药学学报

Mutant	Sequence of primer (5'→3')
α6/α3[I34M]	FM: GCACTTTGAGTTGGCCATGACGCAGCTGGC
	RM: GCCAGCTGCGTCATGGCCAACTCAAAGTGC
α6/α3[C63K]	FM: GGAAGGACTACAGATTGAAATGGGATCCAACGGAGTACGATGGC
	RM: GCCATCGTACTCCGTTGGATCCCATTTCAATCTGTAGTCCTTCC
α6/α3[V112E]	FM: GTACGATGGGGAAATAACCTGGACCCCGCCAGC
	RM: GCTGGCGGGGTCCAGGTTATTTCCCCATCGTAC
α6/α3[T116I]	FM: GGGGTGATAACCTGGATCCCGCCAGCC
	RM: GGCTGGCGGGATCCAGGTTATCACCCC
α6/α3[S140T]	FM: CCCATTTGATCATCAAAACTGCACCCTGAAATTTGGG
	RM: CCCAAATTTCAGGGTGCAGTTTTGATGATCAAATGGG
α6/α3[T147S]	FM: CCTGAAATTTGGGTCCTGGTCCTACGACAAGGCTG
	RM: CAGCCTTGTCGTAGGACCAGGACCCAAATTTCAGG
α6/α3[E152K]	FM: GGACTTACGACAAGGCTAAGATCGACCTTCTCATCATTGG
	RM: CCAATGATGAGAAGGTCGATCTTAGCCTTGTCGTAAGTCC

Mutant	Sequence of primer (5'→3')
α6/α3[I34M]	FM: GCACTTTGAGTTGGCCATGACGCAGCTGGC
	RM: GCCAGCTGCGTCATGGCCAACTCAAAGTGC
α6/α3[C63K]	FM: GGAAGGACTACAGATTGAAATGGGATCCAACGGAGTACGATGGC
	RM: GCCATCGTACTCCGTTGGATCCCATTTCAATCTGTAGTCCTTCC
α6/α3[V112E]	FM: GTACGATGGGGAAATAACCTGGACCCCGCCAGC
	RM: GCTGGCGGGGTCCAGGTTATTTCCCCATCGTAC
α6/α3[T116I]	FM: GGGGTGATAACCTGGATCCCGCCAGCC
	RM: GGCTGGCGGGATCCAGGTTATCACCCC
α6/α3[S140T]	FM: CCCATTTGATCATCAAAACTGCACCCTGAAATTTGGG
	RM: CCCAAATTTCAGGGTGCAGTTTTGATGATCAAATGGG
α6/α3[T147S]	FM: CCTGAAATTTGGGTCCTGGTCCTACGACAAGGCTG
	RM: CAGCCTTGTCGTAGGACCAGGACCCAAATTTCAGG
α6/α3[E152K]	FM: GGACTTACGACAAGGCTAAGATCGACCTTCTCATCATTGG
	RM: CCAATGATGAGAAGGTCGATCTTAGCCTTGTCGTAAGTCC

nAChR subtype	Concentration of plasmid/μg·μL^-1	A₂₆₀/A₂₈₀	Concentration of linearized plasmid/μg·μL^-1	A₂₆₀/A₂₈₀	Concentration of cRNA/ μg·μL^-1	A₂₆₀/A₂₈₀
α6/α3	0.24	1.88	0.23	1.85	0.56	1.98
β2	0.26	1.85	0.29	1.87	1.11	2.01
β3	0.31	1.87	0.35	1.84	0.75	1.97
α6/α3[I34M]	0.28	1.86	0.28	1.85	0.62	1.99
α6/α3[C63K]	0.24	1.89	0.27	1.87	0.66	1.92
α6/α3[V112E]	0.26	1.86	0.21	1.88	0.97	1.99
α6/α3[T116I]	0.22	1.87	0.29	1.89	0.84	2.03
α6/α3[S140T]	0.25	1.86	0.26	1.86	0.78	1.98
α6/α3[T147S]	0.21	1.88	0.25	1.85	0.59	2.01
α6/α3[E152K]	0.20	1.85	0.24	1.88	0.79	2.05

nAChR subtype	Concentration of plasmid/μg·μL^-1	A₂₆₀/A₂₈₀	Concentration of linearized plasmid/μg·μL^-1	A₂₆₀/A₂₈₀	Concentration of cRNA/ μg·μL^-1	A₂₆₀/A₂₈₀
α6/α3	0.24	1.88	0.23	1.85	0.56	1.98
β2	0.26	1.85	0.29	1.87	1.11	2.01
β3	0.31	1.87	0.35	1.84	0.75	1.97
α6/α3[I34M]	0.28	1.86	0.28	1.85	0.62	1.99
α6/α3[C63K]	0.24	1.89	0.27	1.87	0.66	1.92
α6/α3[V112E]	0.26	1.86	0.21	1.88	0.97	1.99
α6/α3[T116I]	0.22	1.87	0.29	1.89	0.84	2.03
α6/α3[S140T]	0.25	1.86	0.26	1.86	0.78	1.98
α6/α3[T147S]	0.21	1.88	0.25	1.85	0.59	2.01
α6/α3[E152K]	0.20	1.85	0.24	1.88	0.79	2.05

nAChR	EC₅₀/μmol·L^{-1 a}	Hill slope^a	Ratio (mutant WT α6/α3β2β3)
α6/α3β2β3	18.5 (13.3-25.8)	1.1 (0.8-1.5)	1.0
α6/α3[I34M]β2β3	6.0 (4.8-7.6)	0.9 (0.8-1.1)	0.3
α6/α3[C63K]β2β3	4.7 (3.6-6.1)	0.8 (0.7-1.0)	0.3
α6/α3[V112E]β2β3	3.5 (2.5-4.7)	0.9 (0.7-1.1)	0.2
α6/α3[T116I]β2β3	9.2 (6.8-12.4)	1.4 (0.8-1.7)	0.5
α6/α3[S140T]β2β3	9.5 (6.6-13.6)	1.0 (0.7-1.2)	0.5
α6/α3[T147S]β2β3	4.4 (2.5-7.5)	1.0 (0.6-1.5)	0.2
α6/α3[E152K]β2β3	2.0 (1.3-3.1)	1.1 (0.7-1.6)	0.1

nAChR	EC₅₀/μmol·L^{-1 a}	Hill slope^a	Ratio (mutant WT α6/α3β2β3)
α6/α3β2β3	18.5 (13.3-25.8)	1.1 (0.8-1.5)	1.0
α6/α3[I34M]β2β3	6.0 (4.8-7.6)	0.9 (0.8-1.1)	0.3
α6/α3[C63K]β2β3	4.7 (3.6-6.1)	0.8 (0.7-1.0)	0.3
α6/α3[V112E]β2β3	3.5 (2.5-4.7)	0.9 (0.7-1.1)	0.2
α6/α3[T116I]β2β3	9.2 (6.8-12.4)	1.4 (0.8-1.7)	0.5
α6/α3[S140T]β2β3	9.5 (6.6-13.6)	1.0 (0.7-1.2)	0.5
α6/α3[T147S]β2β3	4.4 (2.5-7.5)	1.0 (0.6-1.5)	0.2
α6/α3[E152K]β2β3	2.0 (1.3-3.1)	1.1 (0.7-1.6)	0.1

烟碱型乙酰胆碱受体α6/α3β2β3突变型的构建及其功能研究

PDF下载

唐则佩 , 周煊 , 安佰雪 , 于津鹏 , 罗素兰 ^* , 长孙东亭 ^*

药学学报 | 研究论文 2026,61(1): 184-193

收起

药学学报 |研究论文 2026 , 61 (1) : 184 -193

烟碱型乙酰胆碱受体α6/α3β2β3突变型的构建及其功能研究

全屏

[Author(id=1308816776671097397, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, orderNo=0, firstName=null, middleName=null, lastName=null, nameCn=null, orcid=null, stid=null, country=null, authorPic=null, dead=0, email=null, emailSecond=null, emailThird=null, correspondingAuthor=0, authorType=1, ext={EN=AuthorExt(id=1308816776851452471, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816776671097397, language=EN, stringName=Ze-pei TANG, firstName=Ze-pei, middleName=null, lastName=TANG, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=null, address=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null), CN=AuthorExt(id=1308816776960504376, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816776671097397, language=CN, stringName=唐则佩, firstName=null, middleName=null, lastName=null, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=null, address=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null)}, companyList=[AuthorCompany(id=1308816776587211313, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, xref=null, ext=[AuthorCompanyExt(id=1308816776595599922, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=EN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China), AuthorCompanyExt(id=1308816776608182835, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=CN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004)])]), Author(id=1308816777065361978, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, orderNo=1, firstName=null, middleName=null, lastName=null, nameCn=null, orcid=null, stid=null, country=null, authorPic=null, dead=0, email=null, emailSecond=null, emailThird=null, correspondingAuthor=0, authorType=1, ext={EN=AuthorExt(id=1308816777174413884, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816777065361978, language=EN, stringName=Xuan ZHOU, firstName=Xuan, middleName=null, lastName=ZHOU, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=null, address=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null), CN=AuthorExt(id=1308816777333797437, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816777065361978, language=CN, stringName=周煊, firstName=null, middleName=null, lastName=null, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=null, address=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null)}, companyList=[AuthorCompany(id=1308816776587211313, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, xref=null, ext=[AuthorCompanyExt(id=1308816776595599922, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=EN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China), AuthorCompanyExt(id=1308816776608182835, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=CN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004)])]), Author(id=1308816777396711999, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, orderNo=2, firstName=null, middleName=null, lastName=null, nameCn=null, orcid=null, stid=null, country=null, authorPic=null, dead=0, email=null, emailSecond=null, emailThird=null, correspondingAuthor=0, authorType=1, ext={EN=AuthorExt(id=1308816777744839233, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816777396711999, language=EN, stringName=Bai-xue AN, firstName=Bai-xue, middleName=null, lastName=AN, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=null, address=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null), CN=AuthorExt(id=1308816777824531010, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816777396711999, language=CN, stringName=安佰雪, firstName=null, middleName=null, lastName=null, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=null, address=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null)}, companyList=[AuthorCompany(id=1308816776587211313, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, xref=null, ext=[AuthorCompanyExt(id=1308816776595599922, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=EN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China), AuthorCompanyExt(id=1308816776608182835, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=CN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004)])]), Author(id=1308816778105549380, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, orderNo=3, firstName=null, middleName=null, lastName=null, nameCn=null, orcid=null, stid=null, country=null, authorPic=null, dead=0, email=null, emailSecond=null, emailThird=null, correspondingAuthor=0, authorType=1, ext={EN=AuthorExt(id=1308816778214601286, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816778105549380, language=EN, stringName=Jin-peng YU, firstName=Jin-peng, middleName=null, lastName=YU, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=null, address=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null), CN=AuthorExt(id=1308816778533368391, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816778105549380, language=CN, stringName=于津鹏, firstName=null, middleName=null, lastName=null, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=null, address=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null)}, companyList=[AuthorCompany(id=1308816776587211313, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, xref=null, ext=[AuthorCompanyExt(id=1308816776595599922, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=EN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China), AuthorCompanyExt(id=1308816776608182835, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=CN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004)])]), Author(id=1308816778600477257, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, orderNo=4, firstName=null, middleName=null, lastName=null, nameCn=null, orcid=null, stid=null, country=null, authorPic=null, dead=0, email=sulan2021@gxu.edu.cn, emailSecond=null, emailThird=null, correspondingAuthor=1, authorType=1, ext={EN=AuthorExt(id=1308816778684363339, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816778600477257, language=EN, stringName=Su-lan LUO, firstName=Su-lan, middleName=null, lastName=LUO, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=^*, address=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null), CN=AuthorExt(id=1308816778789220940, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816778600477257, language=CN, stringName=罗素兰, firstName=null, middleName=null, lastName=null, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=^*, address=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null)}, companyList=[AuthorCompany(id=1308816776587211313, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, xref=null, ext=[AuthorCompanyExt(id=1308816776595599922, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=EN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China), AuthorCompanyExt(id=1308816776608182835, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=CN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004)])]), Author(id=1308816778940215886, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, orderNo=5, firstName=null, middleName=null, lastName=null, nameCn=null, orcid=null, stid=null, country=null, authorPic=null, dead=0, email=zhangsundt@163.com, emailSecond=null, emailThird=null, correspondingAuthor=1, authorType=1, ext={EN=AuthorExt(id=1308816779011519056, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816778940215886, language=EN, stringName=Dong-ting ZHANGSUN, firstName=Dong-ting, middleName=null, lastName=ZHANGSUN, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=^*, address=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null), CN=AuthorExt(id=1308816779099599441, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, authorId=1308816778940215886, language=CN, stringName=长孙东亭, firstName=null, middleName=null, lastName=null, prefix=null, suffix=null, authorComment=null, nameInitials=null, affiliation=null, department=null, xref=^*, address=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004, bio=null, bioImg=null, bioContent=null, aboutCorrespAuthor=null)}, companyList=[AuthorCompany(id=1308816776587211313, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, xref=null, ext=[AuthorCompanyExt(id=1308816776595599922, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=EN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China), AuthorCompanyExt(id=1308816776608182835, tenantId=1146029695717560320, journalId=1189982191388893191, articleId=1308816774754300452, companyId=1308816776587211313, language=CN, country=null, province=null, city=null, postcode=null, companyName=null, departmentName=null, remark=广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004)])])]

唐则佩, 周煊, 安佰雪, 于津鹏, 罗素兰^*, 长孙东亭^*

作者信息

广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004

通讯作者:

罗素兰, Tel: 86-771-3949335, E-mail: sulan2021@gxu.edu.cn

长孙东亭, E-mail: zhangsundt@163.com

作者简介:

作者贡献:

唐则佩负责质粒突变体构建、cRNA制备、电生理检测、数据分析、论文撰写; 周煊、安佰雪负责质粒提取; 于津鹏、罗素兰、长孙东亭负责实验设计、实验指导和论文审阅修改。

Construction and function of nicotinic acetylcholine receptor α6/α3β2β3 mutants

Ze-pei TANG, Xuan ZHOU, Bai-xue AN, Jin-peng YU, Su-lan LUO^*, Dong-ting ZHANGSUN^*

Affiliations

Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, School of Medicine, Guangxi University, Nanning 530004, China

出版时间: 2026-01-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2025-0693

文章导航

摘要

收起

烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChR) α6/α3β2β3亚型广泛分布于中脑边缘多巴胺能神经通路等区域, 对多种神经递质的释放和药物奖励机制具有重要影响, 因此已成为多种神经精神疾病和药物成瘾治疗的潜在靶点。然而, 目前已发现的能够高效特异性作用于α6/α3β2β3 nAChRs的配体分子多无法将该亚型与较为相似的α3β2亚型有效区分开, 且尚缺乏特异性配体作用于α6/α3β2β3 nAChR的分子机制研究。本研究综合利用受体定点诱变、体外转录、显微注射、电生理检测等技术, 在非洲爪蟾卵母细胞中建立了野生型α6/α3β2β3 nAChR及其α6/α3亚基单点突变体药物筛选模型, 并进一步分析了单氨基酸残基置换对α6/α3β2β3 nAChRs的功能影响。本研究所涉及的动物实验方案已通过广西大学伦理委员会审批(批准号: GXU-2023-0249)。结果表明, 乙酰胆碱(acetylcholine, ACh) 激活野生型α6/α3β2β3 nAChR的半激活剂量(half maximal effective concentration, EC₅₀) 为18.5 μmol·L^-1。7种α6/α3亚基单点突变均导致激动剂活性不同程度的提升, 其中ACh作用于α6/α3[V112E]β2β3、α6/α3[T147S]β2β3、α6/α3[E152K]β2β3 nAChR的活性变化最为显著, EC₅₀分别3.5、4.4、2.0 μmol·L^-1, 约为本体的0.1~0.2倍。相关结果为α6/α3β2β3 nAChRs的结构-功能研究、与药物特异性结合的分子机制研究提供了模型, 也为靶向α6/α3β2β3 nAChRs的药物设计和专一性改造优化提供了理论依据。

关键词

α6/α3β2β3烟碱型乙酰胆碱受体 / PCR介导的定点诱变 / 双电极电压钳 / 非洲爪蟾卵母细胞 / 半激活剂量

Abstract

收起

α6/α3β2β3 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) subtype is widely expressed in mesolimbic dopaminergic pathway and other regions, which plays a vital role in modulating the release of multiple neurotransmitters and drug reward mechanisms. It has become a potential therapeutic target for the treatment of various neuropsychiatric disorders and drug addiction. However, most ligands identified with high affinity and selectivity targeting α6/α3β2β3 subtype showed limited subtype discrimination against the closely related α3β2 subtype. Furthermore, the molecular mechanisms underlying ligands interact with α6/α3β2β3 nAChR remain absent. In this study, the related approaches of site-directed mutagenesis of receptor, in vitro transcription and electrophysiological assay were utilized to establish the drug screening models of wild-type α6/α3β2β3 nAChR and its α6/α3 subunit single-point mutants. The effects led by single amino acid substitution to the function of α6/α3β2β3 nAChR were also evaluated. The animal experimental protocol involved in this study has been approved by the Ethics Committee of Guangxi University (Approval No: GXU-2023-0249). As the results showed, the half maximal effective concentration (EC₅₀) for ACh activating α6/α3β2β3 nAChR was 18.5 μmol·L^-1. All 7 single-point mutations of α6/α3 subunit resulted in increase of the agonist sensitivity, while the EC₅₀ of ACh towards mutants α6/α3[V112E]β2β3、α6/α3[T147S]β2β3、α6/α3[E152K]β2β3 nAChR decreased to the greatest extent (EC₅₀s were 3.5, 4.4, and 2.0 μmol·L^-1, respectively, which were 0.1-0.2-fold relative to that of the wild-type receptor). These results established models for the research of structure-function relationship of α6/α3β2β3 nAChRs and molecular mechanism of ligand-receptor specific binding, as well as provided theoretical foundation for the design and optimization of selective drug leads targeting α6/α3β2β3 nAChRs.

Key words

α6/α3β2β3 nicotinic acetylcholine receptor / PCR-mediated site-directed mutagenesis / two-electrode voltage clamp technique / Xenopus oocyte / half-maximal excitatory concentration

引用本文

唐则佩, 周煊, 安佰雪, 于津鹏, 罗素兰, 长孙东亭. 烟碱型乙酰胆碱受体α6/α3β2β3突变型的构建及其功能研究. 药学学报, 2026 , 61 (1) : 184 -193 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2025-0693

Ze-pei TANG, Xuan ZHOU, Bai-xue AN, Jin-peng YU, Su-lan LUO, Dong-ting ZHANGSUN. Construction and function of nicotinic acetylcholine receptor α6/α3β2β3 mutants[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2026 , 61 (1) : 184 -193 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2025-0693

正文

收起

nAChRs是一类可由内源性神经递质乙酰胆碱(acetylcholine, ACh) 激活开放的配体门控离子通道。根据其主要分布的组织差异性, 可将其分为肌肉型nAChRs (muscle-type nAChRs) 和神经型nAChRs (neuronal nAChRs)。其中, 神经型nAChRs广泛分布于中枢和外周神经系统以及多种非神经元细胞中, 参与阿尔茨海默病、帕金森氏病、精神分裂症、焦虑、抑郁、神经性疼痛、肺癌等一系列疑难疾病的病理过程, 因此被视为潜在的新型药物治疗靶点进行深入研究^{[1, 2]}。神经型nAChRs由5个亚基聚合组成五聚体而产生功能活性, 而目前在哺乳动物细胞中已鉴定出11种不同的亚基用于神经型nAChRs的功能性组装(α2~α7、α9、α10、β2~β4等)。根据亚基组成方式和配比的差异, 神经型nAChRs又可分为由同种亚基构成的同源五聚体(如α7和α9 nAChRs亚型), 以及由两种不同亚基按特定比例组合构成的异源五聚体(α3β4、α6/α3β2β3、α6β4 nAChRs亚型等)^{[3, 4]}。复杂多变的组成方式为nAChRs不同亚型的功能多样性提供了结构基础, 使其能够在多种生命进程中发挥重要的调控作用。

含α6/α3亚基的nAChRs (α6/α3^* nAChRs) 在中枢神经系统中呈现选择性分布, 主要定位于纹状体、视神经通路及中脑多巴胺能神经元(如腹侧被盖区) 等区域, 在尼古丁依赖和情绪调控等过程中起着关键作用^[5-10]。目前已知的α6/α3^* nAChRs主要包括α6/α3β2β3和α6β4两种亚型, 其中, α6/α3β2β3 nAChRs主要分布于黑质纹状体多巴胺能神经末梢、腹侧被盖区、伏隔核、视网膜、肾上腺嗜铬细胞等区域, 与多种神经递质释放和药物奖赏机制密切相关, 因此, α6/α3β2β3 nAChRs可作为治疗多种神经疾病和药物成瘾的潜在靶点^[11-17]。然而, α6/α3β2β3 nAChRs在体外模型中难以表达, 几乎不能产生可检测的内向电流, 且α6亚基的N-端胞外结合域与α3亚基同源性较高(约为68%), 导致α6/α3β2β3和α3β2 nAChRs配体结合区空间结构较为相似, 现已发现的配体药物多难以将这两种亚型进行有效地区分。如α-芋螺毒素MII可高效阻断α6/α3β2β3和α3β2 nAChR, 其半阻断剂量(half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀) 仅为390 pmol·L^-1, 但同时对α3β2亚型也具有较强的抑制作用(IC₅₀=4.4 nmol·L^-1)^{[18, 19]}。利用受体定点诱变构建技术建立α6/α3亚基突变体, 构建α6/α3β2β3突变体电生理筛选模型, 将为深入探究α6/α3亚基上影响配体结合的关键氨基酸位点及其作用机制, 以及专一性靶向α6/α3β2β3 nAChRs药物的设计、开发和改造提供重要基础。探究α6与α3亚基之间的关键差异位点, 有助于后期α6/α3β2β3和α3β2相关的药物改造, 进一步开发对α6/α3β2β3 nAChRs引起的疾病的专一性药物。高特异性配体药物如α-芋螺毒素TxIB能够专一性靶向α6/α3β2β3 nAChRs, 其IC₅₀仅为28 nmol·L^-1, 而对包括α3β2在内的其他nAChRs亚型无作用^[20-25]。专一性药物的发现为α6/α3β2β3 nAChRs的结构-功能关系、相关疾病发病机制的研究提供宝贵的分子探针和药物先导物, 然而配体-受体相互作用分子机制相关研究的缺乏严重限制了这些高效活性分子的开发和利用。

nAChRs各亚型结构组成较为相似, 对配体结合功能的特异性主要由N-端胞外配体结合区(N-terminal extracellular ligand binding domain, LBD) 决定, 该区域由相邻亚基N-端胞外结构域共同构成, 该区域亚基间一级结构的差异将导致LBD空间结构的变化, 进而影响配体结合特性和离子通道调控机制。单个亚基上特定氨基酸残基的突变可能导致受体的药理学特性发生显著变化, 利用定点诱变技术建立突变体模型并分析受体上关键氨基酸位点在配体结合过程中的重要性, 对于在体外α6/α3β2β3 nAChRs药物筛选模型的建立及优化, nAChRs的结构-功能关系的解析和潜在靶向药物的开发具有重要意义^[26-28]。

本研究利用PCR介导的受体定点诱变技术对α6亚基N-端胞外结构域的特定氨基酸位点进行定向置换, 并在非洲爪蟾卵母细胞中建立野生型和单点突变型α6/α3β2β3 nAChRs药物筛选模型, 通过检测和比较ACh激活野生型和突变型受体通道开放的作用活性变化确定α6亚基上特定位点变化对受体功能的影响, 对受体上影响配体结合的关键氨基酸位点进行探究。该研究的结果可用于α6/α3β2β3 nAChRs的结构-功能研究、可用于靶向药物筛选的α6/α3β2β3 nAChRs体外电生理模型建立及优化、为药物特异性作用于该受体亚型的分子机制分析提供了模型, 也为靶向α6/α3β2β3 nAChRs的药物设计和专一性改造优化提供了理论依据, 对未来α6/α3β2β3 nAChRs相关疾病的机制及其治疗方法的探究奠定了基础。

材料与方法

收起

实验动物 用于获取卵母细胞的2~3年龄雌性非洲爪蟾(Female Xenopus laevis) 由昆明动物研究所提供, 在环境温度17~20 ℃且每日10~12 h光照的实验室条件下养殖超过半年后可开展实验。本研究所涉及的动物实验方案已通过广西大学伦理委员会审批(批准号: GXU-2023-0249)。

实验材料 野生型α6亚基难以在体外诱导表达并产生内向电流, 因此本研究使用α6/α3嵌合体亚基(以α6亚基N-端胞外区氨基酸序列替换α3亚基对应区域) 代替α6亚基进行相关研究^[29]。研究表明, 该嵌合体在提高α6^* nAChR体外表达效率的同时不影响配体的结合作用。包含大鼠α6/α3、β2、β3 nAChR亚基cDNA的质粒获赠于美国Utah大学。SanPrep柱式质粒小量抽提试剂盒(#L312KA8161)、4SGelred核酸染料(#KA10KA6252)、HEPES (#L221BA0001)、硫酸庆大霉素(#K508BA0015)、硫酸链霉素(#H107BA0013)、青霉素G钠盐(#J201BA0009) 购于生工生物工程(上海) 股份有限公司; Q5超保真聚合酶2×预混液(#10263592) 及限制性核酸内切酶Dpn Ⅰ (#10254267) 购于纽英伦生物技术(北京) 有限公司; DL 10, 000 DNA marker (#ANE0253A)、限制性核酸内切酶Sal Ⅰ (#AM91933A)、Nhe Ⅰ (#AN82031A)、MiniBEST DNA片段纯化试剂盒(#AOE0859A) 购于宝日医生物技术(北京) 有限公司; mMESSAGE mMACHINE^TM T7体外转录试剂盒(#2760935)、MEGAclear^TM转录纯化试剂盒(#2978839) 购于赛默飞世尔科技(中国) 有限公司; ACh (#0001433126)、阿托品(#SLBH0009V)、胶原酶A (#9001-12-1) 购于德国Merck公司; 牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 其他试剂均为国产分析纯。

OR-2缓冲液配制如下: 82.5 mmol·L^-1 NaCl, 2.0 mmol·L^-1 KCl, 1.0 mmol·L^-1 MgCl₂, 5 mmol·L^-1 HEPES, pH 7.1~7.7^[29]。

ND-96缓冲液配制如下: 96 mmol·L^-1 NaCl, 2.0 mmol·L^-1 KCl, 1.0 mmol·L^-1 MgCl₂, 1.8 mmol·L^-1 CaCl₂, 5.0 mmol·L^-1 HEPES, pH 7.1~7.7^[25]。

实验仪器 KCL-2000W恒温恒湿培养箱(日本EYELA东京理化器材株式会社); Mastercycler X50s梯度PCR仪(德国Eppendorf AG公司); Fluorchem E凝胶成像系统(美国ProteinSimple Instruments公司); Nanodrop One超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司); P-1000水平拉针仪(美国Sutter Instrument公司); Nanoject Ⅱ显微注射仪(美国Drummond Scientific Company); Dendrite^TM数模转化器(美国Sutter Instrument公司); OC-725D双电极电压钳信号放大器(美国Warner Instruments公司)。

单点诱变引物设计与合成 将α6和α3 nAChR亚基N-端胞外结构域(N-terminal extracellular domain, ECD) 的氨基酸序列进行比对并确定第34、63、112、116、140、147、152位点差异(图1)。根据待突变单点氨基酸及cDNA编码信息, 使用Primer Premier 5.0针对每个突变位点设计一对完全互补的单点突变引物。引物长度一般为25~45 bp, 与底物解链温度(melting temperature, T_m) ≥ 78 ℃, GC含量≥ 40%, 突变位点设计于引物序列中部, 两侧各保留10~15 bp正确碱基序列且以1个或多个G或C碱基结尾^[30]。引物序列如表1所示, 由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

PCR介导的受体定点诱变 以载有α6/α3亚基cDNA的质粒为模板, 与对应的单点诱变引物和Q5超保真聚合酶系按比例混合建立PCR反应体系如下: Q5超保真聚合酶2×预混液25 μL, 两条突变引物各125 ng, 模板质粒100 ng, ddH₂O补至总体积50 μL。利用PCR介导的定点诱变技术分别构建α6/α3亚基单点突变型编码基因, 反应程序设置为: 预变性(95 ℃、2 min), 变性(95 ℃、20 s), 退火(60 ℃、10 s), 延伸(68 ℃、3 min), 18个循环; 最后延伸(68 ℃、5 min)^{[30, 31]}。待PCR反应结束后, 向反应液中加入1 μL Dpn Ⅰ, 充分混匀并在37 ℃继续反应2 h, 水解甲基化质粒模板。使用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测, 确认目的产物条带后, 分别取5 μL PCR产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。转化的细胞在37 ℃、200 r·min^-1培养1 h后涂布于含60 μg·mL^-1氨苄青霉素(ampicillin, Amp⁺) 的LB固体平板, 37 ℃培养16~20 h, 挑取单菌落放入Amp⁺液体LB培养基中, 于37 ℃、200 r·min^-1扩大培养12~14 h。12 000 r·min^-1离心菌液获得菌体, 使用质粒小量抽提试剂盒提取突变体质粒, 并通过生工生物工程(上海) 股份有限公司测序鉴定目标位点突变的正确性。

nAChR亚基cRNA的制备 分别提取载有野生型和突变型nAChRs亚基cDNA的质粒, 并使用对应的限制性内切酶对质粒进行酶切使其线性化。以线性化质粒为模板, 依据mMESSAGE mMACHINE^TM T7体外转录试剂盒说明书建立体外转录体系, 反应获得编码野生型和突变型nAChRs亚基的cRNA, 具体为: 线性化质粒1.0~1.5 ng、10× reaction buffer 2 μL、2× CAP/NTP 10 μL、enzyme mix 2 μL, 无酶ddH₂O补至终体积20 μL, 37 ℃反应10~12 h。使用MEGAclear^TM转录纯化试剂盒回收cRNA产物, 并利用超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对其进行检测鉴定。

非洲爪蟾卵母细胞的分离 挑选性成熟且饲养6个月以上的非洲雌性爪蟾, 冰浴45~60 min使其完全麻醉, 将其腹部朝上置于手术台, 在下腹部距中线1~2 cm处消毒后纵向切开皮肤及肌肉黏膜(切口长约1 cm), 取出适量卵母细胞团块并暂存于OR-2缓冲液中。术后使用可吸收缝合线分别缝合肌肉黏膜和皮肤, 并将爪蟾单独饲养于含青霉素的0.5%生理盐水缓冲液中恢复^[32]。

将取出的卵母细胞团分剪成直径约0.5 cm小团块, 并用OR-2缓冲液反复清洗5~8次至溶液澄清。称取15~20 mg胶原酶A溶于OR-2缓冲液, 与卵母细胞溶液充分混合并定容至25 mL, 75 r·min^-1室温反应30~60 min, 待大部分卵母细胞呈分离状态而不再粘连时, 使用OR-2缓冲液反复清洗卵母细胞10~15次以完全去除胶原酶并终止反应^[33]。挑选处于V~VI期、动植物极分明且生长状态良好的卵母细胞用于显微注射和电生理检测实验。

电生理筛选模型的建立与功能检测 将编码野生型或突变型α6/α3亚基与野生型β2、β3亚基的cRNA按照1∶1∶1 (n∶n∶n) 的比例均匀混合后, 显微注射入挑选好的卵母细胞中, 并确保单亚基注射总量不低于每细胞15 ng。注射后将卵母细胞培养于含抗生素的ND-96缓冲液中, 17 ℃恒温培养4~6天后, 采用双电极电压钳技术检测受体在卵母细胞膜上的表达情况。

使用水平拉针仪拉制用于电生理检测的玻璃电极, 其尖端直径约为1~3 μm, 填充3 mol·L^-1 KCl溶液后电阻值约为0.5~2 MΩ。将卵母细胞置于容积约50 μL的细胞槽中, 设置钳制电压为-70 mV, 并使用含0.1 mg·mL^-1 BSA和1 μmol·L^-1阿托品的ND-96缓冲液以2~4 mL·min^-1流速持续灌流^{[30, 31]}。检测过程中, 每分钟给予细胞2 s不同浓度的ACh (0.1、1、10、50、100、200、500 μmol·L^-1) 脉冲刺激, 记录通道开放产生的内向电流大小, 使用Clampex记录电生理数据。

数据处理 使用Clampfit 11.3分析全细胞电流信号, 以100 μmol·L^-1 ACh诱导产生的内向电流数值为基准(100%), 计算各浓度下ACh诱发电流的反应率, 将浓度与反应率数据导入GraphPad Prism 8.0软件, 采用非线性拟合方程Response% = 100/[1+(EC₅₀/[ACh])^nH] (nH为Hill系数) 分析数据并获得浓度-反应曲线和ACh激活野生型或突变型α6/α3β2β3 nAChR的半激活剂量(half-maximal excitatory concentration, EC₅₀)^[33]。浓度-反应曲线上的每个数据点均来自至少5个不同卵母细胞的重复实验(n ≥ 5), 且以平均值±标准误(mean ± SEM) 的方式表示。

结果

收起

1　 α6/α3 nAChR亚基基因的定点诱变

以包含α6/α3亚基cDNA的质粒为模板, 根据氨基酸差异位点设计引物并利用PCR介导的定点诱变技术构建单点突变型基因。结果表明, PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测中均呈现明显条带(图2A)。将PCR产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞扩增后提取质粒, 利用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计对质粒进行鉴定, 结果如图2和表2所示, α6/α3亚基单点突变体质粒浓度介于0.20~0.31 μg·μL^-1, A₂₆₀/A₂₈₀值介于1.85~1.88, 且电泳条带清晰。DNA测序结果表明突变位点正确且无异常突变, 可用于后续酶切和体外转录实验。

2　野生型和突变型cRNA的制备

使用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计对限制性内切酶酶切获得的线性化质粒进行鉴定。实验结果如图2B、C和表2所示, 线性化质粒浓度均在0.21~0.35 μg·μL^-1之间, A₂₆₀/A₂₈₀值介于1.85~1.88之间, 符合体外转录实验要求。

以线性化质粒为模板, 体外转录获得野生型或突变型nAChR亚基的cRNA, 并利用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计对质粒进行鉴定。结果如表2、图2D、E所示, 编码野生型α6/α3、β2、β3和单点突变型α6/α3亚基cRNA的浓度介于0.56~1.11 μg·μL^-1之间, A₂₆₀/A₂₈₀值介于1.92~2.05之间, 且电泳主条带清晰, 可用于后续显微注射和电生理药物筛选模型的建立。

3　野生型和突变型α6/α3β2β3 nAChR电生理药物筛选模型的建立和功能分析

将编码α6/α3、β2、β3亚基的cRNA按比例混合后注射到卵母细胞中诱导表达4~6天, 使用双电极电压钳检测受体在细胞膜上的表达情况。结果表明, 野生型及7种单点突变型α6/α3β2β3 nAChR在100 μmol·L^-1 ACh刺激下均能正常开放并产生明显的内向电流, 表明电生理药物筛选模型成功建立(图3)。

使用不同浓度ACh刺激野生型α6/α3β2β3 nAChR及其单点突变体, 记录通道开放产生的内向电流值。结果表明, 野生型和突变型受体的通道开放程度随ACh浓度升高而不断增大(图4A~H)。将ACh浓度与电流反应率数据导入GraphPad Prism 8.0软件进行统计与分析, 获得ACh激活各受体开放的浓度-反应曲线和EC₅₀ (图4I、J, 表3)。结果表明, ACh激活野生型α6/α3β2β3 nAChR的EC₅₀为18.5 μmol·L^-1, 而ACh对7种单点突变型受体的作用活性存在一定程度的上升, EC₅₀降低至2.0~9.5 μmol·L^-1, 分别为野生型受体的0.1~0.5倍, 浓度-反应曲线发生明显左移, 说明这7个位点上氨基酸的置换对α6/α3β2β3 nAChR上ACh结合区域的结构均产生一定影响, 导致ACh结合受体的活性发生较明显的变化(图4, 表3)。

讨论

收起

α6/α3β2β3 nAChR在中脑边缘多巴胺能神经元通路中特异性表达, 通过调控多巴胺能神经递质释放介导奖赏刺激行为反应, 因而成为尼古丁成瘾机制研究和帕金森病治疗的重要靶点^{[10, 34]}。然而, 目前稳定的α6/α3β2β3 nAChRs的药物筛选模型较少, 异源表达检测体系的建立依然面临较大挑战和困难, 仍存在异源表达效率低下、检测难度大等问题, 且缺乏可用的配体特异性作用机制研究方法, 严重阻碍了配体-受体选择性结合的分子机制、α6/α3β2β3 nAChR相关的生理病理功能及靶向药物改造与开发应用等方面的深入研究。

非洲爪蟾卵母细胞是一种较为理想的膜蛋白体外表达分析系统, 其直径约为1.0~1.2 mm, 遗传背景清晰, 易于获取和进行RNA注射、目的基因诱导表达及多种膜蛋白功能活性检测相关实验操作(如电生理检测等)。该细胞中含有丰富的rRNA、tRNA及多种内源性信号转导因子, 能够保证外源mRNA的高效表达。与哺乳动物表达系统(如HEK239细胞) 相比, 非洲爪蟾卵母细胞不仅坚韧耐用, 还可通过精确控制外源mRNA的显微注射量和组合方式, 在较宽范围内实现蛋白表达水平的可控变化。此外, 非洲爪蟾卵母细胞的膜上离子通道表达水平较哺乳动物细胞也有大幅提升, 通常在诱导表达3~5天后即可获得μA级电流^{[18, 19, 35]}。综上, 非洲爪蟾卵母细胞已作为常用的高效体外表达系统应用于野生型和突变型nAChRs电生理药物筛选模型的建立、特异性靶向药物的筛选及配体-受体相互作用机制研究。

Kuryatov等^[36]的研究表明, 野生型α6与β4亚基能够在非洲爪蟾卵母细胞表达体系中组合形成功能性离子通道型受体, 但与β2和β3共表达时易形成胞内非功能性亚基聚集体, 而非在细胞膜上形成功能性受体, 因此难以用电生理方式检测通道开放产生的内向电流情况。为了在非洲爪蟾卵母细胞中建立功能性α6β2 nAChRs电生理活性筛选模型并进一步探究受体功能, 他们构建了α6/α3和α6/α4嵌合体亚基的编码基因, 以编码α6亚基胞外N-端结构域(参与胞外配体结合区的形成) 的cDNA序列分别替换α3和α4亚基的对应区域编码序列。检测结果表明, α6/α3和α6/α4嵌合体亚基参与nAChR五聚体组装并形成功能性受体的水平显著提升, 同时与配体选择性结合的能力基本与野生型α6^*受体相一致^[37]。此外, 多个团队研究发现, β3亚基参与哺乳动物细胞中α6/α3β2β3 nAChR的形成, 作为辅助亚基对受体的正确组装具有重要影响。在非洲爪蟾卵母细胞中建立体外药物筛选模型的过程中, 常将β3亚基与α6/α3和β2亚基共表达以期提高α6/α3β2β3 nAChR的表达水平^[36-38]。本研究利用关键位点定向诱变方式, 深入探究影响受体功能活性的关键位点, 以期提高α6β2β3受体表达效率, 为后续靶向该受体亚型的专一性配体筛选和改造提供模型。

利用定向诱变方法对亚基上的关键氨基酸位点的功能进行探究, 目前已成为该领域常用的研究方法之一。Boorman及Capelli等^{[39, 40]}通过在β3亚基跨膜区的9'位点引入单点突变, 将疏水的缬氨酸置换为亲水的丝氨酸(V273S), 提高了α6/α3β2β3在HEK293细胞系中的表达水平, 成功建立了稳定表达α6/α3β2β3[V273S] nAChR的哺乳动物细胞系。Hone等^[41]通过定点诱变研究表明, β4亚基119位氨基酸突变导致α6/α3β4 nAChRs对PeIA的敏感性发生不同程度的变化。以上研究结果表明, nAChRs亚基的某个或某些氨基酸对于配体的选择性结合至关重要, 对其进行有目的的定向突变可使其疏水性、带电性、空间位阻发生改变, 进而影响胞外配体结合区的空间结构, 导致配体结合特性发生变化。

本研究通过对比α6/α3和α3亚基间胞外N-端氨基酸序列, 确定关键位点差异及其对离子通道和受体功能的影响。利用PCR介导的定点诱变技术对α6/α3亚基上指定位点进行定向置换, 构建了7个单点突变型α6/α3亚基编码基因, 并通过体外转录、显微注射等技术进一步在非洲爪蟾卵母细胞中建立了野生型α6/α3β2β3及其单点突变体的药物筛选模型。电生理结果表明, α6/α3亚基上的7个氨基酸突变均在一定程度上降低了ACh作用于α6/α3β2β3 nAChR的EC₅₀, 其中第112、147、152位突变对ACh结合敏感性的影响最为显著, 相较于本体提高约4~10倍, 表明这些位点可能在ACh结合口袋的空间结构形成中发挥重要作用; I34M和T116I突变导致α6/α3β2β3 nAChR在被ACh激活开放时产生的电流幅度显著增加, 表明突变对受体的结构与功能产生了一定程度影响, 使其对离子通透的能力有所提升。此外, 受体关键位点的定向置换也可能对除ACh之外的激动剂活性产生明显影响。Chen等^[33]使用ACh、金雀花碱、尼古丁3种激动剂对α3β4 nAChRs及其三点突变体α3[K152E, E184D, Q195T]β4进行功能评估研究, 结果表明, [K152E, E184D, Q195T] 三点联合突变明显降低了受体对金雀花碱的敏感性, 同时使ACh和尼古丁的结合能力有所提高, 说明同一突变对激动剂结合活性的影响可能存在差别。针对本研究建立的突变型α6/α3β2β3 nAChRs电生理筛选模型, 多种激动剂可能表现出不同的药理学活性变化, 如敏感性上升或下降等, 相关结果需后续实验加以验证。

本研究在非洲爪蟾卵母细胞中成功建立了野生型α6/α3β2β3 nAChR及其7种单点突变体的电生理药物筛选模型, 并进一步评估了激动剂ACh作用于野生型和突变型受体的EC₅₀变化, 初步揭示了α6/α3亚基关键氨基酸位点对α6/α3β2β3 nAChR功能的影响和调控作用, 建立了功能增强且可用于药物筛选的模型。后续可结合分子动力学模拟、冷冻电镜和晶体结构解析等技术对配体选择性作用于α6/α3β2β3 nAChR的分子机制进行更深入的探索。相关结果为靶向α6/α3β2β3 nAChRs的药物筛选和作用机制分析提供了模型, 也为相关药物的专一性改造优化和开发应用提供了理论基础。

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

Gotti C, Clementi F. Neuronal nicotinic receptors: from structure to pathology [J]. Prog Neurobiol, 2004, 74: 363-396.

Giastas P, Zouridakis M, Tzartos SJ, et al. Understanding structure-function relationships of the human neuronal acetylcholine receptor: insights from the first crystal structures of neuronal subunits [J]. Br J Pharmacol, 2018, 175: 1880-1891.

Wang J, Lindstrom J. Orthosteric and allosteric potentiation of heteromeric neuronal nicotinic acetylcholine receptors [J]. Br J Pharmacol, 2018, 175: 1805-1821.

Zoli M, Pistillo F, Gotti C, et al. Diversity of native nicotinic receptor subtypes in mammalian brain [J]. Neuropharmacology, 2015, 96: 302-311.

Antolin-Fontes B, Ables JL, Görlich A, et al. The habenulo-interpeduncular pathway in nicotine aversion and withdrawal [J]. Neuropharmacology, 2015, 96: 213-222.

Fucile S, Matter JM, Erkman L, et al. The neuronal alpha6 subunit forms functional heteromeric acetylcholine receptors in human transfected cells [J]. Eur J Neurosci, 1998, 10: 172-178.

Champtiaux N, Han ZY, Bessis A, et al. Distribution and pharmacology of alpha6-containing nicotinic acetylcholine receptors analyzed with mutant mice [J]. J Neurosci, 2002, 22: 1208-1217.

Azam L, Winzer-Serhan UH, Chen Y, et al. Expression of neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit mRNAs within midbrain dopamine neurons [J]. J Comp Neurol, 2002, 444: 260-274.

Pons S, Fattore L, Cossu G, et al. Crucial role of alpha4 and alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunits from ventral tegmental area in systemic nicotine self-administration [J]. J Neurosci, 2008, 28: 12318-12327.

Quik M, Perez XA, Grady SR, et al. Role of α6 nicotinic receptors in CNS dopaminergic function: relevance to addiction and neurological disorders [J]. Biochem Pharmacol, 2011, 82: 873-882.

Champtiaux N, Gotti C, Cordero-Erausquin M, et al. Subunit composition of functional nicotinic receptors in dopaminergic neurons investigated with knock-out mice [J]. J Neurosci, 2003, 23: 7820-7829.

Han ZY, Novère NL, Zoli M, et al. Localization of nAChR subunit mRNAs in the brain of Macaca mulatta [J]. Eur J Neurosci, 2000, 12: 3664-3674.

Quik M, Polonskaya Y, Gillespie A, et al. Localization of nicotinic receptor subunit mRNAs in monkey brain by in situ hybridization [J]. J Comp Neurol, 2000, 425: 58-69.

Wang J, Kuryatov A, Lindstrom J. Expression of cloned α6^* nicotinic acetylcholine receptors [J]. Neuropharmacology, 2015, 96: 194-204.

Biasi MD, Dani JA. Reward, addiction, withdrawal to nicotine [J]. Annu Rev Neurosci, 2011, 34: 105-130.

Letchworth SR, Whiteaker P. Progress and challenges in the study of α6-containing nicotinic acetylcholine receptors [J]. Biochem Pharmacol, 2011, 82: 862-872.

Novère NL, Zoli M, Changeux JP, et al. Neuronal nicotinic receptor alpha6 subunit mRNA is selectively concentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain [J]. Eur J Neurosci, 1996, 8: 2428-2439.

Cartier GE, Yoshikami D, Gray WR, et al. A new alpha-conotoxin which targets alpha3beta2 nicotinic acetylcholine receptors [J]. J Biol Chem, 1996, 271: 7522-7528.

McIntosh JM, Azam L, Staheli S, et al. Analogs of alpha-conotoxin MII are selective for alpha6-containing nicotinic acetylcholine receptors [J]. Mol Pharmacol, 2004, 65: 944-952.

Cuny H, Yu R, Tae HS, et al. α-Conotoxins active at α3-containing nicotinic acetylcholine receptors and their molecular determinants for selective inhibition [J]. Br J Pharmacol, 2018, 175: 1855-1868.

Drenan RM, Grady SR, Whiteaker P, et al. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity alpha 6 nicotinic acetylcholine receptors [J]. Neuron, 2008, 60: 123-136.

Turner M, Eidemiller S, Martin B, et al. Structural basis for alpha-conotoxin potency and selectivity [J]. Bioorg Med Chem, 2009, 17: 5894-5899.

Harvey SC, Mcintosh JM, Cartier GE, et al. Determinants of specificity for alpha-conotoxin MII on alpha3beta2 neuronal nicotinic receptors [J]. Mol Pharmacol, 1997, 51: 336-342.

Luo S, Zhangsun DT, Wu Y, et al. Characterization of a novel α-conotoxin from conus textile that selectively targets α6/α3β2β3 nicotinic acetylcholine receptors [J]. J Biol Chem, 2013, 288: 894-902.

Luo S, Zhangsun DT, Schroeder CI, et al. A novel α4/7-conotoxin LvIA from Conus lividus that selectively blocks α3β2 vs α6/α3β2β3 nicotinic acetylcholine receptors [J]. FASEB J, 2014, 28: 1842-1853.

Chrestia JF, Turani O, Araujo NR, et al. Regulation of nicotinic acetylcholine receptors by post-translational modifications [J]. Pharmacol Res, 2023, 190: 106712.

Dash B, Bhakta M, Chang Y, et al. Identification of N-terminal extracellular domain determinants in nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) α6 subunits that influence effects of wild-type or mutant β3 subunits on function of α6β2^*- or α6β4^*-nAChR [J]. J Biol Chem, 2011, 286: 37976-37989.

Gerzanich V, Kuryatov A, Anand R, et al. "Orphan" alpha6 nicotinic AChR subunit can form a functional heteromeric acetylcholine receptor [J]. Mol Pharmacol, 1997, 51: 320-327.

Wang ZH, Yu JP, Zhangsun DT, et al. Cloning and functional characterization of α7 nicotinic acetylcholine recepor molecular chaperone Tmem35a [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2024, 59: 1993-2001.

Xie T, Qin Y, Zhao J, et al. Molecular determinants of species specificity of α-conotoxin TxIB towards rat and human α6/α3β4 nicotinic acetylcholine receptors [J]. Int J Mol Sci, 2023, 24: 8618.

Dong J, Zhang P, Xie J, et al. Loop2 size modification reveals significant impacts on the potency of α-conotoxin TxID [J]. Mar Drugs, 2023, 21: 286.

Almouzni G, Wolffe AP. Nuclear assembly, structure, and function: the use of Xenopus in vitro systems [J]. Exp Cell Res, 1993, 205: 1-15.

Chen SM, Yu JP, Zhang XF, et al. Construction and functional evaluation of an α3[K152E, E184D, Q195T]β4 nicotinic acetylcholine receptor mutant [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2022, 57: 1054-1062.

Yang K, Hu J, Lucero L, et al. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons [J]. J Physiol, 2009, 587: 345-361.

Dascal N. Voltage clamp recordings from Xenopus oocytes [J]. Curr Protoc Neurosci, 2001, Chapter 6: Unit 6.12.

Kuryatov A, Olale F, Cooper J, et al. Human alpha6 AChR subtypes: subunit composition, assembly, and pharmacological responses [J]. Neuropharmacology, 2000, 39: 2570-2590.

Tumkosit P, Kuryatov A, Luo J, et al. Beta3 subunits promote expression and nicotine-induced up-regulation of human nicotinic alpha6^* nicotinic acetylcholine receptors expressed in transfected cell lines [J]. Mol Pharmacol, 2006, 70: 1358-1368.

Dash B, Lukas RJ. Modulation of gain-of-function α6^*-nicotinic acetylcholine receptor by β3 subunits [J]. J Biol Chem, 2012, 287: 14259-14269.

Boorman JP, Groot-Kormelink PJ, Sivilotti LG, et al. Stoichiometry of human recombinant neuronal nicotinic receptors containing the b3 subunit expressed in Xenopus oocytes [J]. J Physiol, 2000, 529 Pt 3: 565-577.

Capelli AM, Castelletti L, Chen YH, et al. Stable expression and functional characterization of a human nicotinic acetylcholine receptor with α6β2 properties: discovery of selective antagonists [J]. Br J Pharmacol, 2011, 163: 313-329.

Hone AJ, Talley TT, Bobango J, et al. Molecular determinants of α-conotoxin potency for inhibition of human and rat α6β4 nicotinic acetylcholine receptors [J]. J Biol Chem, 2018, 293: 17838-17852.

2026年第61卷第1期

PDF下载

154

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2025-0693

接收时间：2025-06-18
首发时间：2026-09-21
出版时间：2026-01-12

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2025-06-18
修回日期：2025-08-30

基金

作者信息

广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004

通讯作者:

罗素兰, Tel: 86-771-3949335, E-mail: sulan2021@gxu.edu.cn

长孙东亭, E-mail: zhangsundt@163.com

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2025-0693

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT

Mutant	Sequence of primer (5'→3')
α6/α3[I34M]	FM: GCACTTTGAGTTGGCCATGACGCAGCTGGC
	RM: GCCAGCTGCGTCATGGCCAACTCAAAGTGC
α6/α3[C63K]	FM: GGAAGGACTACAGATTGAAATGGGATCCAACGGAGTACGATGGC
	RM: GCCATCGTACTCCGTTGGATCCCATTTCAATCTGTAGTCCTTCC
α6/α3[V112E]	FM: GTACGATGGGGAAATAACCTGGACCCCGCCAGC
	RM: GCTGGCGGGGTCCAGGTTATTTCCCCATCGTAC
α6/α3[T116I]	FM: GGGGTGATAACCTGGATCCCGCCAGCC
	RM: GGCTGGCGGGATCCAGGTTATCACCCC
α6/α3[S140T]	FM: CCCATTTGATCATCAAAACTGCACCCTGAAATTTGGG
	RM: CCCAAATTTCAGGGTGCAGTTTTGATGATCAAATGGG
α6/α3[T147S]	FM: CCTGAAATTTGGGTCCTGGTCCTACGACAAGGCTG
	RM: CAGCCTTGTCGTAGGACCAGGACCCAAATTTCAGG
α6/α3[E152K]	FM: GGACTTACGACAAGGCTAAGATCGACCTTCTCATCATTGG
	RM: CCAATGATGAGAAGGTCGATCTTAGCCTTGTCGTAAGTCC

Mutant

Sequence of primer (5'→3')

α6/α3[I34M]

FM: GCACTTTGAGTTGGCCATGACGCAGCTGGC

RM: GCCAGCTGCGTCATGGCCAACTCAAAGTGC

α6/α3[C63K]

FM: GGAAGGACTACAGATTGAAATGGGATCCAACGGAGTACGATGGC

RM: GCCATCGTACTCCGTTGGATCCCATTTCAATCTGTAGTCCTTCC

α6/α3[V112E]

FM: GTACGATGGGGAAATAACCTGGACCCCGCCAGC

RM: GCTGGCGGGGTCCAGGTTATTTCCCCATCGTAC

α6/α3[T116I]

FM: GGGGTGATAACCTGGATCCCGCCAGCC

RM: GGCTGGCGGGATCCAGGTTATCACCCC

α6/α3[S140T]

FM: CCCATTTGATCATCAAAACTGCACCCTGAAATTTGGG

RM: CCCAAATTTCAGGGTGCAGTTTTGATGATCAAATGGG

α6/α3[T147S]

FM: CCTGAAATTTGGGTCCTGGTCCTACGACAAGGCTG

RM: CAGCCTTGTCGTAGGACCAGGACCCAAATTTCAGG

α6/α3[E152K]

FM: GGACTTACGACAAGGCTAAGATCGACCTTCTCATCATTGG

RM: CCAATGATGAGAAGGTCGATCTTAGCCTTGTCGTAAGTCC

nAChR subtype	Concentration of plasmid/μg·μL^-1	A₂₆₀/A₂₈₀	Concentration of linearized plasmid/μg·μL^-1	A₂₆₀/A₂₈₀	Concentration of cRNA/ μg·μL^-1	A₂₆₀/A₂₈₀
α6/α3	0.24	1.88	0.23	1.85	0.56	1.98
β2	0.26	1.85	0.29	1.87	1.11	2.01
β3	0.31	1.87	0.35	1.84	0.75	1.97
α6/α3[I34M]	0.28	1.86	0.28	1.85	0.62	1.99
α6/α3[C63K]	0.24	1.89	0.27	1.87	0.66	1.92
α6/α3[V112E]	0.26	1.86	0.21	1.88	0.97	1.99
α6/α3[T116I]	0.22	1.87	0.29	1.89	0.84	2.03
α6/α3[S140T]	0.25	1.86	0.26	1.86	0.78	1.98
α6/α3[T147S]	0.21	1.88	0.25	1.85	0.59	2.01
α6/α3[E152K]	0.20	1.85	0.24	1.88	0.79	2.05

nAChR subtype

Concentration of plasmid/μg·μL^-1

A₂₆₀/A₂₈₀

Concentration of linearized plasmid/μg·μL^-1

A₂₆₀/A₂₈₀

Concentration of cRNA/
μg·μL^-1

A₂₆₀/A₂₈₀

α6/α3

0.24

1.88

0.23

1.85

0.56

1.98

β2

0.26

1.85

0.29

1.87

1.11

2.01

β3

0.31

1.87

0.35

1.84

0.75

1.97

α6/α3[I34M]

0.28

1.86

0.28

1.85

0.62

1.99

α6/α3[C63K]

0.24

1.89

0.27

1.87

0.66

1.92

α6/α3[V112E]

0.26

1.86

0.21

1.88

0.97

1.99

α6/α3[T116I]

0.22

1.87

0.29

1.89

0.84

2.03

α6/α3[S140T]

0.25

1.86

0.26

1.86

0.78

1.98

α6/α3[T147S]

0.21

1.88

0.25

1.85

0.59

2.01

α6/α3[E152K]

0.20

1.85

0.24

1.88

0.79

2.05

nAChR	EC₅₀/μmol·L^{-1 a}	Hill slope^a	Ratio (mutant WT α6/α3β2β3)
α6/α3β2β3	18.5 (13.3-25.8)	1.1 (0.8-1.5)	1.0
α6/α3[I34M]β2β3	6.0 (4.8-7.6)	0.9 (0.8-1.1)	0.3
α6/α3[C63K]β2β3	4.7 (3.6-6.1)	0.8 (0.7-1.0)	0.3
α6/α3[V112E]β2β3	3.5 (2.5-4.7)	0.9 (0.7-1.1)	0.2
α6/α3[T116I]β2β3	9.2 (6.8-12.4)	1.4 (0.8-1.7)	0.5
α6/α3[S140T]β2β3	9.5 (6.6-13.6)	1.0 (0.7-1.2)	0.5
α6/α3[T147S]β2β3	4.4 (2.5-7.5)	1.0 (0.6-1.5)	0.2
α6/α3[E152K]β2β3	2.0 (1.3-3.1)	1.1 (0.7-1.6)	0.1

nAChR

EC₅₀/μmol·L^{-1 a}

Hill slope^a

Ratio (mutant WT α6/α3β2β3)

α6/α3β2β3

18.5 (13.3-25.8)

1.1 (0.8-1.5)

1.0

α6/α3[I34M]β2β3

6.0 (4.8-7.6)

0.9 (0.8-1.1)

0.3

α6/α3[C63K]β2β3

4.7 (3.6-6.1)

0.8 (0.7-1.0)

0.3

α6/α3[V112E]β2β3

3.5 (2.5-4.7)

0.9 (0.7-1.1)

0.2

α6/α3[T116I]β2β3

9.2 (6.8-12.4)

1.4 (0.8-1.7)

0.5

α6/α3[S140T]β2β3

9.5 (6.6-13.6)

1.0 (0.7-1.2)

0.5

α6/α3[T147S]β2β3

4.4 (2.5-7.5)

1.0 (0.6-1.5)

0.2

α6/α3[E152K]β2β3

2.0 (1.3-3.1)

1.1 (0.7-1.6)

0.1