性。

类器官(organoid) 是来源于干细胞或器官祖细胞的三维细胞聚集体, 可分化和自组织形成具有人体相应器官的部分特定功能和结构^[35], 其具有近生理性, 可模拟器官发育和形成, 并在体外长期扩增中具有基因组稳定性, 是研究和治疗癌症的优越体外模型^{[36, 37]}。因此, 本研究进一步构建了APC杂合突变小鼠小肠腺瘤(Apc^min/+) 类器官模型, 结果发现, 溶剂对照组中的类器官能够随时间快速生长(图 4B), 而山竹醇给药后, 类器官生长非常缓慢。20 μmol·L^-1药物处理时抑制作用更为显著, 48及72 h观察到类器官几乎不生长, 且山竹醇能够引起部分类器官死亡(图 4B)。以上结果表明, 山竹醇在低浓度时就具有良好的抗肿瘤活性。

讨论

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山竹醇是藤黄中提取的具有聚酮和异戊烯基特殊结构的天然产物, 其生物学活性和肿瘤药理作用被广泛报道^{[18, 19]}, 在肿瘤治疗中具有重要的应用前景, 但其分子靶标和抗肿瘤作用机制还需进一步研究。本研究通过DARTS-MS实验发现山竹醇的潜在作用靶标为蛋白酶体19S上的RPN6。

RPN6是蛋白酶体19S上一个关键的蛋白, 能够调节蛋白酶体的组装及其活性^{[3, 25]}, 对于蛋白酶体行使功能进而维持细胞稳态有着至关重要的作用。并被认为调节肿瘤代谢相关途径^{[38, 39]}, 参与肿瘤的发展, 但其作用机制尚未明确, 且目前尚无靶向RPN6的生物活性分子。本研究经DARTS, 在纯化的蛋白酶体、纯化的RPN6以及细胞裂解液中, 证实了山竹醇的靶标蛋白是RPN6。

在蛋白酶体催化活性实验中发现, 山竹醇对MM1S和HEK293均有水解酶活性抑制作用, 是一种新型蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体抑制剂是多发性骨髓瘤治疗中有效的药物之一, 因多发性骨髓瘤细胞具有遗传不稳定和快速增殖的特点, 其更依赖于蛋白酶体, 以去除错误折叠或损伤的蛋白质, 由此多发性骨髓瘤对于蛋白酶体抑制剂高度敏感^{[11, 40]}。因而相较于正常组织细胞中的蛋白酶体, 山竹醇对MM1S的酶活抑制作用更强。敲低RPN6大部分阻断了山竹醇引起的酶活性抑制作用, 表明RPN6是山竹醇抑制蛋白酶体的功能靶点。通过免疫荧光实验观测山竹醇对RPN6的改变, 发现山竹醇引起RPN6在核内形成点状明亮颗粒, 并随时间增加增强。以及通过PLA观测到山竹醇诱导RPN6的寡聚, 推测山竹醇诱导RPN6寡聚后形成颗粒, 使蛋白酶体功能失衡, 水解酶活性降低。进一步利用免疫荧光实验观测到山竹醇引起泛素蛋白在胞质积累并形成聚集物。

研究通过FITC-PI染色-流式细胞术探究了山竹醇引起的细胞凋亡作用在肿瘤细胞MM1S和HCT116中尤为显著, 与CCK8实验中山竹醇抑制肿瘤细胞增殖作用一致。肿瘤细胞因其抵抗细胞死亡、无限增殖等特点^[41], 其体内蛋白酶体含量更多, 功能更强大, 因而对蛋白酶体抑制剂也更加敏感, 对于山竹醇引起的细胞凋亡响应更积极。本研究在Apc^min/+小鼠小肠类器官中发现, 山竹醇在10 μmol·L^-1时就能显著抑制腺瘤类器官的生长, 证实了山竹醇的抗肿瘤活性。

综上所述, 研究结果表明山竹醇通过靶向19S上的RPN6亚基蛋白, 诱导RPN6寡聚并形成颗粒, 致使蛋白酶体功能紊乱而抑制其水解酶活性, 导致泛素蛋白的大量积累, 进而引起肿瘤细胞的凋亡, 从而发挥良好的抗肿瘤作用。本研究发现了具有高效蛋白酶体抑制活性及良好抗肿瘤作用的中药活性小分子山竹醇, 阐明了分子作用机制, 并提示其靶点RPN6有望成为一个新的肿瘤治疗靶标。

作者贡献: 柯细松和喻颖负责课题总体设计; 喻颖负责完成实验的具体实施; 张雪和喻颖负责实验数据分析、文章撰写; 柯细松和张雪对课题进行及论文撰写进行指导。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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国家自然科学基金面上项目(82173845)
国家自然科学基金面上项目(82274147)
国家自然科学基金面上项目(82204430)
上海市教育委员会科研创新计划重大项目(2021-01-07-00-10-E00116)
上海市教育委员会科研创新计划重大项目(2023-01-07-00-10-E00046)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2025年第60卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-1024

接收时间：2024-10-21
首发时间：2025-11-07
出版时间：2025-02-12

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收稿日期：2024-10-21
修回日期：2024-11-22

基金

国家自然科学基金面上项目(82173845)

国家自然科学基金面上项目(82274147)

国家自然科学基金面上项目(82204430)

上海市教育委员会科研创新计划重大项目(2021-01-07-00-10-E00116)

上海市教育委员会科研创新计划重大项目(2023-01-07-00-10-E00046)

作者信息

上海中医药大学交叉科学研究院, 上海 201203

通讯作者:

^*柯细松, Tel: 86-21-51322419

张雪, E-mail: xuezhang@shutcm.edu.cn

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2024-1024

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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