药学学报

酵母微囊封装的纳米乳佐剂增强亚单位疫苗的体液和细胞免疫应答

PDF下载

章婉娴 , 黄婷婷 , 吴昌静 , 张远冬 ^*

药学学报 | 研究论文 2025,60(4): 1019-1028

收起

药学学报 | 研究论文 2025, 60(4): 1019-1028

酵母微囊封装的纳米乳佐剂增强亚单位疫苗的体液和细胞免疫应答

全屏

章婉娴, 黄婷婷, 吴昌静, 张远冬^*

作者信息

遵义医科大学药学院, 贵州遵义 563000

通讯作者:

张远冬, Tel: 86-851-28200264, E-mail: yuandong@zmu.edu.cn

MF59 and subunit vaccine encapsulated in yeast microcapsules with enhanced humoral and cellular immune responses

Wan-xian ZHANG, Ting-ting HUANG, Chang-jing WU, Yuan-dong ZHANG^*

Affiliations

School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China

出版时间: 2025-04-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-1090

文章导航

摘要

收起

利用酵母衍生的微囊多级装载纳米乳佐剂MF59和抗原, 以解决MF59佐剂不能直接包载抗原以及诱导细胞免疫能力不足的问题。利用强酸碱法制备酵母微囊(yeast microcapsules, YC), 其具有多孔、中空的结构和较好的佐剂效应。将聚合物聚己内酯-聚乙烯亚胺(polycaprolactone-polyethyleneimine, PCL-PEI) 修饰MF59纳米乳获得正电性的乳粒, 通过静电力驱动使乳粒自发沉积到YC中, 并进一步吸附抗原鸡卵清白蛋白(ovalbumin, OVA), 得到共载抗原和佐剂的疫苗YC-MF59-OVA。YC-MF59-OVA基于囊壳上β-葡聚糖可被抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APCs) 识别而内吞, 同时在接种部位募集抗原提呈细胞, 进而有效激活机体免疫响应, 使血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平相比游离OVA升高了2~3倍; 诱导了显著高于OVA的IFN-γ⁺CD8⁺、IL-4⁺CD4⁺ T细胞免疫应答, 刺激脾组织中记忆性CD44⁺CD62L⁺ T细胞比例显著升高。本动物实验方案经遵义医科大学实验动物伦理委员会审核批准(批准号: ZMU21-2407-169)。研究结果表明, YC-MF59-OVA能够激活强效的体液免疫应答和细胞免疫应答, 证实YC能够显著弥补纳米乳佐剂的不足, 为后续疫苗递送系统的开发提供新的参考。

关键词

酵母微囊 / 纳米乳 / 免疫佐剂 / 亚单位疫苗 / 细胞免疫应答

Abstract

收起

Yeast-derived microcapsules were employed to co-encapsulate a nano-emulsion adjuvant (MF59) and antigens, effectively addressing the limitations of MF59 adjuvant in direct antigen encapsulation and its capacity to induce cellular immunity. Yeast microcapsules (YCs) were prepared using strong acid and alkali treatments, resulting in a porous and hollow structure with enhanced adjuvant properties. Positively charged polycaprolactone-polyethyleneimine (PCL-PEI) modified MF59 nanoemulsions were produced, which allowed for electrostatic interaction-driven spontaneous deposition into YCs. This modification facilitated the adsorption of the antigen, chicken ovalbumin (OVA), forming the complex YC-MF59-OVA. YC-MF59-OVA was efficiently recognized and endocytosed by antigen-presenting cells (APCs), a process facilitated by the β-glucan present on the capsular shell. Simultaneously, YC-MF59-OVA enabled a sustained release of the antigen and promoted the recruitment of APCs at the site of inoculation, leading to enhanced activation of immune responses in mice. Specifically, YC-MF59-OVA significantly elevated serum levels of IgG, IgG1, and IgG2a antibodies, achieving concentrations that were two to three times higher than those observed in the group treated with free OVA. In addition, the cellular immune response was notably improved, as evidenced by increased frequencies of IFN-γ⁺CD8⁺ and IL-4⁺CD4⁺ T cells compared to the OVA-immunized group. Furthermore, there was a marked increase in the proportion of memory T cells (CD44⁺CD62L⁺) in the splenic tissues of treated animals. The animal experiment protocol was reviewed and approved by Institutional Animal Care and Use Committee of Zunyi Medical University (approval No. ZMU21-2407-169). These findings demonstrate that YC-MF59-OVA can elicit robust humoral and cellular immune responses, confirming that YC can significantly overcome the limitations of traditional nanoemulsion adjuvants. This study provides a promising reference for the development of advanced vaccine delivery systems.

Key words

yeast microcapsule / nanoemulsion / immune adjuvant / subunit vaccine / cellular immune response

引用本文

章婉娴, 黄婷婷, 吴昌静, 张远冬. 酵母微囊封装的纳米乳佐剂增强亚单位疫苗的体液和细胞免疫应答. 药学学报, 2025 , 60 (4) : 1019 -1028 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-1090

Wan-xian ZHANG, Ting-ting HUANG, Chang-jing WU, Yuan-dong ZHANG. MF59 and subunit vaccine encapsulated in yeast microcapsules with enhanced humoral and cellular immune responses[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2025 , 60 (4) : 1019 -1028 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-1090

正文

收起

临床上已被批准使用的纳米乳佐剂有MF59、AS03等, 主要应用于人体的新型流感疫苗。临床研究和追踪证明, 纳米乳佐剂具有较高的安全性和可靠性^[1]。纳米乳佐剂能募集抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APCs), 直接促进APCs对抗原的吞噬作用和胞饮作用并引流至淋巴结, 并使淋巴结生发中心产生长久性免疫保护^[1]。然而, 水包油型纳米乳不易直接装载蛋白、多肽等亚单位抗原; 其次, 纳米乳佐剂通常诱导经典抗体介导的(Th2) 反应, 而对细胞介导的(Th1) 免疫增强效果并不明显, 因此不适合接种各种慢性传染病或癌症疫苗^[2]。到目前为止, 因缺乏能够引发强烈Th1偏向细胞免疫反应的递送平台, 疫苗的开发受到严重限制^[3]。近年来, 研究者通过仿生学原理, 制备了不同类型的细菌样或病毒样颗粒佐剂, 这类佐剂能够模拟病原体的尺寸、表面电荷、形状、成分等物理特性, 通过病原体感染机体的途径实现抗原递送, 增加抗原与免疫细胞的相互作用, 进而激发强效的细胞免疫应答^{[4, 5]}。同时, 颗粒佐剂常常具有核壳复合结构, 能够实现对抗原及佐剂的多级装载。这些信息提示, 颗粒佐剂的优势能够弥补纳米乳佐剂的缺陷。

研究发现, 酵母菌来源的微囊颗粒(yeast microcapsules, YC) 是天然的细胞免疫佐剂。酵母菌经简单的酸碱及有机溶剂处理后即可获得YC, YC具有中空、多孔的结构, 且表面所含β-葡聚糖能与巨噬细胞及树突状细胞(dendritic cell, DC) 上的Dectin-1受体特异性识别而被吞噬, 进而激活APCs的活化和成熟, 促进细胞因子TNF-α、IL-6等分泌, 上述细胞因子既能调节CD4⁺ T细胞分化为Th1和Th17辅助细胞, 又能诱导CD8⁺ T细胞产生毒性T淋巴细胞^[6]。同时, YC中空、多孔的结构可以高效负载大多数药物和微粒^[6]; 此外, YC具有较好的生物相容性、生物降解性、高稳定性、低毒性等特点, 已被FDA批准为安全食品添加剂。因此, YC既是天然的颗粒佐剂, 又是理想的疫苗载体。然而, YC直接包封蛋白抗原效率较差, 同时, 蛋白抗原也容易从YC内泄漏, 因而需要其他组分将抗原锚定在YC内。

本研究将纳米乳佐剂与YC的优势结合, 用于提升亚单位疫苗免疫效力。选用水包油型纳米乳MF59。MF59是临床经典的水包油(O/W) 型乳佐剂, 其由鲨鱼肝油来源的角鲨烯(squalene, 4.3%)、乳化剂Tween-80 (0.5%) 和Span 85 (0.5%) 以及水相组成。MF59具有稳定的纳米乳结构, 粒径范围在160~200 nm^[7]。将两亲性聚合物聚己内酯-聚乙烯亚胺(polycaprolactone-polyethyleneimine, PCL-PEI) 的疏水端PCL插入到MF59油相中, 亲水的PEI链端则分布在乳粒外层, PEI带强正电荷, 形成阳离子纳米乳(cationic MF59, CMF59); 利用YC中空、多孔的结构先包载CMF59, 再通过乳粒表面的正电荷吸附负电的蛋白抗原, 从而得到一个内部载有纳米乳佐剂和抗原, 外部有β-葡聚糖外壳的乳液/颗粒复合型疫苗递送系统。这种具有壳核结构的颗粒, 可以完成抗原和纳米乳佐剂的多级装载; 同时, 其外壳具有β-葡聚糖, 能靶向APCs而被识别; 该体系兼具纳米乳佐剂和颗粒佐剂的优势, 具有引发强效的细胞免疫、体液免疫应答的潜力。

材料与方法

收起

材料食用酵母(yeast, 加拿大Fleischmann′s^Ⓡ公司); 聚乙烯亚胺2000 (PEI 2K)、ε-己内酯、鸡卵清白蛋白(OVA, 纯度 > 98%)、异硫氰酸荧光素、制霉菌素(Nys)、聚赖氨酸(PLL)、硫酸葡聚糖(DS)、阿米洛利(Ami)、氯丙嗪(Chlo)、昆布多糖(Lam)、角鲨烯、FITC (德国Sigma公司); BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher公司); RMPI-1640培养基、胎牛血清(FBS, 美国Hyclone公司); 羊抗小鼠二抗IgG-HRP、IgG1-HRP、IgG2a-HRP (美国Abcam公司); anti-CD4-APC-Cy7、anti-CD8a-FITC、anti-IL-4-PE、anti-IFN-γ-APC、anti-CD11c-V450、anti-Alexa-Fluor-F4/80、anti-Ly-6G、anti-CD4-FITC、anti-CD44-PE、anti-CD62L-APC、细胞内因子染色试剂盒(含有蛋白转运抑制剂Brefeldin A、IC固定液、细胞打孔液等) (美国eBiosciecne公司); Span 85 (中国Aladdin公司); Tween-80 (中国Macklin公司); 细胞计数试剂盒-8 (CCK-8, 中国Biosharp公司); 牛血清白蛋白(德国Biofroxx公司); PBS with Tween-20 (中国Adamas公司); Cy5 (北京Bioss公司)。

仪器十万分之一电子分析天平(BP211D, 德国Sartorius公司); 磁力加热搅拌器(中国杭州仪表电机厂); 优普超纯水仪(UPH-II-10T, 中国成都超纯科技有限公司); Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano ZS90, 英国Malvern公司); 透射电子显微镜(H-600, 日本Hitachi公司); 激光共聚焦显微镜(LSM 800, 德国Carl Zesis公司); 流式细胞仪(BD FACSCelesta, 美国BD Bioscience公司)。全波长多功能微孔板检测仪(SPARK 10M, 瑞士Tecan公司); 小动物活体成像仪(IVIS Lumina, 德国PerkinElmer公司); 涡旋振荡器(UVS-2, 北京优晟公司)。

YC的制备 称取25.0 g酵母颗粒, 倒入圆底烧瓶, 分多次加入1 mol·L^-1 NaOH溶液250 mL, 80 ℃恒温油浴搅拌1 h, 搅拌至酵母溶液逐渐变黄。随后以6 000 r·min^-1离心10 min, 将沉淀物转移至圆底烧瓶中, 加超纯水分散, 用浓盐酸调pH至4.5, 于55 ℃油浴中搅拌1 h, 以6 000 r·min^-1离心10 min收集沉淀, 随后依次用超纯水、异丙醇、丙酮清洗, 室温晾干, 得到YC, 置于密封玻璃瓶中保存。

PCL-PEI聚合物的合成 参考文献^[8], 以苯甲醇为引物, 二乙基己酸亚锡为催化剂使ε-己内酯开环, 发生聚合反应生成PCL-OH。以PCL-OH为起始物, 选用低毒的PEI 2K与PCL-OH室温搅拌反应24 h, 然后置于透析袋透析, 除去未反应底物, 冷冻干燥得到PCL-PEI。

纳米乳MF59和YC-MF59-OVA的制备 将0.20 g Span 85溶解在0.50 g角鲨烯中, 将0.20 g Tween-80溶于注射用水中, 混合形成初乳, 初乳经高压均质(876 bar; 15 min) 得到纳米乳, 加超纯水定容至40 mL, 得MF59纳米乳。取PCL-PEI溶解, 配制成1 mg·mL^-1溶液, 按体积比1∶4取PCL-PEI溶液和MF59纳米乳混合, 涡旋1 min (转速2 800 r·min^-1), 加注射用水稀释2倍, 得PCL-PEI修饰的CMF59。向纳米乳溶液中加入YC粉末, 搅拌状态下孵育4 h后, 超滤管(Mw: 30 kDa) 离心收集沉淀, 并用注射用水洗涤3次; 沉淀重新用注射用水分散, 再加入抗原OVA (1 mg·mL^-1), 孵育1 h后, 收集沉淀, 洗涤3次, 即得到共载佐剂和抗原的YC-MF59-OVA (图 1)。

YC-MF59-OVA的表征 透射电子显微镜观察酵母、YC、YC-MF59-OVA的外观形态并测定其粒径; Zeta电位分析仪检测其表面电荷; 用FITC标记OVA后, 制备荧光显色的YC-MF59-OVA, 分别通过激光共聚焦显微镜观察其抗原包载情况, 同时, 采用超滤管(Mw: 100 kDa) 分离YC-MF59-OVA中未包载的抗原, 经荧光分光仪测定其包封率。

抗原的体外释放 同时制备YC-MF59-OVA和对照组YC-PEI 25K-OVA, BCA蛋白试剂盒测定抗原包封率。将制备好的YC-MF59-OVA、YC-PEI 25K-OVA按1∶50的比例加入磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4), 置于37 ℃摇床中, 以100 r·min^-1振摇, 在1、2、3、4、6 h取1 mL释放液, 2 000 r·min^-1离心2 min, 收集上清液, 测定蛋白含量, 考察抗原从YC内释放的情况。

细胞及细胞培养 小鼠树突状细胞系DC 2.4来源于第三军医大学, 使用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素) 培养, 细胞均在温度为37 ℃和5% CO₂的孵箱中培养。细胞处于对数生长期时可用于细胞实验。

细胞毒性 以1×10⁴个/孔接种DC 2.4于96孔细胞培养板中, 培养24 h后, 以正电性的PCL-PEI浓度为指标, 加入不同体积的YC-MF59-OVA溶液, 其中PCL-PEI浓度分别为0、4、8、12、16、20、40、80、120 μg·mL^-1; 各组浓度设5个复孔, 以不加细胞的培养基组为空白对照, 不含药物的细胞组为阴性对照。继续孵育24 h后, 向每孔中加入10 μL CCK-8试剂, 再孵育4 h, 置于全波长多功能微孔板检测仪中, 检测450 nm处的吸光度值。按照公式计算细胞存活率: 细胞存活率(%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%, 其中As为实验组的吸光度值, Ac为阳性对照组的吸光度值, Ab为空白孔的吸光度值。

细胞摄取 FITC标记OVA并制备YC-MF59-OVA, 取荧光标记的游离OVA和YC-MF59-OVA, 蛋白含量均为10 µg。在无血清无抗生素培养基中与DC 2.4共孵育2 h, 随后收集细胞, 离心洗涤后流式测定细胞摄取阳性率。同时在共聚焦小皿中培养DC 2.4, 并与荧光标记OVA和YC-MF59-OVA共培养3 h, 将细胞用4%多聚甲醛固定后, 使用4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 对细胞核进行染色, 并置于共聚焦显微镜下观察YC-MF59-OVA被摄取的情况。

细胞摄取机制 DC 2.4以1×10⁵个/孔接种于细胞培养板, 待细胞贴壁后, 加入1640培养基稀释的Nys (250 μg·mL^-1)、PLL (200 μg·mL^-1)、DS (100 μg·mL^-1)、Ami (26 μg·mL^-1)、Chlo (70 μg·mL^-1)、Lam (40 μg·mL^-1), 37 ℃孵育1 h; 同时考察能量抑制组, 将细胞放入4 ℃冰箱孵育1 h。随后吸出含抑制剂培养基和低温培养基, 加入含等量荧光标记的YC-MF59-OVA培养基, 各组细胞置于37 ℃孵育2 h后收集细胞, 进行流式细胞仪检测。

抗原滞留时间 Cy5标记OVA后制备荧光标记的YC-MF59-OVA, 注射到小鼠大腿内侧皮下, 同时对照组注射游离Cy5-OVA和MF59与Cy5-OVA的混合液MF59+Cy5-OVA, 于注射后1、12、24、36 h置于小动物活体成像仪中, 观察注射部位荧光强度的变化, 考察抗原滞留时间。

注射部位免疫细胞的募集 制备游离OVA、MF59+OVA混合液、YC-MF59-OVA, 皮下注射后分别于第1、3天取注射部位组织, PBS洗净, 剪碎, 加入含胶原酶VIII (250 U·mL^-1) 和DNA酶I (2 mg·mL^-1) 的无血清RPMI 1640培养基, 37 ℃下孵育60 min后, 将组织置于40 μm细胞筛网研磨, 收集细胞, 2 000 r·min^-1下离心5 min, PBS洗涤3次后加入抗小鼠anti-CD11c-V450、anti-Alexa-Fluor-F4/80、anti-Ly-6G染色40 min, 进行流式细胞仪检测, 考察注射部位APCs的募集。

动物和免疫实验 实验小鼠为6~8周龄Balb/C小鼠, 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供, 所有动物实验均按《遵义医科大学动物实验中心管理办法》和《遵义医科大学动物实验伦理审评》(ZMU21-2407-169) 执行。将小鼠随机分配为4组, 每组小鼠5只。于小鼠脚掌肌内注射免疫, 实验组分别给予游离OVA溶液、MF59+OVA混合液、YC-MF59-OVA溶液。抗原OVA剂量均为10 μg, 空白对照组不给予任何处理。初次免疫记作第0天, 此后于第7天加强免疫1次。于第14、21、28、35天眼眶静脉取血, 于6 000 r·min^-1下离心5 min, 吸取上清液收集血清样品检测。

抗体检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA) 测定血清中的抗原特异性IgG及亚型IgG1、IgG2a抗体水平。血清用含1%牛血清白蛋白和0.05% Tween-20的PBS溶液稀释10⁴倍, 羊抗小鼠二抗IgG、IgG1或IgG2a均稀释10³倍后进行测定。

细胞内因子检测 小鼠免疫第37天断颈处死, 取出脾脏, 在无菌条件下制备脾单细胞悬液, 用RPMI 1640完全培养基稀释, 以1×10⁷~5×10⁷个/孔加入细胞培养板中, 与100 μg·mL^-1 OVA共孵育1 h, 然后加入转运抑制剂brefeldin A。Brefeldin A抑制胞内高尔基体转运作用, 阻断胞内细胞因子转运到胞外。继续孵育5 h, 收集细胞。将细胞重悬于抗体染色缓冲液中, 加入anti-CD4-APC-Cy7、anti-CD8a-FITC混匀, 4 ℃避光染色40 min后洗涤2次, 对细胞进行固定、打孔后, 离心洗涤, 进行细胞内因子染色, 分别加入含anti-IL-4-PE或anti-IFN-γ-APC抗体的打孔液, 避光染色20 min, 再加入打孔液洗涤离心后重悬于PBS中, 流式细胞仪检测。

记忆性T细胞检测 小鼠免疫后第37天处死, 取脾制备单细胞悬液, 细胞计数后, RPMI 1640完全培养基稀释, 按1×10⁷个/孔细胞接种到细胞培养板中。每孔加入100 μg·mL^-1 OVA, 置于37 ℃二氧化碳培养箱中孵育72 h。收集细胞, 重悬于抗体染色缓冲液中, 加入anti-CD4-FITC、anti-CD44-PE和anti-CD62L-APC, 4 ℃避光染色40 min, 离心洗涤2遍, 重悬于PBS中, 流式细胞仪检测。

数据分析 本研究使用GraphPad Prism 9.0对数据进行统计分析, 结果以平均值±标准差(x ± s) 表示, 采用one-way ANOVA分析各组数据间的差异, P < 0.05表示各组数据间的差异具有统计学意义。

结果与讨论

收起

1 YC-MF59-OVA的表征

酵母菌具有细胞壁、细胞膜结构, 胞内有多种细胞器, 含有蛋白质、脂质、核酸等。细胞壁主要由葡聚糖、蛋白质、脂类、几丁质等组成。透射电镜显示, 未处理的酵母菌含有大量内容物, 呈现为具有灰色外壁和黑色实心的颗粒(图 2A)。细胞壁主要成分为β-葡聚糖, 其通过β-1, 3和β-1, 6糖苷键连接, 维持细胞壁网络骨架刚性结构并能够耐受酸碱。因此, 采用酸碱法处理酵母菌后, 能够大量去除胞内及细胞壁上的蛋白质、脂类, 形成多孔、中空的YC (图 2B)。

两嵌段聚合物PCL-PEI中, PCL为疏水端, PEI为亲水端; MF59为O/W型乳剂。PCL-PEI与MF59乳剂混合涡旋时, 在外力作用下, PCL-PEI上疏水端PCL插入乳剂内部油相, 亲水端PEI则朝向外部, 分布在乳滴表面, 得到强正电性的CMF59。考察MF59和CMF59的粒径和电位, 结果显示, MF59粒径为164.2 ± 1.8 nm, 表面电荷-24.3 ± 0.71 mV; PCL-PEI修饰后的CMF59粒径减小, 约151.6 ± 7.4 nm, 表面电荷翻转为+37.7 ± 1.20 mV, MF59和CMF59粒径分布均一, 均无明显聚集。如图 2所示, 正电性的CMF59与YC共孵育时, YC细胞内壁含有糖链, 呈电负性, 在电荷吸附及渗透压作用下, CMF59进入YC内, 此时, YC内部电荷翻转为正电(图 2E、F), 能够有效吸附OVA进入微囊内。透射电镜显示, YC包载了MF59和OVA后, 中空透明的微囊内部重新填充了黑色内容物(图 2C)。制备荧光标记的YC-MF59-(FITC-OVA), 共聚焦显微镜显示, YC-MF59-(FITC-OVA)呈现明显的壳核结构, 内部显示较强的绿色荧光, 同时微粒之间无聚集(图 2D), 表明YC-MF59-OVA制备成功。电镜测定YC-MF59-OVA横径约为4 µm, 竖径约为5~6 µm; 表面电荷为+7.85 ± 0.32 mV。

2 YC-MF59-OVA的包封率及体外释放

收起

考察不同浓度的YC对抗原的包封率, 结果显示, YC浓度小于3 mg·mL^-1时, 对OVA的包封率随YC浓度增加而升高, 其浓度达到3 mg·mL^-1及以上, 对抗原的包载达到饱和, 包封率均在90%以上(图 3A), 表明YC对OVA的包载效率较好。YC-MF59-OVA的体外释放行为结果表明, YC-MF59-OVA中抗原的释放行为与对照组YC-PEI 25K-OVA一致, 均在前2 h有释放, 累计释放百分率约为15%, 随后匀速缓慢释放抗原(图 3B)。表明静电吸附的OVA能够较稳定地包载于YC内, 因而, YC-MF59-OVA能完整地被APCs摄取, 避免了在抗原提呈及免疫激活中抗原与佐剂的分离, 从而保证了更好的疫苗免疫诱导潜力。PEI 25K具有极强的正电性, 研究证实其基于电荷吸附能够有效进入中空的YC内, 并高效吸附蛋白或小分子药物, 实现YC对药物的包载^[9]。但PEI 25K较强的正电性会导致细胞损伤及机体毒副作用, 在药物递送中受到限制。本研究将低毒的PCL-PEI 2K修饰MF59, 获得的阳离子纳米乳具有与PEI 25K同等的锚定作用, 其既介导YC对抗原的高效包载, 实现抗原的缓慢释放, 同时也降低疫苗载体的毒副作用。

3 YC-MF59-OVA的细胞毒性及细胞摄取

收起

如图 3C所示, YC-MF59-OVA中PCL-PEI浓度在0~20 µg·mL^-1内细胞存活率均在95%以上, 当浓度高于80 µg·mL^-1时, 细胞存活率降低至80%以下, 提示PCL-PEI在高浓度时仍然具有明显细胞毒性。后续实验使用的YC-MF59-OVA所含PCL-PEI浓度为10 µg·mL^-1, 能够避免PCL-PEI的毒副作用。图 3D显示, 相对游离OVA, YC-MF59-OVA在APCs上的摄取效率均显著升高, RAW 264.7细胞上YC-MF59-OVA组荧光强度是OVA组的4.2倍, 而DC 2.4细胞上, YC-MF59-OVA组荧光强度则是游离OVA组的43倍。共聚焦显微镜观察表明, YC-MF59-OVA大量以完整的微囊颗粒被DC 2.4细胞吞噬, 而仅有少量的游离OVA被摄取(图 3F)。细胞摄取抑制实验显示, YC-MF59-OVA的细胞吞噬效率受到硫酸葡聚糖、氯丙嗪和昆布多糖的抑制(图 3E)。硫酸葡聚糖为清道夫受体A抑制剂, 氯丙嗪抑制网格蛋白摄取通路^[10], 昆布多糖是Dectin-1的典型配体^[11]。因此, YC-MF59-OVA在APCs上的摄取由清道夫受体、网格蛋白、Dectin-1受体介导, 同时具有能量依赖的特征。YC细胞壁的主要成分是β-葡聚糖, 是吞噬细胞C型凝集素受体Dectin-1特异性识别的配体^[12]。当昆布多糖优先占据APCs表面的Dectin-1受体时, YC-MF59-OVA摄取效率受到明显限制。低分子量的β-葡聚糖易与Dectin-1结合, 随后通过SYK/CARD9激活核因子κB (NF-κB) 和促炎基因表达, 激活免疫响应^[13]。但完整真菌颗粒上较大的β-葡聚糖链被识别后, 驱动表面Dectin-1受体的定位并形成“吞噬突触”, 随后才被吞入胞内发挥作用, 该过程受到多种因素影响^[14]。DC细胞上的树突可能更有利于YC-MF59-OVA的吞噬, 这可能是YC-MF59-OVA在DC 2.4和RAW264.7上摄取效率不同的原因。

4 抗原滞留时间及免疫细胞募集能力

收起

接种位置抗原的释放行为在诱导免疫力中起着至关重要的作用^[15], 注射部位抗原的持续刺激已被证明可以增强和延长疫苗免疫力^[16]。通过活体成像(图 4A), 结果表明, 游离的OVA和MF59+OVA混合物注射到皮下后, 24 h荧光降低约80%, 36 h时荧光完全消失; 而YC-MF59-OVA滞留时间显著较长, 给药36 h时仍有约40%的荧光存在(图 4B)。表明酵母微囊一定程度上具有抗原贮库的作用, 支持注射部位抗原的持久刺激。此外, YC-MF59-OVA免疫3天后能够显著促进注射部位APCs, 包括巨噬细胞、DC、中性粒细胞增多(图 4C~E), 且效果明显优于单独的抗原。而MF59+OVA组仅仅使注射部位中性粒细胞升高(图 4E)。以往研究已证实, MF59皮下注射后, 会激活并促进APCs产生趋化因子, 如趋化因子配体2 (C-C motif chemokine ligand, CCL2) 以及CCL4、CCL5等, 进而将单核细胞募集到注射部位, 这些细胞进一步迁移到引流淋巴结以激活B细胞和T细胞^[17]。而将酵母微囊与MF59结合后, 形成的联合佐剂不仅对单核细胞实现了大量募集, 而且增加对巨噬细胞和DCs的招募。因此, 构建的YC-MF59-OVA疫苗相对MF59来说具有更好的佐剂作用。

5 体液免疫应答能力

收起

通过对小鼠进行2次加强免疫后, 测定第14天至35天血清中的抗体水平(图 5A), 结果显示, 小鼠皮下接种YC-MF59-OVA后, 血清IgG、IgG1、IgG2a抗体水平均显著高于MF59+OVA和OVA组(P < 0.01, P < 0.001, P < 0.000 1, 图 5B)。YC-MF59-OVA组血清抗体水平从14天升高, 在28天血清IgG、IgG1、IgG2a抗体水平相比MF59+OVA和OVA组升高了2~3倍(图 5C~E)。而MF59+OVA皮下免疫后, 抗体水平只在28天后与OVA组具有显著差异(P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001)。计算IgG2a/IgG1的比值, MF59+OVA与OVA组比值接近, 在0.6左右; 而YC-MF59-OVA组IgG2a/IgG1的比值更接近于1 (图 5F)。由此可见, MF59诱导的主要是体液免疫反应, Th2通路占主导地位, 这与先前使用MF59的疫苗制剂研究结果一致^{[18, 19]}。而YC-MF59-OVA接种后, 酵母微囊通过与APCs表面Dectin-1之间的相互作用, 激活“吞噬突触”机制, 发生吞噬、氧化暴发等过程, 最终激活NF-κB和促炎细胞因子分泌, 从而产生偏向于Th1先天性和适应性的细胞免疫应答^[20]。总之, 将MF59与抗原封装到酵母微囊后, 能够补充MF59佐剂在Th1免疫应答方面的不足, 能够有效增强其细胞免疫应答的能力。

6 细胞免疫应答能力

收起

疫苗诱导CD4和CD8阳性T细胞分泌的细胞因子IFN-γ及IL-4对病原体的消除至关重要。通过细胞内因子染色实验检测YC-MF59-OVA诱导机体细胞免疫应答的能力。在免疫第28天收获接种疫苗小鼠的脾脏, 获得单细胞悬液。加入抗原OVA刺激。经细胞因子荧光染色后流式检测, 结果显示, YC-MF59-OVA显著增强了CD4⁺和CD8⁺ T细胞免疫响应, 诱导的IL-4⁺CD4⁺ T细胞百分比几乎高出OVA组两倍, 比MF59+OVA组高出1倍(图 6A、B)。同样, 诱导的IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞百分比仍然显著高于MF59+OVA和OVA (图 6C、D)。这些结果表明, YC-MF59-OVA在体内引发了有效的抗原特异性T细胞反应。虽然MF59+OVA在诱导IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞百分比上相对于OVA组没有差异, 但诱导的IL-4⁺CD4⁺ T细胞百分比明显高于OVA组。Th2细胞将IL-4递送到B细胞可以增强其IgG1抗体的产生。IFN-γ与抗原特异性IgG2a水平的增加有关, 高水平的IL-4通常与Th2反应相关, 而高水平的IFN-γ被认为反映了Th1反应^[21]。上述结果再次表明, MF59佐剂能够促进抗原激活Th2型免疫响应, 而在诱导Th1型免疫应答上效力不足, 而与酵母微囊结合能够明显提升Th1型免疫响应。对病原体再感染的抵抗力归因于宿主体内记忆T细胞的生成^[22]。因此, 进一步检测脾脏中记忆T细胞和效应T细胞比例。结果显示, 初始T细胞表达CD62L⁺CD44^-表型无明显差异(图 6E、F), YC-MF59-OVA免疫组脾脏中记忆性T细胞(CD44⁺CD62L⁺) 比例升高(3.91%), 明显高于OVA免疫组(2.14%) (图 6G), 表明疫苗成功接种并产生了记忆。此外, YC-MF59-OVA免疫组效应记忆T细胞(CD44⁺CD62L^-) 也表达显著上调(8.77%), 而MF59+OVA免疫组(5.29%) 和OVA免疫组(4.98%) 没有明显增加, 且两组之间无显著差异(图 6H)。

结论

收起

现有的纳米乳佐剂引起的细胞免疫应答效应弱, 使疫苗免疫作用局限于预防性免疫保护, 而无法满足治疗性疫苗的发展要求; 而基于纳米技术和高分子聚合物的颗粒佐剂虽能引起细胞免疫反应, 但通常其制备工艺复杂、效果有限且存在生物相容性较差的问题。本研究针对以上问题, 将纳米乳佐剂MF59与酵母微囊结合, 构建了一种兼具乳液佐剂和颗粒佐剂优势, 并具有壳核结构的疫苗递送系统, 从而实现佐剂/抗原的共载和协同递送, 并在疫苗接种后能够激活强效的体液免疫应答和细胞免疫应答, 证实酵母微囊能够显著弥补纳米乳佐剂MF59的不足。本研究结果为疫苗免疫佐剂和递送系统的开发提供新的参考。

基金

收起

国家自然科学基金资助项目(82160678)
国家自然科学基金资助项目(82003686)
中国博士后科学基金(2019M650249)
中国博士后科学基金(2020T130088ZX)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

O′Hagan DT, van der Most R, Lodaya RN, et al. Author correction: "World in motion"-emulsion adjuvants rising to meet the pandemic challenges [J]. NPJ Vaccines, 2021, 6: 158.

Song SY, Qiao M, Yang J, et al. Dual-functional emulsifier based nano-emulsion adjuvant effectively enhanced immunogenicity of recombinant respiratory syncytial virus vaccine in mice [J]. J Drug Deliv Sci Tec, 2024, 100: 106098.

Zhao Q, Chen FM, Lai Y, et al. Advances of metal nanoadjuvant for cancer immunotherapy [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2023, 58: 2311-2319.

Xia YF, Wu J, Wei W, et al. Exploiting the pliability and lateral mobility of Pickering emulsion for enhanced vaccination [J]. Nat Mater, 2018, 17: 187-197.

Yang Y, Wang HY, Sun Y, et al. Advances in the study of nano-biomimetic tumor vaccines [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2022, 57: 963-975.

Sabu C, Mufeedha P, Pramod K. Yeast-inspired drug delivery: biotechnology meets bioengineering and synthetic biology [J]. Expert Opin Drug Deliv, 2019, 16: 27-41.

Ko EJ, Kang SM. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines [J]. Hum Vaccin Immunother, 2018, 14: 3041-3045.

Davoodi P, Srinivasan MP, Wang CH, et al. Synthesis of intracellular reduction-sensitive amphiphilic polyethyleneimine and poly (ε-caprolactone) graft copolymer for on-demand release of doxorubicin and p53 plasmid DNA [J]. Acta Biomater, 2016, 39: 79-93.

Zhang XJ, Xu XQ, Chen YD, et al. Bioinspired yeast microcapsules loaded with self-assembled nanotherapies for targeted treatment of cardiovascular disease [J]. Mater Today, 2017, 6: 301-313.

Chen ZJ, Hao XY, Wang HR. Smart combination of aluminum hydroxide and MF59 to induce strong cellular immune responses [J]. J Control Release, 2022, 349: 699-711.

Xie JH, Guo L, Ruan YY. Laminarin-mediated targeting to Dectin-1 enhances antigen-specific immune responses [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 391: 958-962.

Wang JQ, Jin XM, Yan SH. Yeast β-glucan promotes antiviral type I interferon response via dectin-1 [J]. Vet Microbiol, 2024, 295: 110107.

Horneck Johnston CJH, Ledwith AE, Lundahl MLE, et al. Recognition of yeast β-glucan particles triggers immunometabolic signaling required for trained immunity [J]. iScience, 2024, 3: 109030.

Hino S, Kito A, Yokoshima R, et al. Discharge of solubilized and Dectin-1-reactive β-glucan from macrophage cells phagocytizing insoluble β-glucan particles: involvement of reactive oxygen species (ROS)-driven degradation [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 421: 329-334.

Roth GA, Picece VCTM, Ou BS, et al. Designing spatial and temporal control of vaccine responses [J]. Nat Rev Mater, 2022, 7: 174-195.

Chen J, Wang B, Caserto JS, et al. Sustained delivery of SARS-CoV-2 RBD subunit vaccine using a high affinity injectable hydrogel scaffold [J]. Adv Healthc Mater, 2022, 11: e2101714.

Pulendran B, S Arunachalam P, O′Hagan DT. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants [J]. Nat Rev Drug Discov, 2021, 20: 454-475.

Dudziak D, Kamphorst AO, Heidkamp GF, et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo [J]. Science, 2007, 315: 107-111.

Nouri A, Laraba-Djebari F. Enhancement of long-lasting immunoprotective effect against Androctonus australis hector envenomation using safe antigens: comparative role of MF59 and Alum adjuvants [J]. Vaccine, 2015, 43: 5756-5763.

He LY, Zhu ZC, Qi CJ. β-Glucan-a promising immunocyte-targeting drug delivery vehicle: superiority, applications and future prospects [J]. Carbohydr Polym, 2024, 339: 122252.

Nazeri S, Zakeri S, Mehrizi AA, et al. Measuring of IgG2c isotype instead of IgG2a in immunized C57BL/6 mice with Plasmodium vivax TRAP as a subunit vaccine candidate in order to correct interpretation of Th1 versus Th2 immune response [J]. Exp Parasitol, 2020, 216: 107944.

Islamuddin M, Chouhan G, Farooque A, et al. Th1-biased immunomodulation and therapeutic potential of Artemisia annua in murine visceral leishmaniasis [J]. PLoS Negl Trop Dis, 2015, 9: e3321.

2025年第60卷第4期

PDF下载

247

107

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-1090

接收时间：2024-11-05
首发时间：2025-10-29
出版时间：2025-04-12

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2024-11-05
修回日期：2024-12-20

基金

国家自然科学基金资助项目(82160678)

国家自然科学基金资助项目(82003686)

中国博士后科学基金(2019M650249)

中国博士后科学基金(2020T130088ZX)

作者信息

遵义医科大学药学院, 贵州遵义 563000

通讯作者:

张远冬, Tel: 86-851-28200264, E-mail: yuandong@zmu.edu.cn

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2024-1090

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT