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电压门控钠离子通道Na_V1.8在非洲爪蟾卵母细胞中的表达及优化

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王楠 , 高昕宇 , 丁恺志 , 于津鹏 , 长孙东亭 , 朱晓鹏 ^* , 罗素兰 ^*

药学学报 | 研究论文 2025,60(8): 2535-2544

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药学学报 |研究论文 2025 , 60 (8) : 2535 -2544

电压门控钠离子通道Na_V1.8在非洲爪蟾卵母细胞中的表达及优化

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王楠, 高昕宇, 丁恺志, 于津鹏, 长孙东亭, 朱晓鹏^*, 罗素兰^*

作者信息

广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004

通讯作者:

朱晓鹏, Tel: 86-771-3949335, E-mail: biozxp@163.com

罗素兰, E-mail: sulan2021@gxu.edu.cn

作者简介:

作者贡献:

王楠完成实验过程、数据分析和论文初稿的写作; 高昕宇参与实验数据采集、结果分析和论文审阅; 丁恺志参与实验结果分析和论文审阅; 于津鹏负责电生理平台的搭建及指导; 长孙东亭、朱晓鹏和罗素兰构思了实验, 指导实验设计、数据分析和论文写作与修改。

Expression and optimization of voltage-gated sodium channels Na_V1.8 in Xenopus laevis oocytes

Nan WANG, Xin-yu GAO, Kai-zhi DING, Jin-peng YU, Dong-ting ZHANGSUN, Xiao-peng ZHU^*, Su-lan LUO^*

Affiliations

Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine, Medical School of Guangxi University, Nanning 530004, China

出版时间: 2025-08-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2025-0162

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摘要

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电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channels, VGSCs, Na_V) 使可兴奋细胞产生动作电位并传导。其中, Na_V1.8亚型主要表达在感觉神经元, 特别是背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) 的小直径神经元中, 参与慢性疼痛、神经病理性疼痛和炎性疼痛的信号传导。Na_V1.8的抗河豚毒素、慢激活和慢失活的电生理特性, 使其在神经元的重复放电中起关键作用, Na_V1.8成为镇痛药物开发的重要靶标之一。因此, 体外建立基于Na_V1.8为靶标的药物筛选模型, 对发现具备镇痛活性的先导药物有重要意义。目前, Na_V1.8的异源表达存在一定困难, 主要表现为在体外非神经元细胞系中表达水平过低, 不利于药物筛选。本研究拟利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统, 建立大鼠Na_V1.8的体外表达模型, 利用双电极电压钳(two electrode voltage clamp, TEVC) 技术, 表征通道活性, 为活性化合物筛选提供平台。利用实时荧光定量PCR确认了大鼠的Na_V1.8主要表达在DRG和三叉神经节中(广西大学伦理委员会审查批准号: GXU-2022-159), 同时克隆了Na_V1.8的全长基因, 并构建了2个Na_V1.8嵌合体(Na_V1.8-N和Na_V1.8-C)。体外转录获得对应基因的加帽RNA后, 转入非洲爪蟾卵母细胞进行异源表达, 利用TEVC对Na_V1.8及其嵌合体的表达进行了检测, 并利用I-V曲线、稳态激活曲线、Na_V1.8特异性拮抗剂A-803467和VX-548评估了该体外模型的通道活性。其中, 嵌合体Na_V1.8-C解决了Na_V1.8难以体外稳定表达的问题, 且与Na_V1.8具有类似的药理活性, 可为今后靶向电压门控钠离子通道Na_V1.8亚型的活性化合物筛选提供重要工具。

关键词

电压门控钠离子通道 / Na_V1.8 / 嵌合体构建 / 非洲爪蟾卵母细胞 / 电生理

Abstract

收起

Voltage-gated sodium channels (VGSCs, Na_V) are essential for the generation and conduction of action potentials in excitable cells. The Na_V1.8 subtype is predominantly expressed in sensory neurons, particularly in small-diameter neurons of the dorsal root ganglia (DRG), and plays a critical role in the signal transduction of chronic, neuropathic, and inflammatory pain. Due to its tetrodotoxin-resistant properties and electrophysiological characteristics of slow activation and inactivation, Na_V1.8 is a key target for analgesic drug development, facilitating repeated neuronal firing. Consequently, establishing an in vitro drug screening model based on Na_V1.8 is crucial for identifying lead compounds with analgesic potential. However, heterologous expression of Na_V1.8 remains challenging, primarily due to low expression levels in non-neuronal cell lines, which hinders effective drug screening. In this study, we established an in vitro expression model of rat Na_V1.8 using Xenopus laevis oocytes as the expression system. Channel property was characterized using the two electrode voltage clamp (TEVC) technique, providing a platform for screening active compounds. Quantitative polymerase chain reaction confirmed that rat Na_V1.8 is predominantly expressed in the DRG and trigeminal ganglia (Guangxi University Ethics Committee Review and approval number: GXU-2022-159). We cloned the full-length Na_V1.8 gene and constructed two chimeric variants, Na_V1.8-N and Na_V1.8-C. Following in vitro transcription of the corresponding capped RNA, it was injected into Xenopus laevis oocytes for heterologous expression. TEVC recordings were used to detect Na_V1.8 and chimera expression, and channel activity was evaluated through I-V curves, steady-state activation curves, and the specific Na_V1.8 antagonists A-803467 and VX-548. The chimera Na_V1.8-C resolved the problem in stable expression of Na_V1.8 in vitro and exhibited similar pharmacological properties with native Na_V1.8, offering a valuable tool for future screening of compounds targeting voltage-gated sodium channel.

Key words

voltage-gated sodium channel / Na_V1.8 / chimera construction / Xenopus laevis oocyte / electrophysiology

引用本文

王楠, 高昕宇, 丁恺志, 于津鹏, 长孙东亭, 朱晓鹏, 罗素兰. 电压门控钠离子通道Na_V1.8在非洲爪蟾卵母细胞中的表达及优化. 药学学报, 2025 , 60 (8) : 2535 -2544 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2025-0162

Nan WANG, Xin-yu GAO, Kai-zhi DING, Jin-peng YU, Dong-ting ZHANGSUN, Xiao-peng ZHU, Su-lan LUO. Expression and optimization of voltage-gated sodium channels Na_V1.8 in Xenopus laevis oocytes[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2025 , 60 (8) : 2535 -2544 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2025-0162

正文

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细胞膜上的电压门控离子通道在细胞信号传递中至关重要, 包括电压门控钾离子通道(K_V)、钙离子通道(Ca_V) 和钠离子通道等对膜电位的变化极为敏感的离子通道^[1]。当细胞膜电位发生改变时, 这些通道会相应地开放或关闭, 选择性地调控特定离子的流动^[2]。其中, 电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channels, VGSCs, Na_V) 在离子通道相关疾病的机制研究和药物开发中具有重要价值。其开放或关闭状态与癫痫、自闭症、心律失常和神经性疼痛等多种疾病的发生密切相关^[3]。

19世纪70年代, Neher和Sakmann^[4]首次通过膜片钳技术在青蛙肌肉组织中记录到了单个钠离子通道的电流。1984年, Noda等^[5]利用电鳗的放电特性, 从其cDNA文库中成功克隆出钠通道基因, 并推导出了VGSCs的一级结构。此后, 随着VGSCs的全部基因亚型被陆续发现、克隆^[6], 其生理特性和药理活性的研究得到了极大的推动。迄今为止, 在哺乳动物体内已发现了9种VGSCs^[7]。这些通道在形成功能性蛋白时, 由核心的α亚基和1、2个辅助的β亚基组成^[8]。α亚基折叠成Ⅰ至Ⅳ四个同源结构域(domain, DI~DIV), 每个结构域包含S1至S6六个跨膜螺旋。其中, S1至S4跨膜螺旋构成通道的电压敏感结构区域(voltage-sensor domain, VSD), 而S5和S6则构成离子孔道区(pore domain, PD)。诸如芋螺毒素等许多生物毒素可以结合PD, 抑制或激活通道功能^[3]。根据α亚基的不同, 基因SCN1A至SCN5A编码Na_V1.1至Na_V1.5, 而SCN8A至SCN11A编码Na_V1.6至Na_V1.9。Na_V1.1、Na_V1.2、Na_V1.3和Na_V1.6主要分布于中枢神经系统^[9], Na_V1.4和Na_V1.5分别在骨骼肌^[10]和心肌细胞^[11]中特异性表达, 而Na_V1.7、Na_V1.8和Na_V1.9在外周神经系统(peripheral nervous system, PNS) 中广泛分布^[12], 与神经性疼痛和炎性疼痛等疾病的发生密切相关^[13]。根据对河豚毒素的敏感性差异, VGSCs分为河豚毒素敏感型(tetrodotoxin-sensitive, TTX-S) 和河豚毒素不敏感型(tetrodotoxin-resistant, TTX-R)。SCN10A基因编码的Na_V1.8属于TTX-R的电压门控钠离子通道^[14], 主要表达在神经元末梢, 尤其是三叉神经节、背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) 等小直径的无髓鞘神经元中^[15]。研究表明, Na_V1.8的基因敲除鼠痛觉显著减轻, 反映了Na_V1.8在疼痛神经信号传导中的关键作用^{[16, 17]}。近年来, Na_V1.8的冷冻电镜(cryo-electron microscopy, cryo-EM) 解析揭示了通道的更多精细结构, 部分氨基酸是亚型特异性孔阻断剂结合的潜在位点^[18]。与其他亚型相比, Na_V1.8需要更大的去极化膜电位刺激才能被激活, 并且具有更缓慢的失活动力学^[19]。这种高频放电的过度兴奋状态是导致疼痛的重要机制之一^[20]。尽管近年来开发了一系列Na_V1.8阻断剂^[21], 如A-803467、PF-04531083、PF-06305591和VX-150等^[22], 但均未通过临床试验阶段。新发现的VX-548在拇囊炎切除术和腹壁成形术的疼痛治疗中表现出较好的镇痛效果^[23], 其口服片剂JOURNAVX^TM (suzetrigine/VX-548) 的上市批准也使其成为数年来首个非阿片类止痛药物。因此, 发现更多靶向Na_V1.8的先导化合物作为镇痛先导药物极具开发潜力。

建立Na_V1.8体外模型, 为靶向化合物的高效筛选提供了重要途径。但是, Na_V1.8的异源表达相对困难, 通常需要β亚基的辅助来提高电流密度^[24], 这在一定程度上限制了对其的研究。为了克服离子通道异源表达困难的问题, 研究者们采用了将特定离子通道的PD或VSD与其他通道相应跨膜区置换的方法, 构建嵌合体, 实现膜蛋白的成功组装。而构建的嵌合体在门控、电导等通道活性方面也保留了原始特性。如通过构建K_V1.2-K_V2.1, 嵌合体K_V能够将电流密度提高14倍^[25], 同样α6β2β3^* (^*表示可能存在其他亚基) 烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) 难以异源表达形成功能性五聚体, 通过构建α6/α3亚基嵌合体实现了其在非洲爪蟾卵母细胞或其他靶细胞的高效表达^[26]。在离子通道外源表达的研究中, 非洲爪蟾卵母细胞具备异源表达能力强、易于获取、内源离子通道背景低、电生理技术成熟、快速检测等优点, 常用于受体或离子通道体外表达的研究^[27]。

为解决Na_V1.8体外表达不稳定的问题, 本研究克隆了大鼠Na_V1.8全长基因, 同时构建了Na_V1.8-N和Na_V1.8-C两个Na_V1.8的嵌合体(Na_V1.8-N是N末端Na_V1.8的第1~130氨基酸用Na_V1.4的第1~131氨基酸所取代; Na_V1.8-C是C末端Na_V1.8的第1 730~1 956氨基酸用Na_V1.4的第1 598~1 840个氨基酸所取代)。利用非洲爪蟾卵母细胞, 对构建的通道及嵌合体模型进行表达, 并利用TEVC对通道的表达情况和通道药理特性进行检测。构建的嵌合体模型克服了Na_V1.8异源表达困难的问题, 为靶向Na_V1.8镇痛先导药物的研发提供了有效的平台。

材料与方法

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实验动物 大鼠(品系Sprague Dawley) 购自北京斯贝福生物技术有限公司, 许可证号为SCXK (京) 2019-0010。雌性非洲爪蟾(Xenopus laevis) 购自中国科学院昆明动物研究所。动物均在适宜的温度下饲养, 保持昼夜交替, 遵循动物福利相关规定。动物实验的实验过程经过广西大学伦理委员会的审查批准(批准号: GXU-2022-159)。

实验试剂 RNA保存液(#CR2111138) 购自武汉赛维尔生物技术有限公司; RNAiso Plus (#AO31222A)、Kpn Ⅰ (#AO20755A)、Not Ⅰ (#AL52307A)、Hind Ⅲ (#AGY0906A)、DL10 000 DNA marker (#AM62086A)、MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0片段纯化试剂盒(#AL61457A7) 购自北京宝日医生物技术有限公司; 2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (#7E821A4)、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) 反转录试剂盒(#027E2252JA)、2× Phanta Max Master Mix高保真酶(#7E214K4)、ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit同源重组试剂盒(#017E22721A) 购自南京诺唯赞生物技术有限公司; 胶原蛋白酶(#COLLA-RO) 购自美国Sigma-Aldrich公司; Mmessage mMACHINE^® T7体外转录试剂盒(#2880830)、MEGAclear^TM转录纯化试剂盒(#2776183) 购自美国Thermo Fisher Scientific公司; 氨苄青霉素(#A61002)、硫酸链霉素(#A610494)、硫酸庆大霉素(#A100304)、4S Gel Red核酸染料(#K6021CA4477) 购自上海生工生物工程股份有限公司; A-803467 (#60692) 购自上海MedChemexpress公司; VX-548 (#240030) 购自上海陶术生物科技有限公司。

实验仪器 梯度基因扩增仪Biometra TAdvanced 96 SG、实时荧光定量PCR仪qTOWER³ (德国Analytikjena公司); 恒温恒湿细胞培养箱KCL-2000W (日本EYELA公司); 水平电泳电泳槽PowerPac Basic (美国Bio-Rad公司); 凝胶成像系统FluorChem E (美国ProteinSimple公司); 超微量分光光度计Nanodrop One (美国Thermo Fisher Scientific公司); 落地高速离心机CF16RN (德国Eppendorf公司); 数模转换器Axon 1550B、信号放大器Axon 725D、TEVC系统Axon 725D (美国Molecular Devices公司); 显微注射仪NANOJECT Ⅱ (美国Drummond公司); 微电极拉制仪P1000 (美国Sutter公司)。

溶液配制 OR2溶液(82.5 mmol·L^-1 NaCl, 2 mmol·L^-1 KCl, 1.0 mmol·L^-1 MgCl₂, 5 mmol·L^-1 HEPES, pH 7.5), ND96溶液(96 mmol·L^-1 NaCl, 1.0 mmol·L^-1 MgCl₂, 1.8 mmol·L^-1 CaCl₂, 2 mmol·L^-1 KCl, 5 mmol·L^-1 HEPES, pH 7.5)。

总RNA的提取及cDNA的合成 选取6周龄大鼠, 处死后划开背肌, 分离脊柱, 取出L1~L5 DRG。同时, 取出大脑中的嗅球及颅底的三叉神经节。分离的组织均用预冷的1×PBS冲洗后立即浸泡于RNA保存液中。由于DRG体积较小, 将单侧的5个DRG合并后提取RNA。将上述组织各30 mg在RNAiso Plus中匀浆裂解, 加入氯仿抽提。12 000 ×g离心15 min, 吸取水相, 加入1倍体积的异丙醇, 沉淀RNA。75%乙醇洗涤3次后风干, 用DEPC水溶解RNA沉淀, 分别利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳, 检测RNA的浓度和质量, 最终得到嗅球、DRG和三叉神经节的总RNA。

按照诺唯赞反转录试剂盒说明书, 以提取的总RNA为底物, 加入1 μL Oligo (dT)₂₃ VN, 补充DEPC水至12 μL, 65 ℃孵育5 min后迅速冷却, 打开RNA的二级结构。加入4× gDNA wiper 4 μL孵育2 min, 再加入2 μL HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase, 55 ℃反应45 min, 85 ℃反应2 min, 获得cDNA。cDNA (1 μg) 可用于实时荧光定量PCR的模板。

Na_V1.8基因的组织分布鉴定 利用实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR) 确定Na_V1.8基因在嗅球、DRG和三叉神经节中的表达量。以3种组织反转录得到的cDNA为模板, 选取β-actin作为内参基因。在20 μL的反应体系中: 2 μL正向和反向引物(浓度为5 μmol·L^-1)、4 μL灭菌去离子水、2 μL cDNA、10 μL 2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix。其中, Na_V1.8 (NM_017247.2) 的引物序列分别为: 正向引物(5'-GTGGTCACCATGGCGTATGAAG-3'), 反向引物(5'-CTGGAGCGAGGTCGTGTCAA-3'), 内参基因β-actin (NM_031144.3) 的引物序列为: 正向引物(5'-CTGAAGTACCCCATTGAACA-3'), 反向引物(5'-TCTCAAACATGATCTGGGTC-3')。qPCR反应条件: 95 ℃, 预变性处理5 min, 然后95 ℃变性10 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 设置45个循环。最后, 在60 ℃条件下进行5 min的延伸。利用jena qTOWER³ G和qPCRsoft 4.1进行PCR反应的信号采集和数据记录。qPCR的数据分析使用GraphPad Prism 9.0软件。实验采用技术性重复及生物学重复, 以确保数据的准确性和可靠性。以内参基因β-actin的C_t值为归一化标准, 采用2^-ΔΔCt方法计算各组织中目标基因的相对表达量, 采用单因素方差分析评估不同组织中Na_V1.8的表达水平差异性。

Na_V1.8及其嵌合体重组质粒的构建 根据qPCR的结果, 从DRG中提取总RNA, 克隆Na_V1.8的全长基因。以DRG反转录得到的cDNA为模板, 配置50 μL的PCR反应体系。分别加入4 μL正向引物(5'- CGACCTTATAGAGCAGCAAAGAGTG-3') 和反向引物(5'-GCAAACCCTAATTCTCAGTGCC-3') (浓度为2 μmol·L^-1)、9 μL灭菌去离子水、8 μL cDNA、25 μL 2× Phanta Max Master Mix。PCR反应条件: 95 ℃预变性5 min, 95 ℃变性15 s、52 ℃退火15 s、72 ℃延伸5 min, 35个循环, 最终扩增出Na_V1.8的基因目的片段。利用PCR产物纯化试剂盒进行回收。构建重组质粒的流程图如图1所示。

使用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ对pBlue-SK(+) 载体进行双酶切, 获得线性化的载体。目的基因与线性化载体摩尔比为2∶1的比例, 在37 ℃下连接30 min, 随后迅速降温至4 ℃, 完成同源重组。将同源重组产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞, 转入重组体的菌株挑取单克隆分别进行PCR验证和测序验证。

如图1所示, 构建Na_V1.8-N和Na_V1.8-C嵌合体质粒。在翻译区, 使用PCR法, 使用正向引物(5'-GATGGCCAGCTCATCTCTGC-3'), 反向引物(5'-CGCGTGAATGAGCACCTTG-3') 扩增Na_V1.4的起始密码子至第一结构域前的氨基端基因(N端, 第1~131个氨基酸)。替换Na_V1.8对应的氨基端(第1~130个氨基酸), 获得嵌合体Na_V1.8-N。使用正向引物(5'-ACCGAAGAGAGCAGCGAG-3'), 反向引物(5'-CTAGACAAGAGACTCTTTGACCCCT-3') 扩增Na_V1.4第四结构域至终止密码子的羧基端基因(C端, 第1 598~1 840个氨基酸), 替换Na_V1.8对应的羧基端(第1 730~1 956个氨基酸), 获得嵌合体Na_V1.8-C。重组质粒的构建使用同源重组法, 采用菌落PCR和测序验证Na_V1.8-N和Na_V1.8-C的成功构建。同时, 利用pcDNA3.1(+) 载体构建了Na_Vβ1亚基的重组质粒(Na_Vβ1), 用于辅助野生型Na_V1.8的表达。

所有引物合成、重组质粒的KBSeq全质粒测序均在上海生工生物工程股份有限公司进行, 测序获得的蛋白质序列比对使用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 12 (MEGA 12), 可视化分析使用ESPript3.0在线网站(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)。

cRNA的合成 使用限制性内切酶对重组质粒进行单酶切, 其中Na_V1.4、Na_V1.8、Na_V1.8-N和Na_V1.8-C使用Not Ⅰ, Na_Vβ1使用Hind Ⅲ。利用超微量分光光度计测定纯化产物的浓度。以单酶切线性化质粒为模板, 利用T7体外转录试剂盒, 进行体外转录, 获得对应加帽RNA (capped RNA, cRNA)^[28]。20 μL反应体系中包含1.5 μg线性化模板、2 μL reaction buffer、10 μL 2× NTP/CAP、1 μL GTP、2 μL T7 enzyme mix, DEPC水将体系补充至20 μL。在37 ℃下反应14 h, 加入1 μL TURBO^TM DNase消化未反应完全的线性化模板, 获得cRNA。利用MEGAclear^TM转录纯化试剂盒对cRNA进行纯化。所有纯化产物利用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计鉴定质量和浓度。

非洲爪蟾卵母细胞的获取及显微注射 冰浴麻醉性成熟的Xenopus laevis, 划开外皮及内部肌肉层, 暴露并轻柔取出卵叶, 缝合伤口。在含有1.6 g·L^-1胶原酶的OR2溶液中酶解卵叶碎块20~40 min, 消化滤泡层, 获得单独的卵母细胞。使用OR2溶液彻底漂洗去除残余的胶原蛋白酶, 最终将卵母细胞置于含有10 μg·mL^-1青霉素、10 μg·mL^-1链霉素、100 μg·mL^-1庆大霉素的ND96溶液中, 在17 ℃下培养过夜后进行显微注射。

分别将等比例混合(1∶1) 的Na_Vβ1和Na_V1.8的cRNA、单独的Na_V1.4、Na_V1.8-N和Na_V1.8-C的cRNA (约30 ng) 注射到卵母细胞中, 在17 ℃、35%湿度的培养箱中培养2~5天, 以供电生理检测。

蛙卵-双电极电压钳检测 使用培养2~5天的非洲爪蟾卵母细胞进行检测。在进行TEVC检测时, 须将电极电阻控制在2 MΩ以内。电极针中充盈3 mol·L^-1 KCl溶液。将培养好的卵母细胞置于细胞槽中, 电极针刺破卵母细胞后, 使用已脱气的含有0.1 mg·mL^-1胎牛血清的ND96灌流液灌流^[29]。将卵母细胞钳制在-80 mV, 电压跃增到+20 mV并持续50 ms。在进行稳态激活测试时, 卵母细胞被钳制在-80 mV, 电压阶梯式地跃增+10 mV并持续50 ms, 进行13个循环, 记录电流对于电压的依赖性。

TEVC的信号记录使用Axon 1550B数模转换器和Axon 725D信号放大器, 使用pCLAMP软件和Clampfit 11.0.3进行数据的采集及数据处理和分析, 并使用P/4漏减程序消除产生的漏电流。分别对表达了2~5天Na_V1.8 (注射等比例的Na_Vβ1)、Na_V1.8-N、Na_V1.8-C和Na_V1.4的卵母细胞中产生的电流密度进行检测。配制10 μmol·L^-1浓度的Na_V1.8的特异性阻断剂A-803467 (DMSO溶解), 在细胞槽中孵育5 min, 测试对Na_V1.8-C和Na_V1.4电流的反应率。配制Na_V1.8的特异性阻断剂A-803467 (浓度范围10^-7~10^-4 mol·L^-1的溶液) 和VX-548 (DMSO溶解, 浓度范围10^-9~10^-5 mol·L^-1), 在细胞槽中使用梯度浓度孵育5 min, 计算不同浓度下A-803467和VX-548对Na_V1.8-C和Na_V1.4的反应率并拟合半数抑制浓度(half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀)。

统计学分析 使用GraphPad Prism 9.0软件进行显著性差异分析, 使用ORIGIN 2021对数据进行拟合和统计分析。采用Boltzmann方程(1) 拟合VGSCs的稳态激活曲线。

$ G / G_{\max }=1 /\left[1+\exp \left(V-V_{1 / 2}\right) / \mathrm{k}\right] $

(1)

其中, G是全细胞通道电导, 以公式G = I/(V-Vr) 计算; V是测试电位; Vr是反转电位(reverse potential); I是不同测试电位诱发的电流; G_max是测试的最大电导; V_1/2是半最大激活电位(half activation voltage, V_1/2); k是斜率因子。

Response%代表反应率, 计算IC₅₀的非线性拟合方程(2) 为:

$ \text { Response } \%=100 /\left\{1+\left([\text { inhibitor }] / \text { IC }_{50}\right)^{\text {HillSlope }}\right\} $

(2)

其中HillSlope是Hill系数, inhibitor是药物浓度, 95%置信区间的值用括号表示, 数据分析基于VGSCs的激活电流获得。全部数据使用平均值±标准误(x ± SEM) 表示。^*P < 0.05说明具有显著性差异。

结果

收起

1　Na_V1.8基因在不同组织中的分布

qPCR鉴定大鼠Na_V1.8在嗅球、DRG和三叉神经节中的基因表达水平。如图2A所示, 提取大鼠的嗅球、DRG、三叉神经节组织中的总RNA, 经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 浓度分别为962.25、352.64和423.51 ng·μL^-1, RNA条带清晰, 结构完整。qPCR检测Na_V1.8时, 以β-actin为内参基因, 结果表明, Na_V1.8在嗅球组织中表达量较低, 在DRG和三叉神经节中具有很高的基因表达水平, 且在DRG的表达量最高, 3个组织间的表达量均存在显著性差异(图2B)。这一结果为克隆Na_V1.8基因全长时的组织选择提供了基础。

2　Na_V1.8及其嵌合体重组质粒的构建及测序

按照图1所示策略, 构建Na_V1.8及嵌合体Na_V1.8-C和Na_V1.8-N的重组质粒。选择表达量最高的DRG组织, 提取RNA用于cDNA的合成, 扩增出包含非翻译区5'-UTR和3'-UTR的全长基因, 保证翻译的顺利进行。提取的RNA经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 具有清晰完整的28S、18S和5.8S三条条带, 且28S rRNA条带的亮度是18S rRNA条带的两倍以上, 超微量分光光度计测量RNA浓度为352.64 μg·L^-1, OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.86, 可用于扩增基因。扩增并纯化Na_V1.8和Na_V1.4的N端(1~131个氨基酸)、C端(1 598~1 840个氨基酸) 的3个目的基因。3个目的基因片段和线性化载体进行同源重组后, 得到重组质粒Na_V1.8、Na_V1.8-N和Na_V1.8-C。提取重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳分析(图3A)。3种质粒的浓度分别为584.32、624.65和658.95 μg·L^-1。以Na_V1.8-N和Na_V1.8-C与野生型Na_V1.8和Na_V1.4的蛋白序列比对结果显示N端(图3B) 和C端(图3C) 被成功替换, 重组质粒Na_V1.8-N和Na_V1.8-C构建成功, 嵌合体的序列中无发生突变的氨基酸, 翻译后的蛋白长度与理论值保持一致, Na_V1.8、Na_V1.8-N和Na_V1.8-C的氨基酸长度分别是1 956、1 840和1 956 aa。

3　Na_V1.8及其嵌合体的电生理特征检测

制备大鼠来源的Na_V1.4、Na_V1.8、Na_V1.8-N、Na_V1.8-C和Na_Vβ1的cRNA用于显微注射。转录后纯化得到的cRNA经1%琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计测定, 浓度均大于0.9 mg·mL^-1, OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.95~2.05之间, 可用于非洲爪蟾卵母细胞的显微注射。

注射后, 在培养的2~5天内, 每天对通道在卵母细胞中的电流表达情况进行检测。其中, Na_Vβ1辅助的Na_V1.8和Na_V1.8-N并不能很好地产生电流, 在多次测定中(n > 50), 即使卵母细胞具有极好的质量, 但仍然仅有4颗注射了等比例Na_Vβ1进行辅助的卵母细胞产生了电流(图4A), 大小为897.16 ± 52.50 nA (n = 4)。Na_V1.8-N并未检测到任何电流, 但Na_V1.8-C可以产生典型的钠电流。注射Na_V1.8-C cRNA的卵母细胞均可检测到电流(图4B), 在翻译初期(第1~3天) 电流较小, 在卵母细胞翻译的第4天达到电流高峰, 达873.26 ± 45.72 nA (n = 8), 在第5天明显衰减至282.99 ± 12.54 nA (n = 8, 图4C)。根据方波阶跃电压刺激程序记录到的Na_V1.8的I-V曲线结果显示(图4D), Na_V1.8从-40 mV开始激活, 在10 mV电压下电流达到峰值。Na_V1.8-C (图4E) 的I-V曲线结果显示, 在-30 mV开始激活, 10 mV的电压刺激下可以达到电流峰值。

4　嵌合体Na_V1.8-C的稳态激活电生理特性及功能验证

本研究检测了Na_V1.8-C和Na_V1.4的稳态激活曲线(图5A) 和I-V曲线(图5B), 根据Boltzmann方程拟合出Vr和V_1/2。拟合结果显示, Na_V1.8-C的激活电压为-50 mV (图5A), Vr为54.15 ± 1.24 mV, V_1/2为9.02 ± 2.31 mV, 在+10 mV达到峰值电流(n = 6)。而作为TTX-S型的Na_V1.4, 激活电压为-70 mV (图5A), Vr为37.09 ± 2.15 mV, V_1/2为-13.51 ± 0.98 mV, 在0 mV即可达到峰值电流(n = 5)。Na_V1.8的Vr为59.1 ± 0.7 mV^[30], V_1/2为6.24 ± 0.68 mV^[31], 嵌合体Na_V1.8-C与其相似。嵌合体Na_V1.8-C与Na_V1.4的Vr和V_1/2存在显著性差异(P < 0.01, Mann-Whitney U检验), 因此电生理特性并未因末端替换产生偏移, 与Na_V1.4仍然具有显著性差异。

使用Na_V1.8特异性阻断剂A-803467分别对Na_V1.8-C和Na_V1.4进行阻断。结果显示, 孵育5 min的10 μmol·L^-1 A-803467, Na_V1.8-C产生的电流被完全阻断(图6A、C), 反应率为2.88% ± 0.58% (n = 11)。Na_V1.4的电流并未被抑制(图6B、C), 反应率为101.24% ± 1.2% (n = 11)。A-803467在Na_V1.8-C的筛选中存在剂量依赖性(图6D), IC₅₀为284.5 nmol·L^-1 (234.1~345.1 nmol·L^-1), HillSlope为-1.06 (-1.25~-0.89)。证明Na_V1.8-C的药理学特性仍然与Na_V1.8一致。VX-548在Na_V1.8-C的筛选中同样存在剂量依赖性(图6E), IC₅₀为14.9 nmol·L^-1 (11.88~18.87 nmol·L^-1), HillSlope为-0.93 (-1.14~-0.77), IC₅₀与Osteen等^[32]报道的56 nmol·L^-1 (36~93 nmol·L^-1) 近似, 验证了嵌合体Na_V1.8-C在药物筛选中的普适性。

讨论

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电压门控钠离子通道负责Na⁺在细胞膜上的快速跨膜转运, 是神经纤维和肌肉细胞等靶细胞动作电位产生与传导的关键因素, 广泛参与神经兴奋性调节、肌肉收缩与心脏节律、疼痛信号传导及细胞极化等重要生理过程。其中, Na_V1.8主要在PNS的感觉神经元中表达, 尤其是DRG和三叉神经节神经元中^[33]。Na_V1.8参与慢性疼痛、神经病理性疼痛和炎性疼痛的信号传导过程, 独特的激活门和失活门特性, 使其能够在去极化条件下支持高频动作电位的传导, 将疼痛信号有效地传输至中枢神经系统^[34]。在疼痛状态下, Na_V1.8的上调会导致感觉神经元的过度兴奋。此外, 炎性介质如前列腺素E₂能够增强Na_V1.8的活性, 使感觉神经元对伤害性刺激的敏感性增加, 从而加剧炎性疼痛的感知^[35]。Na_V1.8的功能获得性基因突变G1662S, 引发小纤维神经病变和神经病理性疼痛^[36]。Na_V1.8主要在外周神经系统中表达, 不参与中枢神经系统的活动, 这一特性使得Na_V1.8抑制剂在避免成瘾、镇静和运动功能障碍等中枢不良反应方面具有独特优势。因此, Na_V1.8成为新型镇痛药物研发的重要靶点, 其抑制剂有望在避免中枢不良反应的同时, 发挥良好的非成瘾性的镇痛作用。

近年来, cryo-EM技术的发展极大地推动了对Na_V1.8复杂结构及其功能机制的深入理解。通过cryo-EM解析的Na_V1.8高分辨率结构揭示了其独特的激活和失活特性, Na_V1.8的激活需要在更偏向去极化的膜电位, 且相比其他亚型具有更慢的失活动力学, 这进一步证实了其在疼痛信号传导中的关键作用^[18]。目前, 已发现多种靶向Na_V1.8的拮抗剂, 如A-803467^[37]、VX-548^[23]和LTGO-33^[38]等, 均显示出对Na_V1.8的高度选择性。结合cryo-EM与AlphaFold等技术, 对Na_V1.8进行结构预测和动态变化模拟, 为靶向药物结合位点的预测及先导化合物的筛选提供了新的策略。此外, 建立体外靶向筛选系统对于验证先导化合物的活性具有重要意义。

TEVC技术能够详细记录单个亚型离子通道的电流变化, 从而揭示其通道特性, 为通道功能研究和活性化合物筛选提供了重要基础。非洲爪蟾卵母细胞因其体积大、蛋白表达高效且内源性离子通道背景低等优点, 被广泛应用于电生理学研究^[39]。基于非洲爪蟾卵母细胞进行高通量药物筛选时, 成本较低, 且同时能够对药物的生物安全性进行评估。如Wallace等^[40]在非洲爪蟾卵母细胞中表达α7 nAChR, 结合电生理学方法筛选出α7 nAChR的激动剂RG3487。HEK293T细胞作为膜片钳研究中广泛使用的细胞系, 易于培养和转染, 能够高效表达外源性离子通道。通过转染hERG基因, HEK293T细胞可以稳定表达人类快速激活K_V, 用于研究药物对hERG通道的作用^[41]。除此之外, CHO、SH-SY5Y、PC12、ND7/23等细胞系和原代培养细胞在膜片钳技术中也有着广泛应用。

非洲爪蟾卵母细胞具有独特的表达系统, 能够高效表达外源VGSCs, 并且其电生理特性稳定, 适合进行长期的电生理记录和药物筛选^[42]。这使卵母细胞模型成为研究VGSCs功能和筛选活性化合物的重要工具。在非洲爪蟾卵母细胞的异源表达系统中, TEVC技术被广泛用于研究VGSCs的激活和失活过程。通过电流-电压关系曲线(I-V) 和激活曲线等, 可以深入了解VGSCs的电压依赖性和离子选择性, 该技术为靶向VGSCs的特异性药物筛选和作用机制研究提供了有力工具。不同类型受体和通道蛋白在不同表达体系中存在不同的难易程度, Na_V1.8在非洲爪蟾卵母细胞中的异源表达仍然存在挑战, 主要原因包括在这类非神经元细胞系中表达水平低或不表达。常用解决此问题的方法包括构建嵌合体和利用分子伴侣辅助表达等。研究表明, 用Na_V1.4、Na_V1.5或Na_V1.7的序列替换Na_V1.8的C末端, 可以提高其在HEK293T细胞中的表达水平^[43]。此外, Na_V1.8的胞内环中存在内质网滞留的相关氨基酸位点, 阻止其在细胞膜上的表达, 通过突变这些位点可以增加其在细胞膜上的表达量^[44]。Na_V1.8的C末端是限制其功能表达的关键因素, 其中异亮氨酸-谷氨酰胺(isoleucine glutamine, IQ) 序列(核心序列为IQ---RG---R) 与钙调蛋白CaM的结合对钠通道产生内向电流至关重要, Na_V1.8 IQ序列上游存在色氨酸(W1849) 而不是精氨酸, 可能会破坏与CaM的结合^[45]。这一发现为提高Na_V1.8的异源表达水平提供了重要的分子基础和策略。本研究采用构建嵌合体的方式解决表达难题, Na_V1.8-N的C末端IQ序列与Na_V1.8保持一致, 但Na_V1.8-C的C末端被替换, 这一结构的差异是Na_V1.8-C顺利在卵母细胞中表达的关键。在检测Na_V1.8的电流时, 本研究对Na_Vβ1和Na_V1.8的注射比例(0∶1、1∶1、5∶1和10∶1) 以及注射体积(5、30、60和100 ng) 进行了正交实验优化, 但仅在1∶1比例下注射30 ng cRNA时检测到了部分电流, 且随着注入量的增加, 卵母细胞的质量明显下降。在检测Na_V1.4的电流时, 非洲爪蟾卵母细胞能够高效合成Na_V1.4, 电流可达数千nA, 且其氨基酸结构不会阻碍蛋白的跨膜运输过程。此外, Na_V1.4在骨骼肌组织中特异性表达, 而Na_V1.8在骨骼肌组织中未见分布, 因此Na_V1.4的结构和功能特性使其成为构建嵌合体的理想选择。

本研究成功构建了Na_V1.8野生型和两种嵌合体(Na_V1.8-N和Na_V1.8-C) 的重组质粒, 并在非洲爪蟾卵母细胞中进行了表达和检测, 其中嵌合体Na_V1.8-C显著提高了电流密度和表达稳定性, A-803467在嵌合体中仍然具有剂量依赖性, VX-548在嵌合体静息态测试的IC₅₀与文献值的近似^[32]也体现了嵌合体在药物筛选中的普适性。嵌合体有效解决了Na_V1.8在非洲爪蟾卵母细胞中难以稳定表达的问题, 为筛选靶向Na_V1.8的活性化合物提供了重要体外筛选工具。

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2025年第60卷第8期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2025-0162

接收时间：2025-02-19
首发时间：2026-09-20
出版时间：2025-08-12

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收稿日期：2025-02-19
修回日期：2025-05-14

基金

作者信息

广西大学医学院, 广西特色生物医药重点实验室, 广西南宁 530004

通讯作者:

朱晓鹏, Tel: 86-771-3949335, E-mail: biozxp@163.com

罗素兰, E-mail: sulan2021@gxu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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